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Immunology and Infection

Medición del pH, las químicas redox y la capacidad degradativa de los macropinosomas mediante microscopía ratiométrica de fluoróforo dual

Published: August 19, 2021 doi: 10.3791/62733
Automatic Translation
1,2, 2,3
1Department of Biochemistry & Microbiology, Faculty of Science, University of Victoria, 2Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, Faculty of Veterinary Science, University of Calgary, 3Calvin, Joan and Phoebe Snyder Institute for Chronic Diseases, University of Calgary

Summary

Describimos protocolos para medir el pH, los eventos oxidativos y la digestión de proteínas en macropinosomas individuales en células vivas. Se hace hincapié en la microscopía ratiométrica de fluoróforos duales y las ventajas que ofrece sobre las técnicas basadas en la población.

Abstract

En los últimos años, el campo de la macropinocitosis ha crecido rápidamente. La macropinocitosis ha surgido como un mecanismo central por el cual las células inmunes innatas mantienen la homeostasis y la inmunidad del organismo. Simultáneamente, y en contraste con su papel homeostático, también puede conducir a diversas patologías, incluyendo el cáncer y las infecciones virales. A diferencia de otros modos de endocitosis, las herramientas desarrolladas para estudiar la maduración de los macropinosomas permanecen subdesarrolladas. Aquí el protocolo describe herramientas recientemente desarrolladas para estudiar el entorno redox dentro de la luz de los macropinosomas tempranos y en maduración. Se describen metodologías para el uso de la microscopía de fluorescencia ratiométrica en la evaluación del pH, la producción de especies reactivas de oxígeno y la capacidad degradativa dentro de la luz de macropinosomas individuales en células vivas. Las mediciones de orgánulos individuales ofrecen la ventaja de revelar la heterogeneidad espaciotemporal, que a menudo se pierde con los enfoques basados en la población. Se hace hincapié en los principios básicos de la microscopía fluorófora dual, incluida la selección de sondas, la instrumentación, la calibración y los métodos de una sola célula frente a los basados en la población.

Introduction

La macropinocitosis se refiere a la absorción de grandes cantidades de líquido extracelular en orgánulos citoplasmáticos unidos a la membrana llamados macropinosomas1,2. Es un proceso altamente conservado realizado por organismos unicelulares de vida libre, como la ameba Dictyostelium spp. 3, así como antozoos4 y metazoos2. En la mayoría de las células, la macropinocitosis es un evento inducido. La ligadura de los receptores de la superficie celular induce la protrusión de extensiones de membrana plasmática impulsadas por actina conocidas como volantes. Una fracción de esos volantes, por algún mecanismo poco conocido, se sellan en sus puntas distales para formar macropinosomas (aunque más allá del alcance de este documento de métodos, para revisiones detalladas sobre la mecánica de la macropinocitosis, consulte las referencias1,2,5,6,7). El estímulo extracelular que induce la macropinocitosis es más a menudo un factor de crecimiento soluble5,8. En consecuencia, el evento macropinocítico permite la ingestión de un bolo de material extracelular del cual la célula puede derivar metabolitos útiles para facilitar el crecimiento. Desafortunadamente, esta vía para la entrega de nutrientes también puede impulsar la patología. Ciertas células cancerosas albergan mutaciones que resultan en macropinocitosis continua o constitutiva. La entrega continua de nutrientes facilita la proliferación incontrolada de células cancerosas y se ha relacionado con tumores particularmente agresivos9,10,11,12,13. Del mismo modo, los virus pueden inducir macropinocitosis para obtener acceso a las células huésped, impulsando así la patología viral14.

La macropinocitosis también funciona en el mantenimiento de la inmunidad a los patógenos. Ciertas células inmunes innatas como los macrófagos y las células dendríticas participan en el muestreo constitutivo y agresivo de líquido extracelular a través de la macropinocitosis6,15,16. Este modo de macropinocitosis es increíblemente activo, y una sola célula dendrítica puede congestionarse con un volumen de líquido extracelular equivalente a su propio peso cada hora17. A pesar de este muestreo constitutivo, los macrófagos y las células dendríticas no se replican incontrolablemente como lo hacen las células tumorales, sino que parecen procesar el material extracelular de tal manera que se puede extraer información para informar sobre la presencia, o incluso ausencia, de amenazas potenciales. La información se extrae como i) patrones moleculares asociados a patógenos que pueden ser leídos por receptores de reconocimiento de patógenos intracelulares y ii) tramos cortos de aminoácidos que pueden cargarse en las principales moléculas de histocompatibilidad para su detección por células del sistema inmune adaptativo16,18,19. En la actualidad, no está claro si los patógenos subvierten esta vía para el procesamiento de la información por parte de las células inmunes.

