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Biology

Coleta de tecidos e extração de RNA da articulação do joelho osteoartrítica humana

Published: July 22, 2021 doi: 10.3791/62718
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Bone and Joint Center, Henry Ford Health System, 2Department of Orthopedic Surgery, Henry Ford Health System, 3Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University

Summary

Os tecidos primários obtidos de pacientes após a artroplastia total do joelho fornecem um modelo experimental para a pesquisa da osteoartrite com tradução clínica máxima. Este protocolo descreve como identificar, processar e isolar o RNA de sete tecidos únicos do joelho para apoiar a investigação mecanicista na osteoartrite humana.

Abstract

A osteoartrite (OA) é uma doença articular crônica e degenerativa que mais frequentemente afeta o joelho. Como atualmente não há cura, a artroplastia total do joelho (TKA) é uma intervenção cirúrgica comum. Experimentos com tecidos OA humanos primários obtidos da TKA fornecem a capacidade de investigar mecanismos de doença ex vivo. Embora o OA tenha sido pensado anteriormente para impactar principalmente a cartilagem, agora é conhecido por impactar múltiplos tecidos na articulação. Este protocolo descreve a seleção do paciente, processamento de amostras, homogeneização de tecidos, extração de RNA e controle de qualidade (com base na pureza, integridade e rendimento do RNA) de cada um dos sete tecidos únicos para apoiar a investigação do mecanismo da doença na articulação do joelho. Com consentimento informado, foram obtidas amostras de pacientes submetidos à TKA para OA. Os tecidos foram dissecados, lavados e armazenados dentro de 4h de cirurgia por congelamento de flash para fixação de RNA ou formalina para histologia. Os tecidos coletados incluíam cartilagem articular, osso subcondral, menisco, almofada de gordura infrapator, ligamento cruzado anterior, sinodio e músculo oblíquo vasto medialis. Os protocolos de extração de RNA foram testados para cada tipo de tecido. A modificação mais significativa envolveu o método de desintegração usado para tecidos duros de baixa célula, alta matriz (considerados como cartilagem, osso e menisco) versus células relativamente altas, baixa matriz, tecidos moles (considerados como almofada de gordura, ligamento, sinodio e músculo). Verificou-se que a pulverização era adequada para tecidos duros, e a homogeneização era apropriada para tecidos moles. Observou-se uma propensão para alguns sujeitos de produzir valores de número de integridade de RNA (RIN) mais elevados do que outros sujeitos consistentemente em múltiplos tecidos, sugerindo que fatores subjacentes, como a gravidade da doença, podem impactar a qualidade do RNA. A capacidade de isolar o RNA de alta qualidade dos tecidos OA humanos primários fornece um modelo fisiologicamente relevante para experimentos sofisticados de expressão genética, incluindo sequenciamento, que podem levar a insights clínicos que são mais facilmente traduzidos para os pacientes.

Introduction

O joelho é a maior articulação sinovial do corpo humano, compreendendo a articulação tibiofemoral entre a tíbia e o fêmur e a articulação patelar entre a patela e o fêmur1. Os ossos do joelho são forrados com cartilagem articular e apoiados por vários tecidos conjuntivos, incluindo menisco, gordura, ligamentos e músculo, e uma membrana sinovial encapsula toda a articulação para criar uma cavidade sintetizada cheia defluidos 1,2,3 (Figura 1). Um joelho saudável funciona como uma articulação de dobradiça móvel que permite movimento sem atrito no plano frontal1,3. Em condições patológicas, o movimento pode se tornar restrito e doloroso. A doença degenerativa mais comum nas articulações do joelho é a osteoartrite (AA)4. Sabe-se que uma variedade de fatores de risco predispõem ao desenvolvimento de OA, incluindo idade mais avançada, obesidade, sexo feminino, trauma articular e genética, entre outros5,6. Atualmente, estima-se que existam 14 milhões de pessoas nos EUA com OA sintomático do joelho, com a prevalência aumentando devido ao aumento da idade populacional e às taxas de obesidade7,8. Inicialmente considerada uma doença da cartilagem, a OA agora é entendida como uma doença de toda a articulação9. As alterações patológicas comumente observadas na OA incluem erosão articular da cartilagem, formação de osteofitas, espessamento ósseo subcondral e inflamação do sinolário9,10. Como não há cura conhecida para OA, os tratamentos focam principalmente no tratamento de sintomas (por exemplo, dor)11,12, e uma vez que o OA progrediu para o estágio final, a cirurgia de substituição articular é frequentemente indicada13.

