Artigo de método

Um modelo de roedor isquêmico de pericárdio intacto

DOI:

10.3791/62720

⸱

2 de setembro de 2021

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1Section of Cardiac Surgery, Department of Cardiac Sciences, Libin Cardiovascular Institute, Cumming School of Medicine, 2Department of Pharmacology and Physiology, University of Calgary

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve as etapas para induzir o infarto do miocárdio em camundongos, preservando o pericárdio e seu conteúdo.

Resumo

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Este protocolo mostrou que o pericárdio e seu conteúdo desempenham um papel antifibrótico essencial no modelo isquêmico de roedores (ligadura coronariana para induzir lesão miocárdica). A maioria dos modelos pré-clínicos de infarto do miocárdio requer a ruptura da integridade pericárdica com perda do meio celular homeostático. No entanto, recentemente uma metodologia foi desenvolvida por nós para induzir o infarto do miocárdio, o que minimiza os danos pericárdicos e retém a população de células imunes residentes do coração. Foi observada uma melhora da recuperação funcional cardíaca em camundongos com um espaço pericárdico intacto após a ligadura coronariana. Este método oferece uma oportunidade para estudar as respostas inflamatórias no espaço pericárdico após o infarto do miocárdio. O desenvolvimento adicional das técnicas de marcação pode ser combinado com este modelo para entender o destino e a função das células imunes pericárdicas na regulação dos mecanismos inflamatórios que impulsionam o remodelamento no coração, incluindo a fibrose.

Introdução

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Até hoje, a doença cardiovascular (DCV) é reconhecida como a principal causa de morte em todo o mundo, resultando em uma significativa carga financeira e redução na qualidade de vida do paciente1. A doença arterial coronariana (DAC) é um subtipo de DCV e desempenha um papel essencial no desenvolvimento do infarto do miocárdio (IM), que é um dos principais contribuintes para a mortalidade. Por definição, o IAM resulta de lesão irreversível do tecido miocárdico devido a condições prolongadas de isquemia e hipóxia. O tecido miocárdico carece de capacidade de regeneração, de modo que as lesões são permanentes e resultam na substituição do músculo cardíaco por uma cicatriz fibrótica que pode ser inicialmente protetora, mas acaba contribuindo para o remodelamento cardíaco adverso e eventual insuficiência cardíaca2.

Embora o manejo de pacientes com DAC tenha melhorado drasticamente nas últimas décadas, a insuficiência cardíaca crônica (ICC) secundária à isquemia afeta muitos pacientes em todo o mundo. Para prevenir e gerenciar essa epidemia, é necessário entender os mecanismos subjacentes mais extensivamente e desenvolver novas abordagens terapêuticas. Além disso, achados passados destacam as limitações da terapia sistêmica e a necessidade de desenvolver alternativas precisas. Dado que a investigação das sequelas moleculares do IAM em humanos é afetada pela capacidade de acessar o tecido infartado, modelos animais que recapitulam as características e o desenvolvimento do IAM humano e da ICC relacionados às DCV são indispensáveis.

Como os modelos animais ideais se assemelham muito a um distúrbio humano por características estruturais e funcionais, a etiologia da doença deve orientar sua concepção. Na DAC, é a estenose aterosclerótica crônica das artérias coronárias ou oclusão trombótica aguda. Diferentes métodos têm sido desenvolvidos e aplicados em várias espécies de animais de laboratório para induzir o estreitamento ou oclusão da artéria coronária. Tais estratégias podem ser amplamente classificadas em dois grupos: (1) manipulação mecânica de uma artéria coronária para induzir um IAM e (2) aterosclerose acelerada para facilitar o estreitamento coronariano levando a um IAM. A primeira estratégia geralmente envolve a ligadura de uma artéria coronária ou a colocação de um stent dentro da artéria. A segunda abordagem tende a depender da modificação da dieta do animal para incluir alimentos ricos em gordura / colesterol. Algumas das limitações desta última abordagem incluem a falta de controle sobre o momento e o local das oclusões coronarianas.

Em contraste, a indução cirúrgica de IAM ou isquemia em um modelo animal tem várias vantagens, como localização, tempo preciso e extensão do evento coronariano, levando a resultados mais reprodutíveis. O método mais utilizado é a ligadura cirúrgica da artéria coronária descendente anterior esquerda (DAE). Tais modelos recapitulam as respostas humanas à lesão isquêmica aguda, bem como a progressão para ICC3. Inicialmente desenvolvida em animais de maior porte, a cirurgia de LAD em pequenos animais, como roedores, tornou-se mais viável com os avanços da tecnologia4. Ao estabelecer tais modelos, os ratos têm sido favorecidos por várias razões, incluindo sua disponibilidade relativa, baixo gasto em habitação e sua capacidade de manipulação genética.