A pesar de estos roles bien definidos y críticos para la macropinocitosis tanto en el mantenimiento de la inmunidad como en la homeostasis y en contraste con otros modos de endocitosis más comúnmente estudiados, se conoce poco del funcionamiento interno (luminal) de los macropinosomas. El desarrollo de protocolos y herramientas estandarizados para estudiar la bioquímica luminal de los macropinosomas no solo nos ayudará a comprender mejor su biología única, sino que también proporcionará información que se puede aprovechar para nuevas estrategias terapéuticas, incluida la administración de fármacos20. Este manuscrito del método se centrará en herramientas recientemente desarrolladas para diseccionar, a nivel de orgánulo único, varios aspectos de la bioquímica luminal de los macropinosomas.

Los fluoróforos se pueden utilizar para medir bioquímicas específicas de orgánulos si i) se dividen preferentemente en el compartimento de interés y/o ii) sufren cambios espectrales en respuesta al parámetro de interés. Por ejemplo, en el caso del pH, las bases débiles fluorescentes, como la naranja acridina, la violeta cresil y los colorantes LysoTracker se acumulan preferentemente en orgánulos ácidos. Por lo tanto, su intensidad relativa es una indicación aproximada de que el orgánulo etiquetado es ácido. Otros fluoróforos sensibles al pH, como la fluoresceína, pHrodo y cypHer5e, sufren cambios espectrales al unirse a protones(Figura 1A-C). Por lo tanto, los cambios en la emisión de fluorescencia de los fluoróforos sensibles al pH pueden proporcionar una aproximación útil del pH. El uso de fluoróforos individuales, sin embargo, presenta una serie de desventajas. Por ejemplo, los cambios en el plano focal, el fotobleaching y los cambios en el volumen de orgánulos individuales, una ocurrencia común en los macropinosomas21,pueden inducir cambios en la intensidad de fluorescencia de fluoróforos individuales, y esto no se puede corregir fácilmente para22. Las evaluaciones de longitud de onda única, aunque útiles para visualizar compartimentos ácidos, son, por lo tanto, puramente cualitativas.

Un enfoque más cuantitativo es apuntar al fluoróforo sensible a los parámetros junto con un fluoróforo de referencia al orgánulo de interés. El fluoróforo de referencia es idealmente insensible a los cambios bioquímicos dentro del orgánulo (Figura 1D-F) y, por lo tanto, se puede utilizar para corregir cambios en el plano focal, el volumen organelar y, hasta cierto punto, el fotobleaching23. Utilizando este enfoque, denominado fluorescencia ratiométrica de fluoróforo dual, se puede lograr la corrección generando una relación entre la emisión de fluorescencia del fluoróforo sensible a los parámetros y el fluoróforo de referencia.

Aquí, el protocolo utilizará el principio de imágenes ratiométricas de fluoróforo dual para medir el pH, los eventos oxidativos y la degradación de proteínas dentro de los macropinosomas. En cada caso, se seleccionará un fluoróforo que sea sensible al parámetro de interés y un fluoróforo de referencia. Para dirigir los fluoróforos específicamente a los macropinosomas, se acoplarán covalentemente al dextrano de 70 kDa, que se incorpora preferentemente a los macropinosomas24. Todos los ensayos se realizarán en células Raw264.7, pero se pueden adaptar a otros tipos de células. Siempre que sea posible, las relaciones de fluorescencia se calibrarán contra una curva de referencia para obtener valores absolutos. Es importante destacar que todas las mediciones se realizarán en células vivas para la evaluación dinámica y cuantitativa del entorno luminal de los macropinosomas.

Al seleccionar fluoróforos sensibles al pH, se deben sopesar una serie de consideraciones. El primero es el pKa del fluoróforo, que indica el rango de valores de pH en el que la sonda será más sensible. Si se asume que poco después de la formación, el pH del macropinosoma será cercano al del medio extracelular (~pH 7.2) y que se acidificará progresivamente a través de interacciones con endosomas tardíos y lisosomas (~pH 5.0), entonces se debe seleccionar una sonda con un pKa que sea sensible dentro de ese rango (Figura 2C). La fluoresceína fluorófora, que tiene un pKa de 6.4, es óptimamente sensible dentro de ese rango. Se ha utilizado ampliamente para medir otros orgánulos similares, como los fagosomas, y será el fluoróforo de elección en este manuscrito22,25. Como fluoróforo de referencia, se utilizará tetrametilrodiamina, que es insensible al pH(Figura 1E). Otros fluoróforos, como pHrodo y cypHer5e pueden ser sustituidos por fluoresceína donde las propiedades espectrales de la fluoresceína coinciden con otras variables experimentales. Algunos fluoróforos de referencia sugeridos para pHrodo y cypHer5e se muestran en la Figura 1.