As cirurgias de substituição articular podem ser substituições parciais ou totais do joelho, com artroplastia total do joelho (TKA), incluindo a substituição de toda a articulação tibiofemoral e a articulação patelar. A partir de 2020, aproximadamente 1 milhão de TKAs são realizados nos EUA a cada ano14. Durante a TKA, um cirurgião ortopédico resseca a porção superior do platô tibial e os condyles femorais inferiores(Figura 2A, 2B) a serem equipados com implantes protéticos. Às vezes mal interpretado pelos pacientes, em um TKA, apenas 8-10 mm é ressecado a partir da extremidade de cada osso, que é posteriormente tampado ou ressurgido, com metal. Um forro de polietileno interposto forma a superfície de rolamento (ou seja, estofamento) entre os dois implantes metálicos. Além disso, vários componentes de tecido mole da articulação são total ou parcialmente extirpados para alcançar o equilíbrio articular adequado. Entre esses tecidos estão o menisco medial e lateral(Figura 2C),bloco de gordura infrapator(Figura 2D),ligamento cruzado anterior (LCA; Figura 2E), sinovia(Figura 2F), e vasto músculo oblíquo de vastus medialis (VMO; Figura 2G) 15. Embora os TKAs sejam geralmente bem sucedidos para o tratamento de OA, cerca de 20% dos pacientes relatam recorrência de dor pós-cirurgia16. Juntamente com o alto custo e a invasividade relativa do procedimento, essas limitações apontam para a necessidade de novas pesquisas para identificar tratamentos alternativos para mitigar a progressão da OA.

Para explorar mecanismos de doenças em OA que possam apresentar novos caminhos para a intervenção terapêutica, podem ser utilizados sistemas experimentais, incluindo células, explantas teciduais e modelos animais. As células são tipicamente cultivadas em monocamadas e são derivadas de tecidos humanos ou animais primários (por exemplo, condrócitos isolados da cartilagem) ou células imortalizadas (por exemplo, ATDC517 e CHON-00118). Embora as células possam ser úteis para manipular variáveis experimentais em um ambiente de cultura controlada, elas não capturam condições da articulação natural que são conhecidas por impactar fenótiposcelulares 19. Para recapitular melhor a complexa cascata de comunicação química, mecânica e célula-celular subjacente OA, uma alternativa é encontrada em amostras primárias de tecido humano ou animal, sejam elas usadas como explants frescas ou cultivadas, para preservar a estrutura tecidual e o microambientecelular 20. Para estudar a articulação in vivo,pequenos (por exemplo, mouse21) e grandes (por exemplo, cavalo22) modelos animais para OA (por exemplo, por indução cirúrgica, alteração genética ou envelhecimento) também são úteis. No entanto, a tradução desses modelos para a doença humana pode ser limitada por diferenças anatômicas, fisiológicas e metabólicas, entre outras23. Considerando as vantagens e desvantagens dos sistemas experimentais, os principais pontos fortes de serem específicos das espécies e manter o nicho extracelular oferecido pelos tecidos OA humanos primários maximizam o potencial translacional dos achados da pesquisa.

Tecidos OA humanos primários podem ser facilmente obtidos após a TKA, tornando a alta frequência de TKAs um recurso valioso para a pesquisa. Entre as aplicações experimentais potenciais estão expressão genética e análises histológicas. Para perceber o potencial dos tecidos OA humanos primários para essas abordagens de pesquisa e outros, delineados são as seguintes considerações-chave. Em primeiro lugar, o uso de amostras de pacientes está sujeito a regulação ética, e os protocolos devem atender às aprovações do Conselho de Revisão Institucional (IRB)24. Em segundo lugar, a heterogeneidade inerente aos tecidos primários doentes humanos e a influência de variáveis como idade e sexo, entre outras, criam a necessidade de seleção cuidadosa do paciente (ou seja, aplicação de critérios de elegibilidade) e interpretação dos dados. Em terceiro lugar, as propriedades biológicas únicas de diferentes tecidos na articulação (por exemplo, baixa celularidade da cartilagem e menisco25) podem apresentar desafios durante os experimentos (por exemplo, isolando alta qualidade e quantidade de RNA). Este relatório aborda essas considerações e apresenta um protocolo para seleção de pacientes, processamento de amostras, homogeneização de tecidos, extração de RNA e controle de qualidade (ou seja, avaliação da pureza e integridade do RNA; Figura 3) para incentivar o uso de tecidos OA humanos primários na comunidade de pesquisa.

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Protocol

Este protocolo de estudo foi aprovado e seguiu as diretrizes institucionais estabelecidas pelo Conselho de Revisão Institucional do Sistema de Saúde Henry Ford (IRB nº 13995).

1. Seleção de pacientes

  1. Identificar os pacientes entre os agendados para serem submetidos à TKA com um cirurgião ortopédico.
  2. Selecione os pacientes com base nos critérios de elegibilidade definidos pelo protocolo de estudo. Exemplos de critérios de inclusão incluem ter 18 anos ou mais e ter diagnóstico confirmado de osteoartrite do joelho. Exemplos de critérios de exclusão incluem submeter-se a substituição parcial do joelho ou ter um diagnóstico confirmado de artrite reumatoide.
  3. Entre em contato com os pacientes para obter consentimento informado antes da cirurgia.

2. Processamento de amostras (para RNA)

NOTA: Realize todo o processamento de tecidos em um armário de biossegurança classe II e siga técnicas estéreis. Use sempre EPI apropriado (luvas de nitrito, jaleco, óculos de segurança) ao processar amostras humanas. Vários fragmentos ósseos são produzidos durante a TKA, uma grande quantidade de osso/cartilagem estará potencialmente disponível para dissecção. Devido à progressão da doença, a degeneração da cartilagem articular pode ser mais grave em algumas porções ósseas, que podem ser fatoradas em design experimental. Apenas tecidos que obrigam eletrocauteria para ressecção têm danos na borda térmica, e um esforço cirúrgico concertado é feito para obter a maioria dos tecidos com um bisturi para minimizar os danos. Os tecidos ressecados devem ser mantidos hidratados o tempo todo com PBS estéril.