Modelos cirúrgicos contemporâneos de cardiopatia isquêmica utilizando oclusão LAD requerem que o pesquisador abra o pericárdio para ligar temporária ou permanentemente a artéria5. Tais estratégias resultam na ruptura do espaço pericárdico, que desempenha uma função essencialmente mecânica e lubrificante para garantir a função cardíaca adequada. Outra desvantagem da abertura do pericárdio é a perda do líquido pericárdico nativo do animal com seus diversos componentes celulares e proteicos 6,7. Em resposta, um método para induzir o IAM, mantendo o pericárdio intacto, foi desenvolvido por nós. Além de minimizar a perturbação desse ambiente homeostático, essa abordagem permite marcar e rastrear células específicas depois de causar um infarto do miocárdio. Além disso, essa abordagem representa melhor a lesão isquêmica miocárdica no ambiente humano.

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Protocolo

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Camundongos C57BL/6J machos e fêmeas entre 8-14 semanas de idade foram usados para esses experimentos. Este protocolo recebeu aprovação ética do Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Calgary e segue todas as diretrizes de cuidados com animais.

1. Preparação e cirurgia do rato

  1. Esterilizar ferramentas cirúrgicas (via esterilizador de contas ou autoclave).
  2. Pesar o rato quanto ao peso pré-cirúrgico e à dose de analgésicos.
  3. Coloque o rato numa caixa de indução com 4% de isoflurano e 800 ml/min de oxigénio. Confirme o plano anestésico beliscando os dedos dos pés e observando o animal por falta de reflexo.
  4. Injetar analgésico por via subcutânea (0,1 mg/kg de buprenorfina) (ver Tabela de Materiais).
  5. Coloque o rato numa almofada cirúrgica aquecida durante a cirurgia e mantenha a anestesia com isoflurano a 3% administrado através do cone nasal. Aplique pomada oftálmica para evitar olhos secos para cada olho.
  6. Raspe o cabelo das áreas cirúrgicas do peito e pescoço.
  7. Restrinja as patas do rato e posicione-as sobre a mesa cirúrgica.
  8. Intubar o rato inserindo um cateter 23 G de ponta lisa na traqueia através da boca e da faringe.
    1. Ventilar o rato após a intubação com isoflurano a 2% e oxigénio a 100% como gás transportador utilizando um ventilador comercial (ver Tabela de Materiais) regulado a uma taxa de 110 respirações/min, um volume corrente de 250 μL e pressão expiratória final positiva (PEEP) de 4 mmHg.
  9. Enrole o mouse 30% no lado direito para posicionar o lado esquerdo do tórax para a cirurgia.
  10. Limpe a área cirúrgica com 3 esfoliantes alternados de etanol a 70% e betadine em movimento circular (verTabela de Materiais). Coloque cortinas cirúrgicas estéreis ao redor da área cirúrgica.
  11. Faça uma incisão lateral de 2-3 cm na pele do peito para visualizar os músculos peitorais do lado esquerdo. Corte o peitoral maior e menor usando uma incisão de 1 cm da linha média para fora para visualizar os músculos intercostais entre a terceira e a quarta costelas.
    NOTA: Deve-se tomar cuidado para evitar o excesso de sangramento do músculo peitoral através da cauterização dos vasos hemorrágicos.
  12. Faça uma incisão de 2 cm no músculo intercostal esquerdo para introduzir ar (por movimento passivo do ar) na cavidade torácica para permitir que o coração e os pulmões caiam da incisão cirúrgica. Além disso, expanda a abertura com a ajuda de um dispositivo de cauterização (ver Tabela de Materiais) para incidir o intercostal e prevenir o sangramento
    NOTA: O ventilador deve ser temporariamente interrompido durante o período de cauterização para evitar reações explosivas com oxigênio. Cuidados são tomados para não danificar o saco pericárdico.
  13. Usando afastadores, retraia as costelas para expor o coração.
  14. Observe o pericárdio e o coração subjacente sob um estereomicroscópio.
    NOTA: O pericárdio do rato é fino o suficiente para visualizar a vasculatura do coração.
  15. Coloque suavemente fórceps na superfície do pericárdio para reduzir seu movimento e o do coração subjacente.
  16. Marcar visualmente a artéria coronária descendente anterior esquerda (DAE), traçando sua emergência sob o apêndice esquerdo.
  17. Usando o driver de microagulha, guie uma sutura apropriada (ver Tabela de Materiais) através do pericárdio, sob o LAD, com a sutura emergindo do outro lado do LAD e do pericárdio. Amarre a sutura para restringir o fluxo sanguíneo através da artéria coronária e corte o excesso de sutura com o auxílio de tesoura (Figura 1A).
    NOTA: Ao restringir o fluxo sanguíneo para a artéria coronária, o branqueamento da porção anterior do ventrículo esquerdo deve ser visível. Este procedimento representa um modelo de ligadura permanente. No entanto, uma abordagem de ligadura transitória com diferentes períodos de isquemia também poderia ser aplicada nesta fase.
  18. Abaixo do local da incisão dentro da área estéril, introduza um cateter 24 G percutaneamente no peito (remova a agulha guia depois de entrar na cavidade torácica). Em seguida, feche as costelas seguidas de camadas musculares e pele usando uma sutura apropriada (uma agulha cônica para o músculo, agulha de corte convencional para a pele).
  19. Uma vez fechado o tórax, evacue o ar restante da cavidade torácica através do cateter 24 G usando sucção suave com uma seringa de 3 mL e compressões torácicas. Uma vez que o ar é removido, retire o cateter 24 G.
  20. Reduzir o isoflurano para 1%.
  21. Desligue o isoflurano enquanto mantém a ventilação com oxigênio para permitir que o rato se recupere da anestesia. Uma vez que o animal mostre sinais de respiração independente, remova o tubo traqueal de 23 G da boca e coloque o rato em uma gaiola de recuperação a ser monitorada para a retomada da respiração normal.
  22. Permita que o rato recupere na gaiola com uma parte da gaiola colocada numa almofada de aquecimento para fornecer uma fonte de calor externa.
  23. Fornecer injeções de manutenção de analgésico (Buprenorfina 0,1 mg/kg, por via subcutânea) a cada 12 h durante 72 h pós-operatório.
  24. Monitore o estado de saúde dos ratos diariamente por 7 dias, o que inclui a avaliação de incisões e desconforto animal.
    NOTA: Devido à invasividade deste procedimento (toracotomia), a administração de antibióticos pode ser necessária.