Una segunda consideración es el método por el cual los dos fluoróforos se dirigirán específicamente a los macropinosomas. El dextrano del tamaño 70 kDa, que tiene un radio hidrodinámico de aproximadamente 7 nm, no se adhiere específicamente a las células y se incorpora a los macropinosomas, pero no a los hoyos recubiertos de clatrina o caveolas, y por lo tanto marca los macropinosomas(Figura 2A y Figura 3A,B)16,24,26. En este protocolo, se utilizarán dextrano de 70 kDa dextrano y tetrametilrodamina (TMR) de 70 kDa etiquetados con fluoresceína como sondas sensibles al pH y de referencia, respectivamente.

En las células inmunes innatas, la macropinocitosis y la fagocitosis representan las dos vías principales para la internalización del material exógeno para su procesamiento y posterior presentación a las células de la respuesta inmune adaptativa27. El control cuidadoso y coordinado de la química redox de la luz de los fagosomas y macropinosomas es fundamental para el procesamiento específico del contexto del material exógeno. Quizás el regulador más estudiado de los eventos oxidativos en los fagosomas es la NADPH oxidasa, un gran complejo multi-subunidad que produce grandes cantidades de especies reactivas de oxígeno (ROS) dentro de la luz de los fagosomas28. De hecho, su actividad es fundamental para el procesamiento apropiado de antígenos dentro de los fagosomas29,30. Sin embargo, la actividad de la NADPH oxidasa en las membranas macropinosómicas no se ha explorado.

En este protocolo, el éster de succinimidil H2DCFDA se utiliza para medir eventos oxidativos dentro del macropinosoma. Esta es una forma modificada de fluoresceína (2',7'-diclorodihidrofluoresceína diacetato), que es mínimamente fluorescente en su forma reducida. Tras la oxidación, su emisión de fluorescencia aumenta significativamente. Sin embargo, vale la pena señalar una advertencia significativa de H2DCFDA: ya que se basa en la fluoresceína fluoróforo, su fluorescencia también se apaga en compartimentos ácidos y se debe tener cuidado para controlar esta variable al diseñar experimentos28. Similar al enfoque para medir el pH, el éster de succinimidil H2DCFDA se unirá covalentemente al dextrano de 70 kDa y el dextrano de 70 kDa etiquetado con TMR se utilizará como fluoróforo de referencia(Figura 3A).

La ovoalbúmina fluorescente se utilizará para medir la degradación de proteínas dentro de los macropinosomas. La ovoalbúmina utilizada aquí está densamente etiquetada con un tinte FL 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indáceno (BODIPY) que se autoexpresa. Tras la digestión, se liberan péptidos fuertemente fluorescentes etiquetados con colorantes. Como la ovoalbúmina no se puede conjugar fácilmente con 70 kDa dextrano, las células con dextrano de 70 kDa y ovoalbúmina en fase fluida se coincuban. La señal TMR se utilizará para generar una máscara de macropinosoma durante el análisis posterior a la obtención de imágenes, y la señal liberada de la ovoalbúmina digerida se medirá dentro de la máscara(Figura 3B).

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Protocol

1. Preparación de las células

  1. Cultive células Raw264.7 a 37 °C y 5% de CO2 a 70% de confluencia en RPMI suplementado con 10% de suero inactivado por calor.
  2. Un día antes del ensayo, semuela células Raw264.7 a una densidad de 5 x 104 células por pozo en una placa de 96 pozos. Asegúrese de que cada pozo contenga 100 μL de medio de crecimiento. Asegúrese de que la placa de 96 pozos tenga lados negros y un fondo de vidrio para obtener imágenes.
    NOTA: Aquí, se utilizaron placas de 96 pozos para la obtención de imágenes. Las placas de 96 pozos permiten el uso de cantidades más pequeñas de células y reactivos en relación con las cámaras de imágenes más grandes. Sin embargo, se puede utilizar cualquier cámara diseñada para obtener imágenes de células vivas, y los reactivos se pueden ampliar en consecuencia.
  3. El día del ensayo, verifique si los pozos son al menos 70% confluentes.

2. Medición del pH del macropinosoma

  1. Prepare las celdas como en la sección 1.
  2. Lavar todos los pozos con 100 μL de HBSS a 37 °C.
  3. Llene cada pozo con 100 μL de HBSS que contengan 0,025 mg/ml de dextrano de 70 kDa etiquetado con TMR y 0,025 mg/ml de dextrano de 70 kDa etiquetado con fluoresceína.
  4. Coloque las células en una incubadora a 37 °C durante 15 min.
  5. Retire las células de la incubadora y lave las células 6 veces con 100 μL de HBSS.
  6. Llene cada pozo con 100 μL de HBSS a 37 °C.
  7. Coloque la placa en el microscopio con una etapa y una cámara calentadas.
  8. Ajuste los parámetros de excitación/emisión para cada fluoróforo según sea necesario.
    NOTA: Las condiciones ideales para la adquisición de imágenes variarán con los fluoróforos utilizados y las configuracións individuales del microscopio. Aquí, las imágenes se adquirieron en un microscopio confocal de barrido láser Leica SP5. TMR se excedió con una línea láser 543 y la emisión se recolectó de 610 nm a 650 nm. La fluoresceína se excedió con una línea láser 488 y la emisión se recolectó de 500 nm a 550 nm. Se utilizó un objetivo de inmersión en aceite de 63x y se adquirió un volumen Z de 10 μm a intervalos de 0,5 μm.
  9. Adquirir una imagen de cada pozo, alternando entre fluoróforos entre cada pozo.
  10. Después de la primera adquisición, verifique si todos los pozos permanecieron enfocados en toda la placa.
  11. Adquiera imágenes de cada pozo a intervalos de 1-15 minutos durante el tiempo deseado.