  1. Desinfetar todas as superfícies de trabalho e equipamentos com 70% de etanol, descontaminante RNase, água tratada com DEPC e novamente com 70% de etanol. Limpe o líquido residual com tecidos limpos e livres de fiapos. Fórceps, cortadores ósseos e bisturis são autoclavados ou encharcados em 70% de etanol por pelo menos 10 minutos antes do uso. Mantenha o equipamento submerso em 70% de etanol quando não estiver em uso imediato.
  2. Pré-rotular pelo menos três criovias com nome amostral desidenti identificada e número de alíquota para cada tecido (por exemplo, TKA-1 Cartilagem 1).
    1. Identifique cada tipo de tecido da amostra com base nas diferenças de tamanho, forma, cor e textura, como mostrado e descrito na Figura 2. Identifique a cartilagem(Figura 2A, osso(Figura 2B de seta), menisco(Figura 2C),bloco de gordura infrapaelar(Figura 2D),ligamento cruzado anterior(Figura 2E),sinodolio(Figura 2F),e o vasto músculo oblíquo medialis(Figura 2G).
  3. Isole a cartilagem articular.
    1. Selecione uma porção óssea com degradação mínima da cartilagem.
    2. Usando um bisturi nº 10, corte a profundidade da cartilagem o mais longe possível para dissecar toda a espessura da camada de cartilagem.
      NOTA: Um bisturi nº 10 só penetrará na cartilagem, não no osso.
    3. Usando a espessura total da cartilagem, disseca três cubos de 5 mm.
  4. Isole o osso subcondral.
    1. Use a mesma seção óssea da qual a cartilagem foi coletada.
    2. Usando um bisturi nº 10, raspe qualquer cartilagem restante e tecidos residuais da superfície óssea.
    3. Segure a porção óssea a ser cortada com fórceps e use os cortadores ósseos para cortar três cubos de 5 mm.
  5. Isole o menisco.
    1. Identifique uma parte relativamente intacta do menisco medial ou lateral.
    2. Usando um bisturi nº 10 e fórceps, disseca três cubos de 5 mm.
  6. Isole a almofada de gordura infrapator.
    1. Usando um bisturi nº 10 e fórceps, corte a porção amarela do tecido em três porções iguais e homogêneas (~500 mg cada).
  7. Isole o ligamento cruzado anterior (LCA).
    1. Usando um bisturi nº 10 e fórceps, disseca três cubos de 5 mm.
  8. Isole o sinolio.
    1. Usando um bisturi nº 10 e fórceps, isole a porção celular rosa da membrana o máximo possível, raspando o tecido adiposo.
    2. Disseca três porções iguais e homogêneas (~200 mg cada).
  9. Isolar o vasto músculo oblíquo medial (VMO).
    1. Usando um bisturi nº 10 e fórceps, remova qualquer tecido adiposo da amostra, deixando apenas o tecido muscular vermelho.
    2. Disseca três cubos de 5 mm.
      NOTA: O tamanho inicial do tecido limita o tamanho das porções.
  10. Enxágüe as porções de tecido com PBS estéril para remover qualquer resíduo ou detrito.
  11. Para realizar a histologia, fixar cada porção de tecido conforme descrito na Parte 3.
  12. Para realizar a extração de RNA, corte cada uma das três porções de tecido em pedaços menores (~cubos de 1-2   mm).
    1. Transfira as peças menores para um criovial de 2 mL, proteja firmemente as tampas, congele o flash submergindo em nitrogênio líquido por 30 s e, em seguida, transfira para um congelador de -80 °C para armazenamento a longo prazo (até 4 meses testado no protocolo atual). Repita isso para todas as alíquotas de todos os tecidos.
    2. Continue a homogeneização do tecido conforme descrito na Parte 4.

3. Processamento de amostras (para histologia)

ATENÇÃO: A formalina é um produto químico perigoso, usado apenas em um capô de fumaça química.

  1. Encha tubos cônicos pré-rotulados de 15 mL com solução de formalina de 10%.
  2. Usando fórceps, transfira a seção de tecido para os tubos cheios de formalina.
  3. Fixar os tecidos em formalina por 1 semana à temperatura ambiente enquanto treme/agita, se possível.
  4. Após 1 semana, descarte a formalina no descarte adequado de resíduos químicos, enxágue os tecidos com PBS e, em seguida, transfira para um tubo cônico fresco de 15 mL contendo 70% de etanol para armazenamento a longo prazo a 4 °C até que as amostras sejam incorporadas para secção.
    NOTA: Somente para osso/cartilagem, realize a decalcificação da seguinte forma.
  5. Após 1 semana, descarte a formalina no descarte adequado de resíduos químicos e enxágue os tecidos com PBS.
  6. Transfira o tecido para um tubo cônico de 50 mL com 45 mL de solução EDTA de 10% (pH 7.4).
  7. Se não for possível sacudir/agitar, inverta os tubos 10-15 vezes uma vez por dia.
  8. Descarte e substitua a solução EDTA uma vez por semana.
    1. Duas vezes por semana, teste a textura com um instrumento (ou seja, espátula) ou dedo enluvado para confirmar a decalcificação observando a deformação quando a pressão é aplicada. O tempo necessário para descalcificar o tecido ósseo varia entre amostras de 4 a 6 semanas.
  9. Uma vez descalcificado, enxágue o tecido com PBS e transfira para um tubo cônico fresco de 15 mL contendo 70% de etanol para armazenamento a longo prazo a 4 °C até que as amostras sejam incorporadas para secção.

