Este protocolo visa descrever uma nova metodologia para medir a taxa de disparo cardíaco intrínseco usando o registro de matriz de microeletrínda de todo o tecido do nódulo sinoatrial para identificar defeitos de marcação de ritmo em camundongos. Agentes farmacológicos também podem ser introduzidos neste método para estudar seus efeitos no ritmo intrínseco.
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Artigo de método
Microelectrode Array Gravação da Taxa de Disparo de Nó Sinoatrial para identificar defeitos intrínsecos de marcação cardíaca em camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
O nódulo sinoatrial (SAN), localizado no átrio direito, contém as células marcapasso do coração, e a disfunção desta região pode causar taquicardia ou bradicardia. A identificação confiável de defeitos cardíacos de pacemaking requer a medição de frequências cardíacas intrínsecas, impedindo em grande parte a influência do sistema nervoso autônomo, que pode mascarar déficits de taxas. Os métodos tradicionais para analisar a função de marca-passo cardíaco intrínseco incluem bloqueio autônomo induzido por drogas para medir as frequências cardíacas in vivo, registros cardíacos isolados para medir as frequências cardíacas intrínsecas e registros sinoatrial de células-chave de remendo de células-passo sinoatrial para medir as taxas de disparo potenciais de ação espontânea. No entanto, essas técnicas mais tradicionais podem ser tecnicamente desafiadoras e difíceis de executar. Aqui, apresentamos uma nova metodologia para medir a taxa de disparo cardíaco intrínseco realizando gravações de matriz de microeletrínda (MEA) de preparações de nós sinoatrial de conjunto inteiro de camundongos. Os MEAs são compostos de múltiplos microeletrodos dispostos em um padrão semelhante à grade para gravação de potenciais de campo extracelular in vitro. O método descrito aqui tem a vantagem combinada de ser relativamente mais rápido, simples e mais preciso do que abordagens anteriores para registrar frequências cardíacas intrínsecas, ao mesmo tempo em que permite um interrogatório farmacológico fácil.
Introdução
O coração é um órgão complexo governado por influências cardíacas-intrínsecas e extrínsecas, como as que se originam no cérebro. O nódulo sinoatrial (SAN) é uma região definida no coração que abriga as células marcapasso (também conhecidas como células sinoatrial, ou células SA) responsáveis pela iniciação e perpetuação dos batimentos cardíacos mamíferos1,2. A frequência cardíaca intrínseca é a taxa impulsionada pelas células marcapasso sem influência por outras influências cardíacas ou neuro-humorais, mas medidas tradicionais de frequência cardíaca em humanos e animais vivos, como eletrocardiogramas, refletem....
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Protocolo
Todos os procedimentos experimentais aqui descritos foram realizados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH), conforme aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Metodista do Sul.
1. Revestindo a matriz multieletrísda (MEA) para gravação
- Faça um buffer de borate de 25 mM.
- Dissolver 0,953 g de Na2B4O7·10 H2O em 80 mL de água destilada.
- Ajuste o pH para 8,4 com HCl e, em seguida, adicione água destilada a um volume final de 100 mL.
- Faça uma solução de estoque de 0,1% de poliet....
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Resultados
Depois de permitir que o tecido se aclimate no prato por 15 minutos, 10 traços de um min são registrados. Nosso protocolo atual registra atividade por mais de uma hora, mas registramos padrões estáveis de disparo por ≥4 h em dados não mostrados aqui. Se uma preparação experimental for boa para a coleta de dados, cada canal de gravação deve exibir formas de onda recorrentes consistentes e espaçadas uniformemente (ou seja, picos) de forma uniforme para um determinado canal(Figura 11D). Essas f.......
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Discussão
Praticar e dominar o processo de dissecção de SAN é imprescindível, uma vez que o tecido é frágil e o tecido saudável é necessário para uma gravação bem sucedida. Durante a dissecção da SAN, a orientação correta é essencial para obter a região adequada do tecido. No entanto, a orientação original do coração pode ser facilmente perdida durante o processo de dissecção, o que complica esse esforço. Portanto, para garantir a orientação adequada à esquerda e à direita, o atria deve ser inspecionado visualmente. Normalmente, o.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, números de subvenções R01NS100954 e R01NS099188.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 4-Aminopiridina | Sigma | A78403-25G | |
| agulha de seringa de calibre 22 | Fisher Scientific | 14-826-5A | Usado para dissecação |
| agulha de seringa de calibre 23 | Fisher Scientific | 14-826-6C | Usado para dissecação |
| placas de Petri de 60mm | Genesee Scientific | 32-105G | |
| 500mL Garrafa de Pyrex | Fisher Scientific | 06-414-1C | Usado para armazenar soluções |
| 1000 mL Garrafa de Pyrex | Fisher Scientific | 06-414-1D | Usado para armazenar soluções |
| Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
| Cloreto de cálcio dihidratado (CaCl2· 2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
| Tesoura Castroviejo, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| D-(+)-Glicose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Aquisição de Dados PC | CPU: Intel Xeon ou Intel Core i7, Memória: 8GB, HDD: 1TB, Placa gráfica: NVIDIA ou On-board, Tela: 1920x1080 | ||
| Microscópio de Dissecção | Jenco | ||
| Pinos de Dissecação | Ferramentas de Ciência Fina | 26002-20 | |
| Dumont #2 Pinça de Laminectomia | Ferramentas de Ciência Fina | 11223-20 | |
| Dumont #55 Pinça | de Ciência Fina | 11295-51 | |
| Pinça Graefe Extra Fina | Ferramentas de Ciência Fina | 11152-10 | |
| Câmara de Vidro | Grainger | 49WF30 | Usado para eutanásia de camundongo |
| Kit de Âncora de Harpa | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
| HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | usado para balanceamento |
| de pH Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Heparina | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Microscópio Invertido | Motic | AE2000 | |
| Isoflurano | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Fita de Laboratório | Fisher Scientific | 15-950 | |
| Luz para Microscópio de Dissecção | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
| Cloreto de magesium (MgCl2) | Amplificador de cabeça Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
| MED64 | MED64 | MED-A64HE1S | |
| Amplificador Principal MED64 | MED64 | MED-A64MD1A | |
| MED64 Tampa de Perfusão | MED64 | MED-KCAP01 | |
| MED64 Kit de Suporte de Tubo de Perfusão | MED64 | MED-KPK02 | |
| MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
| Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
| Matriz de microeletrodos (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
| Mobius Software | WitWerx Inc. | Software específico para o MED64 | |
| NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Usado para balanceamento de pH |
| Solução salina normal | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
| Pincel | Fisher | Scientific NC1751733 | |
| Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
| Bomba peristáltica | Gilson | F155009 | |
| Tubulação de bomba peristáltica | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8 '' Diâmetro Interior |
| Polietilenoimina | Sigma | P3143 | |
| Cloreto de potássio (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Fosfato de potássio monobásico (KH2< / sub>PO4< / sub>) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
| Sódio Bicarbonato | Sigma | S6297 | |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sylgruard Elastômero Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0,5 KG | |
| Fosfato de Sódio Monobásico | Sigma | S6566 | |
| Tetraborato de sódio | Sigma | S9640 | |
| Tesoura cirúrgica | de ciências | finas14074-09 | |
| Pipetas de Transferência (3mL graduadas) | Samco Scientific | 225 |
Referências
- Marionneau, C., et al. Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart. Journal of Physiology. 562 (1), 223-234 (2005).
- Josea, A. D., Collison, D. The normal ran....
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Reimpressões e permissões