3. Calibración in situ del pH del macropinosoma

  1. Durante la adquisición de la imagen, prepare 1 L de solución rica en potasio (K+-rich) que contenga 140 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2y 5 mM de glucosa. Complemente un volumen de 400 ml de la solución rica en K+con HEPES de 25 mM (de una solución madre de 1 M, pH 7.2) y un volumen separado de 400 ml con MES de 25 mM (de una solución madre de 0.5 M, pH 6.0).
  2. Ajuste una alícuota de 50 ml de la solución rica en K+almacenada en búfer con HEPES de 25 mM a pH 7.5 usando 10 M HCl o 10 M KOH según sea necesario.
  3. Ajuste tres alícuotas separadas de 50 ml de la solución rica en K+almacenadas en búfer con 25mM MES a pH 6.5, pH 5.5 y pH 5.0 usando 10 M HCl o 10 M KOH según sea necesario.
    NOTA: Un tampón de ácido acetato-acético puede ser preferible para soluciones de pH más bajo.
  4. Después de completar la adquisición de imágenes, retire el HBSS de la placa de 96 pozos que contiene las células y reemplácelo con la solución rica en K+que está a pH 7.5.
  5. Añadir nigericina a una concentración final de 10 μg/ml.
    NOTA: Nigericina es un ionóforo que intercambia K+ por H+. Al establecer la concentración K+ de la solución rica en K+a un valor que se aproxima a la concentración K+ del citosol, se puede garantizar que la nigericina sujetará el pH del macropinosoma al del citosol, que a su vez refleja el pH del tampón de calibración.
  6. Vuelva a colocar la placa en el microscopio y adquiera imágenes de cada pozo utilizando los mismos ajustes de adquisición que los anteriores.
  7. Repita los pasos 3.5 y 3.6 para cada búfer de calibración.

4. Análisis de datos para el pH del macropinosoma

  1. Usando el software FIJI, reste el fondo tanto del TMR como del canal de fluoresceína.
  2. Genere una máscara en el canal TMR. Para generar una máscara, convierta la imagen en una imagen binaria seleccionando Ajustar > umbral > Aplicar. A continuación, resalte la imagen binaria y seleccione Editar > Selección > Crear máscara.
  3. Aplíquelo tanto a las imágenes de TMR como a las de fluoresceína. Para ello, resalte la máscara y seleccione Editar > Selección > Crear selección. Haga clic en la imagen TMR y presione Mayús + E para aplicar la máscara al canal TMR. Del mismo modo, haga clic en la imagen de fluoresceína y presione Mayús + E para aplicar la máscara al canal OB.
  4. Registre la intensidad de TMR y fluoresceína para cada macropinosoma dentro de las máscaras.
  5. Repita los pasos 4.1-4.3 para cada punto de tiempo del curso de tiempo.
  6. Repita los pasos 4.1-4.3 para las imágenes capturadas en la calibración in situ.
  7. Divida la intensidad de la fluoresceína por la intensidad de TMR para generar la relación fluoresceína:TMR.
  8. Trazar el pH contra las relaciones fluoresceína:TMR para las imágenes de calibración.
  9. Ajuste una curva a los datos de calibración.
  10. Interpole los datos para cada punto de tiempo del curso de tiempo para obtener valores absolutos de pH.

