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Artigo de método

Preparação da Solução Naringenin para Aplicação In Vivo

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DOI:

10.3791/62736

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10 de agosto de 2021

 ,  , 
1Spine Research Institute, Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Integrative Medicine, Huashan Hospital, Fudan University

Neste artigo

Resumo

Aqui, o protocolo apresenta o preparo da solução de naringenina para administração intraperitoneal in vivo. A naringenina é totalmente dissolvida em uma mistura de dimetilsulfóxido, Tween 80, e solução salina. Os efeitos osteoporóticos antidiabéticos da naringenina foram avaliados por teste de glicose no sangue, coloração de fosfatase ácida resistente ao tartarato e ensaio de imunoabsorção enzimática.

Resumo

A preparação de uma solução composta (fitoquímica) é uma etapa negligenciada, mas crítica, antes de sua aplicação em estudos como a triagem de medicamentos. A solubilização completa do composto é necessária para o seu uso seguro e resultados relativamente estáveis. Aqui, um protocolo para o preparo de solução de naringenina e sua administração intraperitoneal em uma dieta rica em gordura e modelo diabético induzido por estreptozotocina (STZ) é demonstrado como exemplo. Uma pequena quantidade de naringenina (3,52-6,69 mg) foi usada para testar sua solubilização em solventes, incluindo etanol, dimetilsulfóxido (DMSO) e DMSO mais Tween 80 reconstituído em solução salina fisiológica (PS), respectivamente. A solubilização completa do composto é determinada observando a cor da solução, a presença de precipitados após a centrifugação (2000 x g por 30 s) ou permitindo que a solução permaneça por 2 h à temperatura ambiente (RT). Após a obtenção de um composto estável/solução fitoquímica, a concentração/quantidade final do composto necessária para estudos in vivo pode ser preparada numa solução-mãe apenas com solvente (sem PS) e, em seguida, diluída/misturada com PS conforme desejado. Os efeitos osteoporóticos antidiabéticos da naringenina em camundongos (administração intraperitoneal a 20 mg/kg de p.c., 2 mg/mL) foram avaliados pela medição da glicemia, massa óssea (micro-TC) e taxa de reabsorção óssea (coloração TRAP e ELISA). Os pesquisadores que procuram preparações detalhadas de soluções orgânicas / fitoquímicas se beneficiarão dessa técnica.

Introdução

Com o aumento dos estudos sobre o uso de compostos fitoquímicos para triagem de medicamentos, vale a pena dar atenção às abordagens para preparar soluções fitoquímicas para avaliar seus efeitos ótimos. Muitos aspectos, como a metodologia de dissolução, dosagem e concentração, devem ser considerados ao preparar o composto1.

A dissolução à base de solvente é amplamente utilizada para a preparação de compostos orgânicos1. Os solventes comumente usados incluem água, óleo, dimetilsulfóxido (DMSO), metanol, etanol, ácido fórmico, Tween, glicerina, etc2. Embora uma suspensão com substâncias não dissolvidas seja aceitável quando o composto é administrado por gavagem gástrica, um soluto totalmente dissolvido é crítico para administração intravenosa. Como a solução oleosa, a suspensão e a emulsão podem causar embolias capilares, sugere-se uma solução aquosa para o preparo de compostos, especialmente quando se administram injeções intravenosas, intramusculares e intraperitoneais3.

A faixa de dose efetiva varia entre os compostos e até mesmo entre as doenças tratadas com o mesmo composto. As determinações da dose efetiva e segura e da concentração dependem da literatura e de experimentos preliminares4. Aqui, a preparação do composto naringenina é demonstrada como um exemplo.