4. Homogeneização de tecidos

ATENÇÃO: O protocolo utiliza o fenól químico perigoso. O trabalho com fenol deve ser realizado em um capuz de fumaça química.

NOTA: Limpe completamente todos os equipamentos e superfícies a serem utilizados com 70% de etanol (mergulhe por um mínimo de 10 minutos), seguido pelo descontaminante RNase (mergulhe por um mínimo de 10 minutos), enxágue com água tratada com DEPC, limpe com uma toalha de papel limpa e sem fiapos e, em seguida, respray ou mergulhe com 70% de etanol.

  1. Homogeneização do tecido duro (cartilagem articular, osso subcondral, menisco)
    1. Antes da homogeneização, esfrie a argamassa, pilão e espátula usando nitrogênio líquido. Estes devem ser mantidos o mais frio possível para evitar o degelo da amostra.
    2. Processe as amostras uma de cada vez, mantendo as outras amostras a -80 °C até que usem.
    3. Transfira a amostra de tecido para argamassa usando uma espátula resfriada; despeje nitrogênio líquido adicional em cima do tecido e permita que ele evapore. Esmague o tecido usando o pilão. Adicione repetidamente mais nitrogênio líquido à amostra de tecido, permita que ele evapore e, em seguida, continue moendo com o pilão para fazer um pó fino.
    4. Depois de colocar o tecido em pó o máximo possível, transfira para um tubo de microcentrifus de 1,5 mL pré-refrigerado.
      1. Tubos pré-frio submergindo em nitrogênio líquido por 30 s antes da transferência de tecido.
    5. Adicione 1 mL da solução ácido-guanidinium-fenol a cada tubo e mantenha-o no gelo.
    6. Repetir as etapas 4.1.3-4.1.5 para cada amostra de tecido duro.
    7. Após cada tecido, limpe a argamassa, o pilão e a espátula com 70% de etanol, descontaminante de RNase, água tratada com DEPC e um molho adicional em 70% de etanol. Limpe qualquer líquido residual com um tecido limpo e sem fiapos.
    8. Incubar as amostras no gelo por mais 20 minutos.
  2. Homogeneização de tecido mole (bloco de gordura infrapator, ACL, sinovial, VMO)
    1. Desinfete o homogeneizador por tubos de 70% de etanol, descontaminante de RNase, água tratada com DEPC e uma lavagem adicional de 70% de etanol, cada um por 30 s. Limpe qualquer líquido residual com um tecido limpo e sem fiapos. Repita isso entre cada amostra.
    2. Pré-rotular tubos de fundo redondos de 5 mL para cada amostra. Adicione 1 mL da solução ácido-guanidinium-fenol a cada tubo.
      1. Trabalhe em uma amostra de cada vez, mantendo outras amostras a serem processadas a -80 °C até o uso.
    3. Transfira o tecido para um tubo pré-rotulado de 5 mL com ácido-guanidinium-phenol.
    4. Homogeneize os tecidos em pulsos de 30 s, mantendo-se no gelo durante e entre pulsos. Repita até que o tecido sejalvido visualmente ou por um máximo de cinco pulsos de 30 s.
      NOTA: Alguns tecidos fibrosos (ou seja, músculo) podem não homogeneizar completamente.
    5. Incubar o tecido dissolvido no gelo e passar para a próxima amostra.
      1. Limpe o homogeneizador conforme descrito na etapa 4.2.1. Certifique-se de que os pedaços de tecido não permaneçam nos dentes da sonda; remover com fórceps estéreis, se necessário.
    6. Após a homogeneização de todas as amostras, incubar no gelo em ácido-guanidinium-phenol por mais 20 minutos.
    7. Transfira as amostras de tubos de fundo redondos para tubos de microcentrifus de 1,5 mL pré-rotulados e pré-refrigerados.

5. Extração de RNA de tecidos

ATENÇÃO: Este protocolo utiliza produtos químicos perigosos como fenol, clorofórmio e isopropanol. Realize todo o trabalho em um capuz de fumaça química.

NOTA: Equipamentos e reagentes são reservados apenas para trabalhos de RNA e devem ser de grau químico adequado para aplicações moleculares (ou seja, estéreis, livres de nuclease). Este protocolo sucede ambos os protocolos de homogeneização de tecidos das partes 4.1 e 4.2. Limpe minuciosamente todos os equipamentos e superfícies a serem utilizados com 70% de etanol (de molho por um mínimo de 10 minutos), seguido pelo descontaminante RNase (molho por um mínimo de 10 minutos). Enxágüe com água tratada com DEPC, limpe o líquido residual com uma toalha de papel limpa e sem fiapos e, em seguida, respray ou mergulhe com 70% de etanol.