5. Medición de eventos oxidativos dentro de macropinosomas

  1. Prepare las celdas como en la sección 1.
  2. Un día antes del ensayo, prepare el éster de succinimidil H2DCFDA etiquetado como 70 kDa dextrano resuspiendo 10 mg de 70 kDa dextrano-amino en 1 ml de solución de bicarbonato de sodio de 0,1 M (pH 8,3). Añadir 1 mg del éster de succinimidil H2DCFDA a la solución de dextrano-amino e incubar durante 1 h. Dializar el dextrano de 70 kDa etiquetado con H2DCFDA contra PBS. No lo almacene durante más de 1 día, ya que el dextrano de 70 kDa etiquetado con H2DCFDA se oxidará al almacenarlo.
  3. El día del ensayo, lavar todos los pozos con 100 μL de HBSS a 37 °C.
  4. Llene cada pozo con 100 μL de HBSS que contengan 0,025 mg/ml de dextrano de 70 kDa etiquetado con TMR y 0,025 mg/ml de dextrano de 70 kDa etiquetado con H2DCFDA.
  5. Coloque las células en una incubadora a 37 °C durante 15 min.
  6. Retire las células de la incubadora y lave las células 6 veces con 100 μL de HBSS.
  7. Llene cada pozo con 100 μL de HBSS a 37 °C.
  8. Coloque la placa en el microscopio con una etapa y una cámara calentadas y ajuste los parámetros de excitación / emisión para cada fluoróforo según sea necesario.
    NOTA: Las condiciones ideales para la adquisición de imágenes variarán con los fluoróforos utilizados y las configuracións individuales del microscopio. Aquí las imágenes se adquirieron en un microscopio confocal de barrido láser Leica SP5. TMR se excedió con una línea láser 543, y la emisión se recolectó de 610 nm a 650 nm. H2DCFDA se exció con una línea de láser 488 y la emisión se recolectó de 500 nm a 550 nm. Se utilizó un objetivo de inmersión en aceite de 63x y se adquirió un volumen Z de 10 μm a intervalos de 0,5 μm.
  9. Adquirir una imagen de cada pozo, alternando entre fluoróforos entre cada pozo.
  10. Después de la primera adquisición, verifique si todos los pozos permanecen enfocados en toda la placa.
  11. Adquiera imágenes de cada pozo a intervalos de 1-15 minutos durante el tiempo deseado.

6. Análisis de datos para eventos oxidativos dentro de macropinosomas

  1. Usando el software FIJI, reste el fondo de los canales TMR y H2DCFDA.
  2. Genere una máscara en el canal TMR. Para generar una máscara, convierta la imagen en una imagen binaria seleccionando Ajustar > umbral > Aplicar. A continuación, resalte la imagen binaria y seleccione Editar > Selección > Crear máscara.
  3. Aplique la máscara a las imágenes TMR y H2DCFDA. Para ello, resalte la máscara y seleccione Editar > Selección > Crear selección. Haga clic en la imagen TMR y presione Mayús + E para aplicar la máscara al canal TMR. Del mismo modo, haga clic en la imagen H2DCFDA y presione Mayús + E para aplicar la máscara al canal H2DCFDA.
  4. Registre la intensidad de TMR y H2DCFDA para cada macropinosoma dentro de las máscaras.
  5. Repita los pasos 4.1-4.3 para cada punto de tiempo del curso de tiempo.
  6. Divida la intensidad de H2DCFDA por la intensidad de TMR para generar una relación H2DCFDA: TMR.
  7. Traza la relación H2DCFDA: TMR contra el tiempo.

7. Medición de la digestión de proteínas dentro de los macropinosomas

  1. Prepare las celdas como en la sección 1.
  2. El día del ensayo, lavar todos los pozos con 100 μL HBSS a 37 °C.
  3. Disolver la ovoalbúmina marcada con BODIPY a una concentración de 4 mg/ml en HBSS.
  4. Llene cada pozo con 100 μL de HBSS que contengan 0,025 mg/ml de dextrano de 70 kDa etiquetado con TMR y 0,2 mg/ml de ovoalbúmina etiquetada con BODIPY.
  5. Coloque las células en una incubadora a 37 °C durante 15 min.
  6. Retire las células de la incubadora y lave las células 6 veces con 100 μL de HBSS.
  7. Llene cada pozo con 100 μL de HBSS a 37 °C.
  8. Coloque la placa en el microscopio con una etapa y una cámara calentadas y ajuste los parámetros de excitación / emisión para cada fluoróforo según sea necesario.
    NOTA: Las condiciones ideales para la adquisición de imágenes variarán con los fluoróforos utilizados y las configuracións individuales del microscopio. Aquí, las imágenes se adquirieron en un microscopio confocal de barrido láser Leica SP5. TMR se excedió con una línea láser 543, y la emisión se recolectó de 610 nm a 650 nm. BODIPY se excedió con una línea láser 488, y la emisión se recolectó de 500 nm a 550 nm. Se utilizó un objetivo de inmersión en aceite de 63x y se adquirió un volumen Z de 10 μm a intervalos de 0,5 μm.
  9. Adquirir una imagen de cada pozo, alternando entre fluoróforos entre cada pozo.
  10. Después de la primera adquisición, verifique si todos los pozos permanecen enfocados en toda la placa.
  11. Adquiera imágenes de cada pozo a intervalos de 1-15 minutos durante el tiempo deseado.