A naringenina (4,5,7-trihidroxi-flavanona), um composto polifenólico, tem sido estudada no tratamento da doença por suas atividades hepatoprotetoras5, antidiabéticas6, anti-inflamatórias7 e antioxidantes8. Para aplicações in vivo, a administração oral de naringenina é comumente usada. Estudos prévios relataram o preparo de solução de naringenina em carboximetilcelulose a 0,5%-1%, dose de metilcelulose a 0,5%, DMSO a 0,01% e solução salina fisiológica (PS) a 50-100 mg/kg, administrada por gavagem oral 9,10,11,12. Além disso, outros estudos relataram a suplementação de naringenina com ração a 3% (em peso/m) para ingestão oral na dose de 3,6 g/kg/d13,14. Estudos também relataram o uso de etanol (0,5% v/v), PS e DMSO para dissolver naringenina para injeção intraperitoneal a 10-50 mg/kg15,16,17,18. Em um estudo de epilepsia do lobo temporal, camundongos receberam uma injeção de naringenina suspensa em carboximetilcelulose a 0,25% dissolvida em PS19. Embora esses estudos relatem o uso de diferentes solventes para preparar soluções de naringenina, mais detalhes, como o estado de dissolução e a resposta animal, não foram relatados.

Este protocolo introduz um procedimento para preparar solução de naringenina para aplicação in vivo na osteoporose induzida por diabetes. A preparação da solução injetável inclui a preparação de solventes e compostos, estimativa de dosagem, processo de dissolução e filtração. A dosagem foi determinada com base em pesquisas bibliográficas e experimentos preliminares, monitorando camundongos após a administração de injeções todos os dias durante 3 dias e modificando a dosagem de acordo com os comportamentos dos camundongos. A concentração final escolhida (20 mg/kg de p.c.) foi administrada por via intraperitoneal 5 dias por semana durante 8 semanas em uma dieta rica em gordura e camundongos diabéticos induzidos por estreptozotocina (STZ)20,21. Os efeitos da naringenina na osteoporose diabética foram avaliados por meio de testes de glicose no sangue, micro-TC, coloração de fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) e ensaio imunoenzimático (ELISA).

No geral, observou-se que a naringenina em uma faixa de concentração de 40-400 mg/mL não se dissolveu completamente em etanol ou DMSO ou 5% (etanol ou DMSO) mais 95% PS (v/v). No entanto, a naringenina se dissolveu completamente em uma mistura de 3,52% de DMSO, 3,52% de Tween 80 e 92,96% de PS. O procedimento detalhado ajudará os pesquisadores a preparar o composto como uma solução de injeção para aplicação in vivo.

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Protocolo

As investigações descritas estavam em conformidade com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Conselho Nacional de Pesquisa e foram aprovadas pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai. Ao realizar os experimentos, jalecos, luvas nitrílicas descartáveis e óculos de proteção são necessários para fins de segurança.

1. Preparação de solventes e estimativa da naringenina necessária para aplicação in vivo

  1. Preparar os seguintes solventes: Tween-80 (faixa de concentração final: 0,5%-1%), DMSO, glicerina (faixa de concentração final: 15%-20%), etanol (faixa de concentração final: 12% para injeção intramuscular)22 e 0,9% PS.
  2. Estime a quantidade de naringenina necessária com base na dose, número de camundongos e frequência de injeção.
    1. Encomende 10 ratos (C57BL/6, macho, 5 semanas de idade, SPF) para administrar naringenina 5 dias por semana durante 8 semanas. Mantenha os ratos em condições específicas livres de patógenos (SPF).
      NOTA: A dose necessária para a injeção intraperitoneal é de 20 mg/kg de p.c.23.
    2. Pesar 160 mg de naringenina com base no seguinte cálculo: 20 mg/kg x 0,02 kg/rato x 10 ratinhos x 5 dias/semana x 8 semanas = 160 mg.
  3. Calcular a concentração de naringenina a injetar in vivo.
    1. Prepare o volume recomendado com base no peso corporal dos camundongos. O volume recomendado de naringenina aplicado a cada rato é de 1% do peso corporal (0,3 ml). Neste experimento, foram utilizados 0,2 mL por camundongo.
    2. Calcule o volume total: 0,2 mL por camundongo x 10 camundongos x 5 dias/semana x 8 semanas = 80 mL.
    3. Calcular a concentração do Naringenina em stock: 160 mg/80 ml solventes = 2 mg/ml.
    4. Calcule o volume para cada dia: 0,2 mL por rato x 10 camundongos = 2 mL.

