Artigo de método
Aqui fornecemos um protocolo para triagem de potenciais fatores de transcrição envolvidos no desenvolvimento de células dendríticas (DC) usando transdução lentiviral de shRNA para obter linhas celulares de knockdown estáveis para diferenciação in vitro DC.
As células dendríticas (DCs) são células importantes que apresentam antígenos que conectam respostas imunes inatas e adaptáveis. Os DCs são heterogêneos e podem ser divididos em DCs convencionais (cDCs) e DCs plasmacitóides (pDCs). cDCs é especializado em apresentar antígenos e ativar células T ingênuas. Por outro lado, os pDCs podem produzir grandes quantidades de interferons tipo I (IFN-I) durante a infecção viral. A especificação dos DCs ocorre em um estágio inicial de progenitores de DC na medula óssea (MM) e é definida por uma rede de fatores de transcrição (TFs). Por exemplo, cDCs altamente expressam ID2, enquanto pDCs altamente expressos E2-2. Uma vez que cada vez mais subconjuntos de DCs estão sendo identificados, há um crescente interesse em entender TFs específicos controlando o desenvolvimento de DC. Aqui, estabelecemos um método para tela de TFs críticos para a diferenciação de DCs in vitro , fornecendo lentivírus carregando RNA de grampo de cabelo curto (shRNA) em uma linha de células hematopoiéticas e progenitoras imortalizadas (iHSPCs). Após a seleção e diferenciação in vitro , o potencial de CDC e pDC das linhas celulares de knockdown estáveis são analisados por citometria de fluxo. Essa abordagem fornece uma plataforma para identificar genes potencialmente regendo os destinos dc de progenitores in vitro.
Os DCs são os principais reguladores da imunidade inata e adaptativa1. Os DCs são classificados principalmente em duas populações funcionalmente distintas, ou seja, pDCs e cDCs. Além disso, os cDCs compreendem dois subconjuntos, ou seja, cDCs tipo I e tipo II ou cDC1s e cDC2s, respectivamente2. pDCs, expressando BST2, Siglec-H, e níveis intermediários de CD11c em camundongos3,4, são as células que podem segregar grandes quantidades de IFN-I durante inflamação e infecção viral5. Devido à sua robusta capacidade de produção ifn-I, eles também....
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O manuseio do lentivírus é realizado de acordo com a regulamentação do Departamento de Saúde e Segurança Ambiental da Faculdade de Medicina da Universidade Nacional de Taiwan.
1. Preparação de linhas de células hematopoiéticas e progenitoras imortalizadas (iHSPCs)
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O mapa do vetor lentiviral pLKO.1-Puro é mostrado (Figura 1). Após a entrega do lentivírus que expressa shRNA contra LacZ (um controle não direcionado), Tcf4 e Id2 em iHSPCs, a eficiência de knockdown confirmada pelo RT-qPCR revelou que a expressão de Tcf4 foi reduzida em shTcf4 iHSPCs, em comparação com shLacZ iHSPCs (Figura 2A). Por outro lado, a diminuição da expressão do Id2 também foi observada .......
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Vetores de shRNA baseados em lentivírus são frequentemente usados para silenciamento genético por transdução viral em células e permitem integração estável no genoma hospedeiro. No entanto, várias eficiências de transdução em diferentes tipos de células precisam ser consideradas, e uma série de abordagens foram tomadas para superar esse problema.
Polybrene é um polímero policalítico que pode neutralizar as cargas na membrana celular, aumentando assim a ligação da virion às células durante a <.......
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Os autores não têm nada a revelar.
Agradecemos o apoio técnico do Dr. Tz-Ling Chen. Agradecemos ao National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taiwan) por fornecer shRNA lentivirus (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia de Taiwan (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 e MOST 109-2320-B-002-054-MY3).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anticorpos | |||
| APC/Cy7 anti-camundongo CD11c Anticorpo | Biolegend | 117324 | (Clone: N418) |
| FITC anti-camundongo/humano CD11b Anticorpo | Biolegend | 101206 | (Clone: M1/70) |
| PE anti-camundongo/humano B220 Anticorpo | Biolegend | 103208 | (Clone: RA3-6B2) |
| Cultura de células | |||
| 1,5 mL Micro tubo | ExtraGene | TUBE-170-C | |
| Placa tratada com cultura de tecidos de 12 poços | Falcon | 353043 | |
| Soro bovino fetal (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| RPMI 1640 Gibco | médio 11875-085 | ||
| Reagente | |||
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758-250MG | |
| β-mercaptoetanol (β-ME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| FACS tampão | caseiro | Fórmula: 1xPBS+0,5 %FBS+0,1%NaN3 | |
| Flt3 ligante (FL) | Polybrene caseiro | ||
| Sigma-Aldrich | TR-1003-G | ||
| Puromicina | Invivogen | ant-pr-1 | |
| TRIsure | BIOLINE | BIO-38032 | |
| shRNA (Taregt sequence/clone ID) | Company | ||
| shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390) | O Consórcio RNAi (TRC) | ||
| shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224) | O Consórcio RNAi (TRC) | ||
| shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094) | O Consórcio RNAi (TRC) |
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