8. Análisis de datos para la digestión de proteínas dentro de macropinosomas

  1. Usando el software FIJI, reste el fondo de los canales TMR y BODIPY.
  2. Genere una máscara en el canal TMR y aplíquela tanto a las imágenes TMR como a BODIPY como en los pasos 6.2 y 6.3 anteriores(Figura 3B).
  3. Registre la intensidad de TMR y BODIPY para cada macropinosoma dentro de las máscaras.
  4. Repita los pasos 4.1-4.3 para cada punto de tiempo del curso de tiempo.
  5. Divida la intensidad bodipy por la intensidad TMR para generar la relación BODIPY:TMR.
  6. Traza la relación BODIPY:TMR contra el tiempo.

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Representative Results

Al medir el pH del macropinosoma, hay un período de tiempo durante el cual no se puede medir la dinámica de la acidificación. Este período corresponde a la fase de carga de dextrano (cuadro gris en la Figura 2C y Figura 3C,D)y variará según el tipo de celda utilizada. La duración de la fase de carga variará con (i) la actividad macropinocítica de las células y (ii) la sensibilidad del instrumento utilizado. Se recomienda ajustar este período al comienzo de cada experimento de modo que se logre una relación señal:ruido superior a 4:1 tanto para la fluoresceína como para los canales TMR. En las células no tratadas, la emisión de fluoresceína debe debilitarse progresivamente a medida que los macropinosomas se acidifican, y la señal TMR debe permanecer constante o volverse más brillante. La señal TMR puede volverse más brillante si los macropinosomas se encogen en tamaño16,21. Esto no afectará la proporción, ya que la señal de fluoresceína está sujeta a las mismas variaciones en el tamaño organelar22. La relación fluoresceína:TMR se hará progresivamente más pequeña y se estabilizará dentro de los primeros 15 minutos de adquisición(Figura 2C). Esta meseta corresponde a un pH de ~5, que coincide aproximadamente con el pH de los lisosomas25. Al final de cada adquisición, se realiza una calibración in situ. La relación fluoresceína:TMR debe ser mayor con el tampón de calibración a pH 7.5 y volverse progresivamente más pequeña a medida que los tampones de calibración se vuelven más ácidos. Esto permite la generación de una curva de calibración(Figura 2B). Las relaciones fluoresceína:TMR se pueden interpolar para el pH macropinosómico(Figura 2C).

Los eventos oxidativos dentro de los macropinosomas también son propensos a variar con el tipo de célula que se utiliza. Se recomienda cargar las células con H2DCFDA-dextrano, y estimular la NADPH oxidasa utilizando forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) como control positivo(Figura 3C). Esto dará una mejor idea del rango dinámico del ensayo y permitirá ajustar la configuración del microscopio. A medida que ocurren eventos oxidativos dentro de los macropinosomas, la señal H2DCFDA se volverá progresivamente más brillante. La señal TMR puede permanecer constante o puede variar con el tamaño del macropinosoma, como se discutió anteriormente. La proporción de H2DCFDA: TMR se hará progresivamente mayor y probablemente se estabilizará dentro de los primeros 20-30 minutos en células Raw264.7 inactivadas(Figura 3A,C).

Al medir la digestión de proteínas macropinosómicas, se liberará una señal fluorescente progresivamente fuerte a medida que se digiera la ovoalbúmina. En las células Raw264.7, el aumento de la fluorescencia liberada de la ovoalbúmina digerida etiquetada con BODIPY se estabilizará dentro de los primeros 30 minutos(Figura 3B,D). Como antes, la señal TMR puede permanecer constante o puede variar con el tamaño del macropinosoma. Como la degradación de la ovoalbúmina comienza inmediatamente después del cierre del macropinosoma, un control negativo puede ser útil para determinar el rango dinámico del ensayo. Con este fin, las hidrolasas ácidas dentro del macropinosoma se pueden inhibir utilizando un inhibidor de la V-ATPasa, como la Concanamicina A (CcA)(Figura 3D)o la Bafilomicina A.