  1. Centrifugar os tubos de microcentrifuuge a 10000 x g por 10 min a 4 °C para pelotar os detritos.
  2. Transfira o supernatante para um tubo de microcentrífugo fresco de 1,5 mL.
    NOTA: Para tecidos gordurosos, uma camada lipídica às vezes estará presente na parte superior. Evite transferi-lo perfurando a camada na lateral do tubo com uma ponta de pipeta.
  3. Adicione 200 μL de clorofórmio por 1 mL da solução ácido-guanidinium-fenol a cada amostra. Aperte os tubos vigorosamente à mão por 30 s para misturar. Em seguida, incubar no gelo por 2 minutos.
  4. Centrífuga amostras a 10000 x g para 12 min a 4 °C.
    NOTA: Após a centrifugação, três camadas terão se formado: uma fase aquosa contendo RNA, uma interfase de DNA branco e uma fase de proteína rosa na parte inferior.
  5. Transfira ~500 μL da fase superior e aquosa para um tubo de microcentrifuge fresco de 1,5 mL.
    NOTA: Não perturbe a interfase e as frações proteicas. Armazene essas fases a -80 °C para futuro DNA ou isolamento de proteínas.
  6. Adicione um volume igual de solução ácido-guanidinium-fenol à fase aquosa transferida, misture invertendo o tubo 8-10 vezes. Incubar o tubo no gelo por 20 minutos.
  7. Adicione 200 μL de clorofórmio por 1 mL da solução ácido-guanidinium-fenol a cada amostra. Agite vigorosamente à mão por 30 s para misturar e, em seguida, incubar no gelo por 2 min.
  8. Centrífuga amostras a 10000 x g para 12 min a 4 °C.
  9. Transfira <500 μL da fase aquosa para um tubo de microcentrifuuge fresco, com cuidado para não contaminar a amostra com as outras fases.
    ATENÇÃO: Descarte as demais fases com métodos adequados de descarte de materiais perigosos.
  10. Adicione um volume igual (como fase aquosa) de 100% isopropanol a cada amostra. Misture invertendo o tubo 8-10 vezes. Incubar no gelo por 5 minutos.
    1. Adicione 1 μL de glicógeno coprecipitante a cada amostra para ajudar na localização da pelota de RNA pós-centrifugação.
  11. Centrifugar as amostras a 12000 x g por 25 min a 4 °C.
  12. Localize a pelota no tubo (se usar coprecipitante, ela aparecerá azul). Despeje cuidadosamente o supernatante.
  13. Lave a pelota adicionando 1 mL de etanol gelado de 75% a cada amostra, vórtice para desalojar a pelota do fundo do tubo.
    NOTA: Prepare 75% de etanol usando etanol puro de grau molecular e água sem nuclease.
  14. Centrifugar a 7000 x g por 5 min a 4 °C. Despeje cuidadosamente o supernatante.
  15. Repita as etapas 5.13 e 5.14 mais duas vezes.
  16. Giro rápido (<2000 x g para 5 s) para trazer qualquer líquido residual para o fundo do tubo. Use uma pipeta P20 para remover qualquer etanol residual da parte inferior dos tubos.
    1. Evite tocar na pelota de RNA com uma ponta de pipeta. Mude as dicas entre as amostras.
  17. Com tampas de tubo abertas, amostras secas ao ar à temperatura ambiente por 10 minutos.
    NOTA: A pelota pode se tornar translúcida à medida que seca. Garantir que todo o etanol residual tenha evaporado melhorará a pureza do RNA.
  18. Adicione 25 μL de água sem nuclease a cada tubo para dissolver a pelota.
  19. Incubar em temperatura ambiente por 5 minutos.
  20. Pipeta suavemente para cima e para baixo para misturar o RNA.
  21. Alíquota 5 μL da amostra em um tubo fresco para análise de controle de qualidade(Parte 6). Armazene os 20 μL restantes a -80 °C para ensaios de expressão genética.

6. Controle de qualidade

  1. Determine a concentração e pureza do RNA usando um espectotômetro de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Determine a integridade do RNA usando um dispositivo de eletroforese de acordo com as instruções do fabricante.
    NOTA: Diluir o RNA para estar dentro do alcance dos limites de detecção do chip.

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Representative Results

Sete tecidos articulares humanos únicos estão disponíveis para coleta de pacientes submetidos a TKA para OA(Figura 1). Neste protocolo, cada um desses tecidos foi identificado e processado dentro de 4h de remoção cirúrgica(Figura 2). Seguindo as etapas descritas na Figura 3,as porções de cada tecido foram fixadas para avaliação histológica(Figura 4),enquanto outras porções foram congeladas para o isolamento do RNA. Separando tecidos duros dos tecidos moles por método de desintegração (pulverização versus homogeneização, respectivamente), o RNA de alta integridade e pureza foi extraído de cada tipo de tecido, com resultados representativos mostrados na Tabela 1 (colunas de alta qualidade). Notavelmente, alguns sujeitos produziram RNA de menor qualidade em vários tecidos(Tabela 1, colunas de baixa qualidade), sugerindo que, apesar de um método otimizado, fatores externos (por exemplo, gravidade da doença) podem estar afetando a qualidade do RNA entre os tipos de tecidos.