2. Dissolução

  1. Solução de etanol
    1. Para preparar a solução de naringenina a 2 mg/mL, pesar 3,52 mg de naringenina e adicioná-la a um tubo de 2,0 mL.
      NOTA: Para atingir uma concentração de 2 mg/mL, o volume total necessário será de 1760 μL (cálculo: 3,52 mg/1760 μL = 2 mg/mL).
    2. Gire rapidamente para baixo (2000 x g por 30 s) para fazer com que o pó de naringenina se deposite no fundo do tubo (Figura 1A).
    3. Adicionar 8,8 μL de etanol a 100% ao tubo para preparar uma solução a 0,5% (v/v) em relação ao volume total necessário2. Naringenin não se dissolve completamente (Figura 1B).
    4. Continue a adicionar 79,2 μL de etanol a 100% ao tubo para preparar uma solução a 5% (v/v) em relação ao volume total necessário (cálculo: (79,2 μL + 8,8 μL) / 1760 μL x 100% = 5%). Naringenin não se dissolve completamente (Figura 1B).
    5. Adicionar 1672 μL de 0,9% PS ao tubo contendo 5% de etanol, conforme descrito na etapa 2.1.4. Isso produzirá uma emulsão (Figura 1D). Centrifugar (2000 x g por 30 s) a solução para verificar se a naringenina está completamente dissolvida na solução. Precipitados brancos de naringenina não dissolvida aparecem na solução (Figura 1E).
  2. Solução DMSO
    1. Para preparar a solução de naringenina a 2 mg/mL, pesar 3,95 mg de naringenina e adicionar a um tubo de 2,0 mL.
      NOTA: Para atingir uma concentração de 2 mg/mL, o volume total necessário será de 1975 μL (cálculo: 3,95 mg/1975 μL = 2 mg/mL).
    2. Gire rapidamente para baixo (2000 x g por 30 s) para fazer o pó de naringenina se depositar no fundo do tubo.
    3. Adicionar 9,8 μL de DMSO ao tubo para preparar uma solução a 0,5% (v/v) (cálculo: 9,8 μL/1975 μL x 100% = 5%). Naringenin se dissolve completamente (Figura 2A).
    4. Adicionar 88,2 μL de DMSO ao tubo para preparar uma solução a 5% (v/v) em relação ao volume total necessário (cálculo: (88,2 μL + 9,8 μL) /1975 μL x 100% = 5%). Naringenin se dissolve completamente (Figura 2B).
    5. Adicionar 1877 μL de 0,9% PS (v/v por cento de 95%) à solução preparada no passo 2.2.4. Uma emulsão é produzida (Figura 1C). Centrifugar (2000 x g por 30 s) a solução para verificar se a naringenina está completamente dissolvida na solução. Precipitados brancos de naringenina não dissolvida aparecem na solução (Figura 1D).
  3. Solução Tween-80 e DMSO
    1. Para preparar a solução de naringenina a 2 mg/ml, pesar 6,69 mg de naringenina e adicionar num tubo de 5,0 ml.
      NOTA: Para atingir a concentração final de 2 mg/mL, o volume total de solução necessário será de 3345 μL (cálculo: 6,69 mg/3345 μL = 2 mg/mL).
    2. Gire rapidamente para baixo (2000 x g por 30 s) para fazer o pó de naringenina se depositar no fundo do tubo.
    3. Adicionar 117,7 μL de DMSO para preparar uma solução a 3,5% (v/v) em relação ao volume total necessário (cálculo: 117,7 μL /3345 μL x 100% = 3,5%). Naringenin se dissolve completamente (Figura 3A)
    4. Adicionar 117,7 μL de Tween 80 à solução preparada no passo 2.3.3 para obter 3,5% (v/v) de Tween 80 e 3,5% (v/v) de DMSO. Observe a dissolução completa da naringenina (Figura 3B)
    5. Adicionar lentamente a solução preparada na etapa 2.3.4 a um tubo de 5,0 mL contendo 3109,6 μL de PS a 0,9% (v/v por cento de 93%) e agitar bem para obter uma solução aparente de naringenina (Figura 3C).
    6. Deixar a solução preparada na etapa 2.3.5 permanecer à temperatura ambiente (RT) por 2 h. A solução ainda é aparente sem quaisquer precipitados visíveis (Figura 3D).
  4. Preparação da solução de naringenina para administração in vivo
    1. De acordo com a etapa 1.2.2, pesar 160 mg de naringenina (160 mg / 2 mg / mL = 80 mL).
    2. Adicionar 2,8 mL de DMSO para obter solução a 3,5% (v/v) (cálculo: 2,8 mL / 80 mL x 100% = 3,5%)
    3. Em seguida, adicione 2,8 mL de Tween 80 à solução preparada na etapa 2.4.2 para atingir 3,5% (v/v) Tween 80 e 3,5% (v/v) de DMSO.
    4. Aliquotar a solução preparada na etapa 2.4.3 em quatro tubos, 1,4 mL por tubo [(2,8 mL + 2,8 mL) / 4 = 1,4 mL].
    5. Alíquota de 18,6 mL de 0,9% PS a cinco tubos de 15 mL.
    6. Conservar a solução preparada nas fases 2.4.3 (solução-mãe) e 2.4.5 a 4 °C (2,8 ml + 2,8 ml + 18,6 ml x 4 = 80 ml).
    7. Tomar 140 μL da solução-mãe (passo 2.4.3) e misturá-la com 1860 μL de PS a 0,9% para preparar 2 ml de solução de naringenina durante 1 dia de administração.
    8. Filtrar a solução através de um filtro de 0,2 μm.