Figure 1
Figura 1: Principios de la imagen ratiométrica de fluoróforo dual. (A-C). Exploraciones espectrales (fijación de excitación, emisión variada) de fluoróforos sensibles al pH suspendidos en tampones del pH indicado. La fluoresceína, pHrodo y cypHer5e se usan comúnmente como sensores de pH en ensayos celulares. (D-F). Exploraciones espectrales (fijación de excitación, emisión variada) de fluoróforos insensibles al pH suspendidos en tampones del pH indicado. Los colorantes que no varían con el pH son fluoróforos de referencia útiles. La fluoresceína, no son óptimamente sensibles a los valores de pH más ácidos experimentados en los endosomas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Mediciones dinámicas del pH macropinosómico. (A) Las células Raw264.7 se cargaron con dextrano de 70 kDa etiquetado con fluoresceína y dextrano de 70 kDa etiquetado con TMR a 37 °C en presencia o ausencia de 500 ng/ml de lipopolisacárido (LPS) durante 15 min. También se incubaron con dextrano de 70 kDa etiquetado con fluoresceína y dextrano de 70 kDa etiquetado con TMR a 4 °C como control para la unión no específica de dextrano. Los recuadros muestran celdas individuales (barras de escala = 20 μm). (B) Calibración in situ de celdas Raw264.7 cargadas con dextrano de 70 kDa etiquetado con fluoresceína y dextrano de 70 kDa etiquetado con TMR utilizando tampones ricos en K+a pH y nigericina indicados. (C) pH macropinosoma en células Raw264.7. Los recuadros representan la relación fluoresceína:TMR en macropinosomas individuales. Las cajas grises indican los momentos en que las celdas se cargaban con dextrano. Datos de dos experimentos independientes que contienen ≥ 80 células cada uno. Datos representados como media ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Mediciones dinámicas de eventos oxidativos y digestión de proteínas dentro de la luz de los macropinosomas. (A) Las células Raw264.7 se cargaron con dextrano de 70 kDa etiquetado con H2DCFDA y dextrano de 70 kDa etiquetado con TMR a 37 ° C durante 15 min, seguido de una persecución de 45 min a 37 ° C. Los recuadros muestran imágenes racionadas (H2DCFDA/TMR) de macropinosomas individuales. Barras de escala = 20 μm. (B) Las células Raw264.7 se cargaron con ovoalbúmina etiquetada con BODIPY y dextrano de 70 kDa con etiqueta TMR a 37 ° C durante 15 minutos, seguidas de una persecución de 45 minutos a 37 ° C. El canal TMR se utilizó para generar una máscara, que se aplicó al canal BODIPY. Los recuadros muestran células individuales. Barras de escala = 20 μm. (C) Oxidación de H2DCFDA dentro de la luz de los macropinosomas. Las células también fueron estimuladas con PMA como control positivo. Las cajas grises indican los momentos en que las celdas se cargaban con dextrano. Datos de dos experimentos independientes, cada uno con ≥ 80 células. Datos representados como media ± SEM. Cada punto de tiempo se comparó con el control PMA. Se utilizó la prueba tde un estudiante para el análisis estadístico. (D) Degradación de la ovoalbúmina etiquetada con BODIPY dentro de los macropinosomas. La concanamicina A (CcA) se utilizó como control negativo, ya que previene la activación de las hidrolasas del ácido luminal. Datos de dos experimentos independientes, cada uno con ≥ 80 células. Datos representados como media ± SEM. Cada punto de tiempo se comparó con el control CcA. Se utilizó la prueba tde un estudiante para el análisis estadístico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aunque hay una serie de protocolos para mediciones de bajo y alto rendimiento de la captación macropinocítica en macrófagos, fibroblastos e incluso Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33, muy pocos intentos se han hecho para medir la bioquímica luminal de estos compartimentos dinámicos. Esto probablemente se deba a una escasez de sondas que puedan dirigirse de manera eficiente al compartimiento macropinosomal mientras se evitan otros compartimentos endoscíticos. Aquí se describen las técnicas para apuntar a sondas fluorescentes para la medición dinámica del pH, los eventos oxidativos y la digestión de proteínas dentro de los macropinosomas.

La microscopía de fluorescencia ratiométrica ha sido la técnica primaria mediante la cual se ha medido el pH endosomal durante décadas. La fluoresceína se ha utilizado ampliamente para medir el pH endosomal y sigue siendo el fluoróforo de elección, yaque su pK permite mediciones precisas con el rango típico de valores de pH endosomal (~ pH 7.2-4.5). Aquí, el estudio empleó fluoresceína conjugada a 70 kDa dextrano para mediciones de pH específicas de macropinosomas. Una limitación de este enfoque es el período de carga de dextrano de 15 minutos durante el cual no se puede registrar el pH macropinosomal. Este período es necesario para cargar suficiente dextrano fluoróforo en el compartimento macropinosomal, pero efectivamente impide las mediciones tempranas del pH del macropinosoma. Sin embargo, esto no excluye las determinaciones de varios parámetros luminales, como la capacidad de amortiguación, la fuga relativa de protones y la potencia de bombeo de V-ATPasa, todos los cuales se derivan de mediciones de pH macropinosómico. Como se muestra en la Figura 1,también se pueden usar otros fluoróforos sensibles al pH para medir el pH, incluidos pHrodo (pKa = 6.8) y CypHer5e (pKa = 7.3). Sin embargo, como tienen unpK a significativamente más alto que la fluoresceína, no son óptimos para medir el pH endosomal a valores de pH más ácidos.

Como los macropinosomas son orgánulos altamente dinámicos y sufren una contracción significativa poco después de formar16,21, se requiere fluorescencia ratiométrica de doble fluoróforo. Los cambios en la fluorescencia debidos a cambios en el volumen de macropinosomas se corrigen mediante el uso de un fluoróforo de referencia en todos los ensayos presentados.