2. Avaliação funcional da função cardíaca por ecocardiografia (ECG)

  1. Induzir e manter o rato sob anestesia geral com 1,5-2% de isoflurano e 800 mL/min de oxigênio.
  2. Coloque o rato em posição supina em uma plataforma de palco aquecida e prenda as patas aos eletrodos do ECG.
  3. Raspe o peito do mouse.
  4. Adquira imagens de ecocardiografia usando uma sonda de transdutor linear de 40 MHz e gel de contato e analise com o software apropriado (consulte Tabela de Materiais).
  5. Desligue o isoflurano e permita que o rato recupere na plataforma de aquecimento antes de devolver a gaiola a um estado ativo.
    NOTA: A avaliação ecocardiográfica não é invasiva e, portanto, pode ser realizada longitudinalmente durante todo o experimento para determinar as alterações antes e após a ligadura coronariana.

3. Coleta de tecido cardíaco para coloração de fibrose

  1. Sacrifique os ratos com inalação de 100% de CO2 e disseque cuidadosamente o coração.
    NOTA: Usando tesoura e fórceps, isso é conseguido cortando os grandes vasos que entram (veia cava, veia pulmonar) e saem (artéria pulmonar, aorta) do coração para liberá-lo do sistema circulatório na cavidade torácica.
  2. Fixe o coração em formalina a 10% por pelo menos 24 h.
  3. Corte as amostras usando lâmina de barbear reta através do ventrículo direito, septo interventricular e ventrículo esquerdo, garantindo que a incisão passasse pelo centro da zona de infarto. As amostras são então enviadas para a instalação principal para incorporação de parafina.
  4. Corte seções de tecido de 5 μm de espessura com um micrótomo e coloque-as em lâminas de vidro para coloração.
  5. Desparafinizar usando xileno comercial e lavagens com álcool graduadas (2x 99%, 1x 95%, 1x 70%) com água deionizada, depois reidratar.
  6. Coloração com 0,1% de vermelho Sirius em ácido pícrico por 2 h à temperatura ambiente.
  7. Lave as seções com ácido acético a 0,5% por 3 min e enxágue com etanol a 70% por 1 min.
  8. Desidratar as secções utilizando a ordem inversa das lavagens descritas no ponto 3.4, com concentrações de etanol crescentes e graduadas e, em seguida, xileno.
  9. Monte seções de tecido com uma solução de montagem (ver Tabela de Materiais) para avaliação microscópica.