3. Administração da solução de naringenin

  1. Manuseio e contenção
    1. Pulverize a gaiola e as mãos com álcool 70-75% antes de abrir a tampa. Levante o rato pela base da cauda e coloque-o sobre uma superfície sólida para posicionar a cauda suavemente para trás.
    2. Segure o pescoço atrás das orelhas com o polegar esquerdo e o dedo indicador e posicione a cauda entre o dedo pequeno e o dedo anelar. Mantenha o rato em decúbito dorsal com a sua extremidade posterior ligeiramente elevada.
  2. Injecção
    1. Segure a pele traseira do rato para que a pele abdominal fique tensa.
    2. Empurre a agulha (seringa de insulina) em um ângulo de 10 ° entre a agulha e a superfície abdominal, no quadrante inferior direito ou esquerdo do abdômen para evitar atingir a bexiga, o fígado ou outros órgãos internos.
    3. Passe a agulha por via subcutânea em uma direção craniana por 3-5 mm e, em seguida, insira-a em um ângulo de 45 ° na cavidade abdominal.
    4. Quando a agulha passar pela parede abdominal e a resistência desaparecer, realize uma aspiração para confirmar que nenhum material de refluxo é retirado. Em seguida, empurre lentamente a solução.
    5. Após a injeção, puxe lentamente a agulha para fora e gire-a ligeiramente para evitar vazamentos. O volume recomendado é de 50-100 μL/10 g.
    6. Descarte as sobras de Naringenin em um recipiente de risco biológico.

4. Teste de glicose no sangue

NOTA: Teste a glicose no sangue 1 dia antes da injeção e 1 e 2 meses após a injeção.

  1. Jejue os ratos por 15 h antes do teste de glicose no sangue. A água pode continuar a ser fornecida.
  2. Abra as tiras de teste e marque a data. Uma vez abertas, use as tiras de teste dentro de 3 meses. Conservar as tiras de ensaio a 2-30 °C. Feche bem a tampa depois de remover a tira para evitar a formação de umidade.
  3. Coloque o animal na câmara de indução. Ligue o vaporizador a um nível de indução de 4% para o isoflurano e 4 L/min para o oxigénio. Após o animal estar totalmente anestesiado, manter o anestésico com o cone nasal e o anestésico a um nível de 1,5% para isoflurano e 0,4 L/min para oxigênio.
  4. Limpe a cauda com bolas de algodão / cotonetes embebidos em álcool de 70% a 75%.
  5. Começando pelo ponto mais baixo da cauda, faça uma pequena punção na veia lateral da cauda com uma picada de agulha 25G e esprema uma gota de sangue.
  6. Limpe a gota de sangue com um papel de seda.
  7. Esprema outra gota de sangue e colete-a na borda de uma tira de teste.
  8. Leia e registre o resultado exibido no medidor de glicose.
  9. Para parar o sangramento, aperte a cauda do rato com uma gaze estéril e limpe a área com álcool a 75%.
  10. Amostras adicionais podem ser obtidas por uma técnica semelhante movendo-se para cima da cauda cranialmente.