Figure 1
Figura 1: Esquema da articulação humana do joelho mostrando uma seção transversal lateral. Cada um dos sete tecidos rotulados são coletados durante a TKA e utilizados para fins de pesquisa, conforme descrito neste protocolo. VMO = vasto músculo oblíquo mediado. Imagem acessada e modificada do OpenStax College sob uma licença creative commons26. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagens brutas representativas para cada um dos sete tecidos obtidos de pacientes submetidos à TKA. (A) Corte do osso femoral anterior com seta apontando para cartilagem articular a ser coletada. A cartilagem é identificada por uma camada esbranquiçada encontrada na superfície do osso. (B) Corte do osso femoral anterior com seta apontando para osso subcondral a ser coletado. Menisco. Evite a coleta de seções queimadas causadas pela eletrocauterização durante a TKA. (D) Almofada de gordura infrapatora (cor amarela). (E) Ligamento cruzado anterior (tecido branco, fibroso e esponjoso). (F)Sinoovium. Um lado aparecerá de cor clara e fibroso, muitas vezes contendo tecido adiposo, enquanto o lado oposto aparecerá rosado e menos fibroso. O lado rosa da membrana contém o revestimento sinovial. (G) Vastus medialis músculo oblíquo (vermelho). Esta pode muitas vezes ser a menor porção de tecido e pode conter algum tecido adiposo. Barra de escala = 2 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Visão geral das medidas tomadas para coletar tecidos OA humanos primários para histologia e RNA. Este protocolo descreve a seleção do paciente, processamento de amostras para histologia e RNA, homogeneização de tecidos para tecidos duros e tecidos moles, extração de RNA e controle de qualidade para sete tecidos OA do joelho humano primário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Seções histológicas para cada um dos sete tecidos obtidos de pacientes submetidos à TKA. As seções hematoxilina e manchadas de eosina são mostradas em ampliação de 6x nos painéis A-F com inset ampliado para 40x nos painéis A'-F' e A". (A, A') Cartilagem articular; (A, A") osso subcondral; (B, B') menisco; (C, C') bloco de gordura infrapaelador; (D, D') ligamento cruzado anterior; (E, E') sinovia; (F, F)vasto músculo oblíquo medial. Barras de escala = 400 μm para A-F e 50 μm para A'-F' e A". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tecido N RIN [RNA] (ng/μL) em 25 μL A260:A280 A260:A230
Alta qualidade Baixa qualidade Alta qualidade Baixa qualidade Alta qualidade Baixa qualidade Alta qualidade Baixa qualidade Alta qualidade Baixa qualidade
"Tecidos duros"
Cartilagem Articular 10 4 7.0 ± 0.8 1.3 ± 1.2 135
(36-243)		 46
(26-78)		 1,80 ± 0,09 1.47 ± 0,34 1.40 ± 0.36 0.45 ± 0.26
Osso subcondral 10 4 7.8 ± 0.6 3.6 ± 1.1 514
(181-1586)		 342
(122-769)		 1.96 ± 0,05 1,90 ± 0,17 1,72 ± 0,27 1.12 ± 0,62
Menisco 10 4 7.5 ± 0.6 2.4 ± 0.3 242
(38-1629)		 95
(60-318)		 1.91 ± 0,05 1,71 ± 0,15 1.41 ± 0,47 0,77 ± 0,59
"Tecidos moles"
Bloco de gordura infrapatrulha 10 3 8.5 ± 0.6 6.1 ± 1.4 1905
(668-5100)		 1151
(381-2306)		 1.99 ± 0,01 2.02 ± 0.03 2.09 ± 0.17 1,47 ± 0,71
Ligamento Cruzado Anterior 8 3 7.4 ± 0.4 5.2 ± 1.9 1836
(613-8456)		 727
(97-1479)		 1.97 ± 0,03 1.91 ± 0.18 1,88 ± 0,20 1.35 ± 0,70
Sinodolio 9 3 8.5 ± 0.6 6.2 ± 3.1 2239
(401-4100)		 1897
(902-3366)		 1.99 ± 0,04 2.00 ± 0.03 2.05 ± 0.11 1.91 ± 0.20
Vastus Medialis Oblíquo 9 3 8.5 ± 0.6 8.4 ± 0.7 1002
(377-1715)		 1097
(308-2138)		 1,96 ± 0,03 1.99 ± 0,03 1,82 ± 0,11 1,62 ± 0,27

Mesa 1. Qualidade e quantidade de RNA isolados dos tecidos OA coletados de pacientes TKA. RIN = Número de Integridade do RNA. Os dados apresentados como média ± desvio padrão para RIN, A260:A280 e A260:A230 razões, e média (intervalo) para valores de concentração de RNA. Amostras de alta qualidade consistem em pacientes dos quais todos os tipos de tecidos produziram RNA com RIN > 6 (n = 8-10). Amostras de baixa qualidade consistem em pacientes dos quais vários tipos de tecidos produziram RNA com RIN < 6 (n = 3-4).