4. Citometria de fluxo do lavado do coração e da cavidade pericárdica

  1. Sacrifique os ratos com inalação de 100% de CO2 para o efeito.
  2. Coloque o rato de costas e fixe os braços e as pernas a uma tábua cirúrgica com fita adesiva.
  3. Abra cuidadosamente o lado esquerdo (lado direito da vista do experimentador) da cavidade torácica, começando com o corte do diafragma até cerca do ponto médio e, posteriormente, cortando as costelas externas em direção ao esterno.
    NOTA: Evite cortar grandes vasos sanguíneos, particularmente aqueles que correm paralelos ao esterno.
  4. Retraia as costelas usando um hemostático para expor o coração subjacente e o pericárdio.
    NOTA: O pericárdio é muito frágil, por isso certifique-se de não pegá-lo com uma tesoura durante o corte.
  5. Usando um cateter de tubo PE-10 (ver Tabela de Materiais) inserido no espaço pericárdico perto da junção do átrio esquerdo e do ventrículo esquerdo, injete 100 μL de solução salina estéril na cavidade pericárdica.
    1. Deixe a solução salina se acumular e se acumule do lado posterior do coração, tomando cuidado para não perfurar ou rasgar o pericárdio no processo. Repita este passo duas vezes e coloque o fluido de lavagem no gelo enquanto processa o coração.
  6. Excise o coração cortando os principais vasos (aorta, artéria pulmonar, veia e veia cava) que entram e saem do coração. Remova os átrios direito e esquerdo e pese o tecido cardíaco ventricular.
  7. Picar o tecido em pequenos pedaços de 1 mm2 usando tesoura e colocar em 10 mL de tampão de digestão contendo 450 U/mL de colagenase I, 125 U/mL de colagenase XI, 60 U/mL de DNase I e 60 U/mL de hialuronidase em PBS por 1 h a 37 °C em um agitador orbital.
  8. Passar homogeneizados do tecido cardíaco através de um filtro celular de 70 μm (ver Tabela de Materiais) e girar para baixo a 60 x g durante 5 min a 4 °C para remover as células do parênquima cardíaco.
  9. Recolher o sobrenadante, passar por um filtro celular de 40 μm (ver Tabela de Materiais) para uma única suspensão celular e girar a 400 x g durante 5 minutos a 4 °C para peletizar as células.
  10. Realizar bloqueio de receptores cristalizáveis (Fc) de fragmentos e coloração de marcadores celulares em células pericárdicas e cardíacas, conforme descrito anteriormente8.
  11. Execute amostras em um citômetro de fluxo.

5. Marcação de macrófagos pericárdicos pelo método da Abordagem Intercostal do Espaço Pleural (ICAPS)9

  1. Esterilize as ferramentas cirúrgicas (via esterilizador de contas ou autoclave) e pulverize 70% de etanol antes de começar.
  2. Induzir e manter o rato sob anestesia geral com 1,5-2% de isoflurano e 800 mL/min de oxigênio. Confirme o plano anestésico beliscando os dedos dos pés e observando o animal por falta de reflexo.
  3. Injetar analgésico por via subcutânea (Buprenorfina 0,1 mg/Kg).
  4. Coloque o rato numa almofada cirúrgica aquecida durante a cirurgia.
  5. Raspe a área torácica anterolateral direita.
  6. Limpe a área cirúrgica com etanol e betadina.
  7. Faça uma incisão de 3 cm de comprimento na pele e, com fórceps, exponha a caixa torácica.
  8. Carregue 5 μL de esferas fluorescentes (microesferas fluorescentes comercialmente disponíveis, 1 μm, ver Tabela de Materiais) e 45 μL de solução salina em um cateter de seringa de tubulação PE-10 com uma ponta chanfrada.
  9. Guie o cateter para o espaço intercostal como descrito anteriormente9, injete lentamente a solução do talão e remova o cateter em um movimento.
  10. Feche a pele usando grampos.
    NOTA: Os grampos são usados no lugar de suturas para minimizar a potencial reabertura da incisão.
  11. Desligue o isoflurano, coloque o rato na gaiola de recuperação e monitorize as complicações durante as primeiras 24 horas.