5. Coloração TRAP

  1. Preparação de slides
    1. Realize testes de glicose no sangue em jejum nos ratos uma vez por semana. Quando os níveis de glicose no sangue estiverem ≥ 11,1 mmol / L (indicativo de camundongos com diabetes tipo II bem-sucedidos modelo 24), eutanasie os camundongos usando CO2, seguido de disclocação cervical, e colete o 4º-6º lombar (L4-L6) (nenhuma eutanásia é realizada durante o teste de glicose no sangue em jejum).
    2. Fixe as amostras de L4-L6 com paraformaldeído a 4% por 24 h (certifique-se de que o volume de paraformaldeído seja >20x o volume do tecido) e, em seguida, lave por 2 h em fluxo contínuo de água da torneira.
    3. Para descalcificar as amostras, mergulhe-as em uma solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 10% por 2 semanas no RT em condição estática até que as amostras sejam amolecidas. Certifique-se de que o volume da solução descalcificante é de 20-30 vezes o volume do tecido/amostra. Mude a solução EDTA a cada dois dias.
    4. Desidratar a amostra com um desidratador.
      1. Coloque os espécimes no processamento de tecidos incorporando. Numere o usando um lápis.
      2. Defina o programa de desidratador da seguinte forma: álcool a 75% por 2 h, álcool a 85% por 1 h, álcool a 95% por 1 h, álcool a 95% por 2 h, etanol anidro (I) por 2 h, etanol anidro (II) por 2 h, etanol anidro (III) por 2 h, xileno (I) por 1 h, xileno (II) por 1 h, xileno (III) por 1 h, xileno (III) por 1 h, cera de parafina (I) por 2 h, e cera de parafina (II) por 2 h, a RT.
    5. Incorpore as amostras em cera de parafina.
      1. Adicionar cera de parafina ao tabuleiro de da estação de incorporação de parafina e aquecer a 60 °C. Imergir os espécimes desidratados durante, pelo menos, 2 h.
      2. Coloque o de tecido na bandeja do e pré-aqueça.
      3. Adicionar cera de parafina ao reservatório de parafina e aquecer a 60 °C.
      4. Após 2 h, leve o de tecido e os espécimes para a área de trabalho. Despeje a cera de parafina pré-aquecida do reservatório de parafina no de tecido. Coloque a amostra na cera de parafina, certifique-se de que a cera de parafina cubra completamente o tecido e, em seguida, mova imediatamente o para uma estação de gelo.
      5. Use um micrótomo para cortar as amostras embutidas em parafina em seções de 5-6 μm. Desdobre as seções em água morna a 40 °C por menos de 10 s. Colete as seções em lâminas de vidro revestidas com APS (amino silano). Secar as lâminas a RT durante 1 h e, em seguida, movê-las para um forno regulado a 60 °C durante a noite.
  2. Preparação do reagente TRAP
    1. Preparar solução básica de incubação de estoque: Dissolver 9,2 g de acetato de sódio anidro, 11,4 g de ácido tartárico L-(+) e 2,8 mL de ácido glacial em 1000 mL de água destilada. Ajuste o pH para 4,7-5,0 e armazene no RT por até 6 meses.
    2. Preparar solução de naftólio-éter: Dissolver 0,1 g de fosfato de naftol AS-BI em 5 ml de éter monoetílico de etilenoglicol. Conservar a 4 °C durante 5 semanas.
    3. Preparar solução de nitrito de sódio: Dissolver 1 g de nitrito de sódio em 25 mL de água destilada. Conservar a 4 °C.
    4. Preparar corante Pararosanilina: Adicionar 1 g de base de pararosanilina a 20 mL de HCl 2N (83 mL de HCl em 417 mL de água). Use uma placa de agitação para dissolver a base e filtrá-la antes de usá-la.
  3. Coloração TRAP
    1. Encher dois frascos Coplin com 50 mL de solução básica de incubação de estoque e colocar em forno a 37 °C por 2 h.
    2. Pegue um frasco de Coplin e adicione 0,5 mL de solução de éter de naptol.
    3. Colocar as lâminas no frasco de Coplin e incubar a 37 °C durante 1 h.
      Observação : Prepare pelo menos três slides para cada grupo.
    4. Poucos minutos antes do término do tempo de incubação, adicione 1 mL de solução de nitrito de sódio e 1 mL de corante pararosanilina. Misture suavemente por 30 s e deixe por 2 min.
    5. Adicionar a solução preparada na fase 5.2.2 ao outro frasco de Coplin pré-aquecido que contém a solução-mãe de base. Misture bem a solução e insira as lâminas do frasco de Coplin na etapa 5.3.3.
    6. Incubar por 15-20 min em RT.
    7. Lave as fatias em outro frasco Coplin com 200 mL de PBS por 5 min.
    8. Contra-manchar as fatias com 100% de hematoxilina por 30 s em um frasco de Coplin.
    9. Desidrate as fatias com álcool 85%, 95% e 100% (200 mL) por 2 min cada e trate em xileno (200 mL) por 2 min por 3x. Use frascos Coplin para realizar cada etapa.
    10. Prenda a seção no vidro da tampa com uma tampa usando resina. Certifique-se de evitar o aprisionamento de bolhas de ar.