Los eventos oxidativos en las células se han medido utilizando una variedad de sondas sensibles a los redox, incluyendo tetrazolio nitroazul (NBT), luminol y H2DCFDA. Los enfoques basados en luminol son particularmente útiles para medir la producción de ROS en una población de células, pero son difíciles de adaptar a las mediciones específicas de orgánulos. NBT forma un depósito insoluble fácilmente visualizable llamado formazan tras la oxidación, pero oscurece las señales fluorescentes y es no lineal y difícil de localizar. H2DCFDA libera una señal fluorescente lineal tras la oxidación y se puede conjugar fácilmente con trazadores como el dextrano para mediciones específicas de orgánulos. Al unir H2DCFDA a 70 kDa dextrano, se pueden visualizar eventos oxidativos dentro de macropinosomas individuales(Figura 3B). Sin embargo, hay una advertencia a este enfoque. Como H2DCFDA es una forma modificada de fluoresceína, la señal liberada es sensible al pH. Aunque la ganancia de fluorescencia tras la oxidación es lo suficientemente grande como para ser detectada, sin duda está enmascarada por la luz ácida del macropinosoma. Una variante insensible al pH de H2DCFDA ha estado disponible comercialmente anteriormente y es preferible; sin embargo, en el momento de preparar este manuscrito, este producto ya no estaba disponible comercialmente. ROS está emergiendo como una molécula de señalización importante y se ha implicado en la remodelación de la membrana, el tráfico de organelares y, más recientemente, en el procesamiento del material por células presentadoras de antígenos para su presentación a las células T28,30. El método presentado aquí se puede utilizar para estudiar la contribución de la producción macropinosómica de ROS a estos diversos procesos fisiológicos.

La digestión de proteínas en macropinosomas es de interés en el estudio de la presentación de antígenos por las células inmunes, así como en el estudio de la adquisición de nutrientes por las células cancerosas. Por ejemplo, se cree que la digestión de proteínas endosómicas por las células dendríticas limita el conjunto de péptidos disponibles para su presentación a las células T en las principales moléculas de histocompatibilidad. Como los macropinosomas son una ruta importante de adquisición de antígenos, las mediciones de la digestión de proteínas macropinosómicas se pueden utilizar para sondear la maquinaria molecular responsable de ajustar la presentación de antígenos. Se utilizan varias herramientas disponibles comercialmente para medir la digestión de proteínas en compartimentos endosómicos. Las sondas BSA y ovoalbúmina etiquetadas con BODIPY, que se vuelven fuertemente fluorescentes después de la digestión, han demostrado ser particularmente populares. Se acoplan fácilmente a los trazadores endocíticos y se pueden dirigir a compartimentos endosomas específicos, como los fagosomas. Las sondas, sin embargo, no se acoplan fácilmente al dextrano y, por lo tanto, requieren un enfoque de colocalización. Este enfoque da como resultado la carga de todos los compartimentos endosomas, incluidos los macropinosomas, con ovoalbúmina etiquetada con BODIPY, y se utiliza una máscara para medir la degradación específica del macropinosoma. Este enfoque requiere una mejor resolución y no se amplía fácilmente para análisis más grandes y de mayor rendimiento. Las técnicas para acoplar covalentemente las herramientas de degradación de proteínas a 70 kDa de dextrano probablemente resultarán útiles y actualmente se están desarrollando en nuestro laboratorio.

A medida que el campo de la macropinocitosis continúa creciendo34, las herramientas para medir dinámicamente la bioquímica luminal de los macropinosomas, incluidos el pH, la química redox, la digestión de proteínas, las concentraciones de iones y la química de lípidos proporcionarán información sobre la biología única de estos orgánulos en rápida evolución.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a la Universidad de Calgary por su apoyo. También nos gustaría agradecer al Dr. Robin Yates por el acceso a reactivos, equipos y discusiones útiles.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Black-walled 96 well plate PerkinElmer 6005430
CypHer5e, NHS ester Cytiva PA15401
Dextran-amino 70 kDa Invitrogen D1862
DQ-ovalbumin Invitrogen D12053
FITC-dextran 70 kDa Invitrogen D1823
HBSS Gibco 14287
Nigericin Sigma Aldrich N7143
OxyBurst Green-SE Invitrogen D2935
pHrodo Red, SE Invitrogen P36600
Raw264.7 cells ATCC TIB-71
RPMI medium Gibco 11875093
SP5 Confocal Microscope Leica -
TRITC-dextran 70 kDa Invitrogen D1819
u-Dish Ibidi 81156

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References

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Medición del pH, las químicas redox y la capacidad degradativa de los macropinosomas mediante microscopía ratiométrica de fluoróforo dual
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Wilkinson, L., Canton, J. Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy. J. Vis. Exp. (174), e62733, doi:10.3791/62733 (2021).

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