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Discussion

O protocolo apresentado mostrou-se bem sucedido na coleta de sete tecidos OA humanos primários para extração de RNA(Tabela 1) e processamento histológico(Figura 4). Antes de coletar amostras de pacientes, é necessário estabelecer um protocolo aprovado pelo IRB, idealmente em colaboração com um cirurgião ou equipe cirúrgica. A aplicação de um protocolo padronizado para coleta de amostras (por exemplo, ressecção de locais in situ consistentes) é essencial para maximizar a reprodutibilidade experimental. As amostras de tecido devem ser transportadas para o laboratório em recipientes estéreis e processados dentro de 4h da cirurgia para evitar a degradação. Durante a dissecção e processamento de tecidos, todos os tecidos são mantidos hidratados em PBS estéreis e são enxaguados em PBS fresco e estéril para remover potenciais contaminantes da superfície, como biofluidos e outros detritos indesejados antes de serem congelados por flash para extração de RNA ou formalina fixada para histologia. Uma aplicação útil da análise histológica é a confirmação dos tipos de tecido e da gravidade da doença, uma vez que estes podem ser distinguidos pelo número celular, distribuição e morfologia, entre outros fatores observáveis por manchas padrão como hematoxilina e eosina(Figura 4).

Os tecidos OA humanos primários podem apresentar desafios para extrair RNA de quantidade e qualidade suficientes, conforme definido pela pureza eintegridade 27. A quantidade de RNA é uma função da celularidade geral do tecido, e na articulação do joelho, há tecidos de baixa célula, alta matriz, como a cartilagem, osso e menisco, e tecidos relativamente de baixa matriz, como a almofada de gordura, ACL, synovium e VMO. Por exemplo, tanto a cartilagem hialina articular quanto a fibrocartilagem meniscal28 são caracterizadas pela baixa celularidade, com a matriz extracelular contendo quantidades variadas de colagens, proteoglicos e outras glicoproteínas28,29. Ter menos células resulta em menos RNA por volume de tecido (quantidade de redução) e ter mais proteína resulta em co-purificação com RNA (redução da pureza)25,30. A pureza do RNA pode ser determinada pela espectrofotometria onde A260:A280 e A260:A230 valores de <1,5 refletem a presença de contaminantes orgânicos (por exemplo, proteína) e valores de ~2.0 refletem rna puro31. A integridade do RNA reflete o nível de degradação, seja causada por condições experimentais (ou seja, forças de tesoura) ou por digestão enzimática (por exemplo, nucleases), e muitas vezes é determinada por análise eletroforética. Um número de integridade de RNA (RIN) de 1 reflete RNA degradado e um RIN de 10 reflete RNAintacto 31,32. Para sequenciamento de RNA, um RIN mínimo de 7 é frequentemente recomendado33,34,35. Dados apresentados na Tabela 1 revelam que estes A260:A280, A260:A230, e limiares de RIN foram atendidos em todos os tecidos das amostras de pacientes no grupo RNA de alta qualidade em comparação com amostras de pacientes no grupo RNA de baixa qualidade, exceto por alguns A260:A230 valores, que podem refletir a contaminação proteica do RNA nos tecidos de baixa célula e alta matriz. Embora existam muitos fatores que podem estar contribuindo para a qualidade do RNA isolado de uma determinada amostra de paciente, entre eles pode estar o nível de gravidade da doença. A natureza doente dos tecidos OA sugere que processos degradativos estão ocorrendo através do aumento dos níveis de enzimas que podem digerir tecidos, mas também RNA, reduzindo assim a qualidade.

Este protocolo para extração de RNA visa maximizar a quantidade e a qualidade do RNA a partir de tecidos OA humanos primários. O passo mais crítico diz respeito à desintegração dos tecidos por pulverização ou homogeneização, e isso se correlaciona com a celularidade tecidual e a composição da matriz. Inicialmente, todos os sete tecidos foram submetidos ao mesmo protocolo onde os tecidos foram primeiro pulverizados por argamassa e pilão usando nitrogênio líquido, depois transferidos para solução ácido-guanidinium-fenol, e homogeneizados ainda mais usando um homogeneizador de tecido portátil. Este método produziu rendimento, pureza e integridade favoráveis para o bloco de gordura, ACL, sinodio e VMO (tecidos coletivamente moles; também, relativamente de células altas, baixa matriz), mas resultados desfavoráveis para cartilagem, osso e menisco (tecidos coletivamente duros; também, de baixa célula, alta matriz). Com base nessas observações, os sete tecidos foram divididos em dois grupos para posterior refinamento protocolar. Observou-se que a homogeneização adicional teve efeito mínimo na desintegração dos tecidos duros após terem sido pulverizados em pó fino. Por outro lado, a dissociação dos tecidos moles foi alcançada com sucesso apenas com homogeneização e não exigiu pulverização. Assim, foi eliminada a homogeneização dos tecidos duros e a pulverização dos tecidos moles. Isso foi benéfico para minimizar as forças de tesoura, o tempo de processamento e a flutuação da temperatura, tudo isso pode melhorar a integridade do RNA. Foram realizadas duas rodadas de separação da fase fenol/clorofórmio para todos os sete tecidos, pois foi relatado que isso melhorou a pureza do RNA sem reduzir o rendimento31.