6. ELISA

  1. Preparação da amostra
    1. Remova os tecidos moles do fêmur e da tíbia do rato. Limpe os ossos com gaze.
    2. Colocar as amostras ósseas num tubo de microcentrífuga de 1 ml e armazenar os tubos de amostra a -80 °C.
      NOTA: As amostras também podem ser armazenadas em um tanque de nitrogênio líquido por não mais de 6 meses.
    3. Pesar a amostra óssea. Diluir com 0,9% PS na proporção de 1:10. Por exemplo, dilua 0,1 g de osso com 1 mL de PS.
    4. Adicione grânulos de zircônia de 3 mm no tubo e triture as amostras 3x a 70 Hz por 30 s com descanso de 20 s no meio.
    5. Centrifugar as amostras a 4 °C e 12.000 x g durante 5 minutos. Colete o sobrenadante.
  2. Kit de ensaio ELISA
    NOTA: Execute ELISA de acordo com o protocolo de ensaio especificado pelo fabricante.
    1. Adicionar 100 μL de cada diluição de padrão, em branco e amostra nos poços apropriados. Incubar durante 90 min a 37 °C.
    2. Decantar o líquido de cada poço e adicionar 100 μL de solução de trabalho de anticorpos de detecção biotinilados. Incubar durante 1 h a 37 °C.
    3. Decantar a solução, adicionar 350 μL de tampão de lavagem a cada alvéolo. Mergulhe por 1 min, repita 3x.
    4. Adicione 100 μL de solução de trabalho conjugado HRP a cada poço. Incubar durante 30 min a 37 °C.
    5. Decantar a solução. Repetir o processo de lavagem 5x conforme descrito na etapa 6.2.3.
    6. Adicionar 90 μL do reagente do substrato. Incubar durante 15 min a 37 °C protegido da luz.
    7. Adicionar 50 μL da solução de paragem.
  3. Use um leitor de placas para registrar a absorvância de cada poço a 450 nm.
  4. Geração de curva padrão
    1. Traçar os respectivos valores médios de absorvância em relação às concentrações de proteínas diluídas em série.
    2. Junte os pontos para criar a melhor curva de ajuste. Use qualquer aplicativo de computador apropriado (planilha) para gerar a equação de curva padrão.
  5. Substituir o valor de absorvância de cada amostra na equação da curva padrão para obter a concentração da respectiva amostra.