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Resultados

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Este modelo de ligadura coronária modificado foi otimizado para alcançar a reprodutibilidade e a sobrevivência animal. No entanto, devido à lesão significativa induzida no coração, algumas mortalidades esperadas intraoperatórias e pós-operatórias estão associadas ao procedimento. A mortalidade padrão é tipicamente maior em homens (~ 25-35%) do que em mulheres (~ 10-15%).

A indução bem-sucedida de um IAM com a ligadura coronariana modificada deve ser evidente por alterações nos parâmetros funci...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Induzir um IAM em um pericárdio fechado em roedores é único e pode ter aplicações potencialmente significativas. O procedimento depende muito da familiaridade do cirurgião com o modelo de roedores e a anatomia cardíaca do roedor. O sucesso também depende dos cuidados dispensados durante três etapas críticas: incisão muscular intercostal e retração da costela (Passos 1.11-1.13), criação do infarto (Passo 1.17) e recuperação animal (Passos 1.22-1.24).

A toracotomia deve ser feita diligentemente ...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos a revelar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Esterilizador de Esferas Steri-350InotechNC9449759
10% FormalinaMillipore SigmaHT501128-4L
40 µ Filtro de células mVWRCA21008-949Falcon, 352340
70 µ Filtro de células mVWRCA21008-952Falcon, 352350
ACK Tampão de liseThermo FisherA1049201
BD Insyte-W Agulha de cateter 24 G X 3/4"CDMV Inc108778
Betadine (solução tópica de iodopovidona a 10%)CDMV Inc104826
Pinça sem corteFerramentas de ciência finaFST 11000-12
BNP Pomada OftálmicaCDMV Inc17909
Castroviejo Agulha DriverCiênciaFina FST 12061-01
Centrífuga 5810REppendorf22625101
Colagenase IMillipore SigmaSCR103
Colagenase XIMillipore SigmaC7657
Covidien 5-0 Sutura Polysorb - Agulha cônica CV-11Medtronic CanadaGL-890
Covidien 5-0 Sutura Polysorb - Agulha de corte PC-13Medtronic CanadaSL-1659
Fórceps Curvo Sem CorteFerramentas de Ciência FinaFST 11009-13
Dako Montagem MédiaAgilenCS70330-2
DNase IMillipore Sigma11284932001
Etanol, 100%Millipore SigmaMFCD00003568
Ethicon 8-0 Sutura de Ethilon - Agulha cônica BV-130-4Johnson & Johnson Inc.2815G
Fibra ÓpticaNikon2208502
Fine ForcepsFine Science ToolsFST 11150-10
Fluoresbrite® Microesferas de Carboxilato YG 1.00 µ mPoliciências, Inc.15702
Unidade de Cauterização Térmica GeigerInstrumentos de Precisão Mundial501293Modelo 150-ST
HialuronidaseMillipore SigmaH4272
Vaporizador de IsofluoranoHarvard Apparatus75-0951
Isoflurano USP, 250 mLCDMV Inc108737
Sistema de Retração do Fixador MagnéticoFerramentas de Ciências Finas18200-20
MX550D- sonda de 40 MHzFujifilm- Visual Sonics
Driver FineScience ToolsFST 12002-12
PE-10 TubulaçãoBraintree Scienctific, Inc.PE10 50 FT
TesouraFine Science ToolsFST 14184-09
SMZ-1B Microscópio EstéreoNikonSMZ1-PS
VentElite Ventilador para Pequenos AnimaisHarvard Aparelho55-7040
Vetergesic (10 mL, 0,3 mg / mL de buprenorfina)))CDMV Inc124918medicamento controlado
Vevo 2100 SoftwareFujifilm-Visual Sonics
Ferramentas de

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  10. Nakatani, T., Shinohara, H., Fukuo, Y., Morisawa, S., Matsuda, T. Pericardium of rodents: pores connect the pericardial and pleural cavities. The Anatomical Record. 220, 132-137 (1988).
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  12. Hamilton, D. R., Sas, R., Semlacher, R. A., Kieser Prieur, T. M., Tyberg, J. V. The relationship between left and right pericardial pressures in humans: an intraoperative study. The Canadian Journal of Cardiology. 27, 346-350 (2011).
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