Uma limitação potencial deste protocolo é o efeito em lote que pode surgir da separação dos tecidos em dois grupos se o desenho experimental exigir comparação entre todos os tecidos. O uso de métodos de pulverização versus homogeneização pode alterar condições técnicas (por exemplo, tempo de processamento) e ambientais (por exemplo, flutuações de temperatura) que podem introduzir variabilidade36. Uma segunda limitação é a potencial inconsistência na identificação, dissecação e orientação (para seção histológica) dos tecidos dentro e entre os sujeitos. Uma terceira limitação é a nossa incapacidade de confirmar possíveis correlações entre a gravidade da doença do paciente e a qualidade do RNA no relatório atual. Uma quarta limitação é a falta de disponibilidade de tecidos de controle saudável para comparação. Embora as amostras de controle possam estar disponíveis a partir de cadáveres, estes são menos facilmente disponíveis do que os tecidos OA da TKA. Uma estratégia experimental para contornar isso é usar cada sujeito como seu próprio controle, seja fazendo comparações entre tecidos ou dentro de tecidos comparando o tratamento ao controle ou lesão a áreas preservadas. Finalmente, o uso de explantes teciduais para extração de RNA não permite a análise da expressão genética dos tipos de células individuais que compõem os tecidos (por exemplo, fibroblastos sinoviais versus macrófagos sinoviais37).

Apesar das limitações notadas, os tecidos OA humanos primários são um recurso valioso para a pesquisa, oferecendo vantagens sobre outros sistemas experimentais para OA, incluindo a preservação do nicho celular23. No entanto, os tecidos humanos primários de OA podem ser subutilizados em pesquisas devido a desafios logísticos ou técnicos. Este protocolo descreve a seleção do paciente, processamento de amostras, homogeneização de tecidos, extração de RNA e controle de qualidade para apoiar o uso das amostras obtidas da TKA. Após o processamento da amostra, várias abordagens experimentais podem ser perseguidas, incluindo expressão genética e histologia, entre outras. O mais relevante para o campo de omics em rápida evolução é a capacidade de isolar quantidades suficientes de RNA de alta qualidade para aplicações como RNA-sequenciamento38,39. Perfis moleculares podem ser comparados dentro e entre tecidos de indivíduos com fenótipos específicos da doença (por exemplo, com base na idade, sexo e outros fatores de risco OA). Os insights adquiridos podem informar novos caminhos terapêuticos que podem ser mais facilmente traduzidos de volta para a população de pacientes com OA.

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Disclosures

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Acknowledgments

Os autores agradecem aos participantes do estudo que tornaram essa pesquisa possível e dedicam este relatório a novos cientistas no campo da osteoartrite.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Eppendorf 05 402 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
10% Formalin Cardinal Health C4320-101 Store in chemical cabinet when not in use.
100% Chloroform (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific ICN19400290 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Ethanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific BP2818500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.
100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific AC327272500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Reagent Alcohol Cardinal Health C4305 Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.
15 cm sterile culture dishes Thermo Scientific 12-556-003 Sterile, nuclease-free.
15 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 14 959 53A Sterile, nuclease-free.
2 mL cryovials (externally threaded) Fisher Scientific 10 500 26 Sterile, nuclease-free.
5 mL round-bottom tubes Corning 352052 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
50 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 12 565 271 Sterile, nuclease-free.
Bioanalyzer Agilent G2939BA For RNA integrity measurement.
Biosafety Cabinet General lab equipment
Bone Cutters Fisher Scientific 08 990 Sterilized with 70% EtOH.
Chemical Fume Hood General lab equipment
Disposable Scalpels (No.10) Thermo Scientific 3120032 Sterile, nuclease-free.
EDTA Life Technologies 15-576-028 10% solution with dH2O.
Forceps Any vendor Sterilized with 70% EtOH.
Glycoblue Coprecipitant Fisher Scientific AM9516 Reserved for RNA work only, store at -20 °C.
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Liquid Nitrogen Any vendor
Liquid Nitrogen Dewar General lab equipment
Mortar and Pestle Any vendor Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000 For RNA purity and yield measurements.
Nuclease-free/DEPC-treated water Fisher Scientific Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
PBS (Sterile) Gibco 20 012 050 Sterile, nuclease-free.
Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips Any vendor Sterile, nuclease-free.
Plasma/Serum Advanced miRNA kit Qiagen 217204
Refrigerated Centrifuge 5810R Eppendorf 22625101
RNAlater Thermo Scientific 50 197 8158 Sterile, nuclease-free.
RNAse Away/RNAseZap Fisher Scientific
7002
Spatula (semimicro size) Any vendor Reserved for RNA work only.
Tissue homogenizer Pro Scientific 01-01200 Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
TRIzol Reagent Fisher Scientific 15 596 026 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.

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Biologia Edição 173
Coleta de tecidos e extração de RNA da articulação do joelho osteoartrítica humana
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Wilson, T., Kaur, N., Davis, J.,… More

Wilson, T., Kaur, N., Davis, J., Ali, S. A. Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint. J. Vis. Exp. (173), e62718, doi:10.3791/62718 (2021).

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