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Resultados

Verificou-se que o peso corporal dos camundongos diabéticos alimentados com dieta rica em gordura e induzidos por STZ diminuiu quando comparado com o dos grupos controle de 0-8 semanas após o tratamento com STZ. A perda de peso dos ratos tratados com naringenina foi significativa em comparação com os ratos não tratados (grupo STZ) na semana 4. Os grupos controle e STZ foram administrados com o mesmo volume de PS (Tabela 1). O nível de glicose no sangue em ratos diabéticos aumentou drasticamente dentro de...

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Discussão

A preparação de solução fitoquímica é a base para a sua aplicação in vivo. Neste protocolo, o preparo da solução de naringenina foi demonstrado por meio do uso de diferentes solventes, como etanol, DMSO, Tween 80 e PS a 0,9%. A solução em estado completamente dissolvido precisa ser monitorada ainda mais, permitindo que permaneça à temperatura ambiente por algumas horas prolongadas e, em seguida, filtrada antes de ser usada in vivo.

A determinação de solventes é um passo críti...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81973607 e 81573992).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microtubos de 1,5 mLCorning Science (Wujiang) Co.23218392Holding líquido
Desidratador AutomáticoLeica Microsystems (Shanghai) Co.LEICA ASP 300SDesidratar amostras
Tiras de teste de glicose no sangueJohnson & Johnson (China) Medical Equipment Co.
Centrífuga4130392 MIULABCentrífuga de minutosSolução centrífuga
DesidratadorLeica Microsystems (Shanghai) Trading Co.LEICA  ASP300SDesidratação
DMSOSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Kit dede E918BA0041 Co-Solvente
Elabscience Biotechnology Co.,LtdMouse COL1(Colágeno Tipo I) Kit ELISA: E-EL-M0325c
Mouse  Kit CTX I ELISA: E-EL-M0366c
Kit PICP ELISA para Mouse: E-EL-M0231c
Kit ELISA PINP para Mouse: E-EL-M0233c
Etanol absolutoSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009218Co-Solvente
Éter monoetílico de etilenoglicolSangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.A501118-0500Coloração TRAP
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009617descalcificação
Merck Millpore LTD.Millex-GP, 0,22 e micro; m solução de filtro
Ácido glacialSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10000218coloração TRAP Medidor de
glicoseJohnson & Johnson (China) Medical Equipment Co.One Touch Ultra VueNúmero de série: COJJG8GW
MoedorShanghaijingxin Tecnologia ExperimentalTissuelyser-24
HematoxilinaNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteD005Coloração TRAP
Seringa de insulinaShanghai Kantaray Medical Devices Co.0,33 mm x 13 mm, RW LBInjeção intraperitoneal
L- (+) ácido tartáricoSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd100220008Microscópio de coloração
TRAP Microscópio de observação OLYMPUSsz61
Micrótomode observação Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co.LEICA RM 2135
Seção Mini centrífugaHangzzhou Miu Instruments Co., Ltd.  Centrífuga Mini-6KC
Naftol AS-BI fosfatoSIGMA-ALDRICHBCBS3419coloração
NaringeninJiangsu Yongjian Pharmaceutical Co., Ltd102764
Estação de incorporação de parafinaLeica Microsystems (Shanghai) Co.LEICA  EG 1150 H, LEICA  EG 1150 CAmostras de incorporação
Base de pararosanilinaBBI Life SciencesE112BA0045coloração TRAP
Pipetaseppendorf2– 20 µ L, 100– 1000 µ L, 20– 200 µ Leitor de Placas Líquidas para transferência
BioTek Instruments USA, Inc.Leitor de imagem BioTek CYTATION 3ELISA
ResinShanghai Yyang Instrument Co., Ltd.Bálsamo neutroTRAP coloração
salina (0,9 PS)Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,LtdA6E1323Solvente
Acetato de sódio anidroSinopharm Chemical ReagentCo., LtdMerck-1.06268.0250 | 250gTRAP coloração
Nitrito de sódioSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10020018TRAP coloração
Tween-80Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Aemulsionante
de E819BA0006 perla amoedura11079125z 454gShanghaijingxin
ensaio ELISA Filtro de de soluto zircônia do experimental de

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