É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Produção rápida, acessível e descomplicada de lysate sem células bacterianas

4.6K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/62753

⸱

29 de outubro de 2021

 ,  ,  , 
1Biocircuits Institute, University of California, San Diego, 2Present address, Kyoto Institute of Technology, 3Present address, Vertex Pharmaceuticals, 4Department of Bioengineering, University of California, San Diego, 5Molecular Biology Section, University of California, San Diego

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método rápido e simples para produzir lisenato bacteriano para expressão genética livre de células, usando uma cepa projetada de Escherichia coli e exigindo apenas equipamentos de laboratório padrão.

Resumo

A expressão genética livre de células oferece o poder da biologia sem as complicações de um organismo vivo. Embora existam muitos desses sistemas de expressão genética, a maioria é bastante cara para comprar e/ou requer equipamentos especiais e experiência finamente aprimorada para produzir efetivamente. Este protocolo descreve um método para produzir lisesato bacteriano livre de células que suporta altos níveis de expressão genética, utilizando apenas equipamentos de laboratório padrão e exigindo processamento mínimo. O método utiliza uma cepa Escherichia coli produzindo uma endolise que não afeta o crescimento, mas que lises eficientemente uma pelota celular colhida após um simples ciclo de congelamento. O único processamento adicional necessário é uma breve incubação seguida de centrifugação para limpar o autolise de detritos celulares. Circuitos genéticos dinâmicos podem ser alcançados através da expressão heteróloga da protease ClpX nas células antes da colheita. Uma cepa de E. coli sem o gene lacZ pode ser usada para aplicações de biossensão de alta sensibilidade e livre de células usando uma leitura colorimétrica ou fluorescente. Todo o protocolo requer apenas 8-9 horas, com apenas 1-2 horas de trabalho prático desde a inoculação até a conclusão. Ao reduzir o custo e o tempo para obter o lise livre de células, este método deve aumentar a acessibilidade da expressão genética livre de células para várias aplicações.

Introdução

A expressão genética em lises livres de células tem várias vantagens sobre o uso de células vivas1,2,3,4. Os lysatos podem ser facilmente modificados bioquimicamente e usados em condições que podem ser prejudiciais ou impossíveis de alcançar em células vivas. Circuitos de expressão genética não têm que lutar ou competir com processos biológicos hospedeiros, e testar novos circuitos genéticos é tão simples quanto adicionar DNA. Por essas razões, a expressão genética livre de células encontrou várias aplicações, desde biosensores5,6 até a rápida prototipagem de circuitos genéticos sintéticos7,8 até o desenvolvimento de células artificiais9. A maioria da expressão genética livre de células utiliza lises celulares altamente processadas, geralmente exigindo protocolos longos e complexos, equipamentos especializados e/ou etapas sensíveis que podem levar a variações significativas entre usuários e lotes10,11.

Este artigo descreve um método simples e eficiente para produzir lysate livre de células que requer processamento e experiência mínimos(Figura 1A)12. O método conta com células E. coli que são projetadas para lise após um simples ciclo de congelamento. As células expressam uma endolise de lambda de phage que degrada a parede celular. À medida que as células crescem, essa endolise permanece no citoplasma, sequestrado da parede celular. No entanto, um simples ciclo de congelamento interrompe a membrana citoplasmática, liberando a endolise no periplasma, onde degrada a parede celular, resultando em rápida lise celular. O protocolo pode ser concluído com apenas algumas horas de trabalho prático e requer apenas um freezer, uma centrífuga capaz de 30.000 × g (para resultados ideais; velocidades mais baixas podem ser usadas com mais cuidado para não perturbar a pelota), uma batedeira de vórtice e uma solução tampão simples. O lisete funcional pode até ser produzido secando as células e reidratação-as in situ. No entanto, este método produz lises com menor atividade, presumivelmente devido aos detritos celulares restantes.

Os lises são altamente ativos para a expressão genética livre de células, e podem ser aprimorados de várias maneiras, dependendo do uso final. A taxa de síntese proteica pode ser aumentada concentrando o liseto usando concentradores de spin padrão. O DNA linear pode ser protegido da degradação adicionando proteína GamS purificada. A degradação proteica, necessária para dinâmicas de circuitos mais complexas, como a oscilação, pode ser alcançada co-expressando um hexamer ClpX na cepa produtora de auto-lysato13. Finalmente, as leituras visuais baseadas em LacZ são habilitadas usando uma cepa de massa automática sem lacZ. No geral, este método produz um lysate altamente ativo livre de células que é adequado para uma ampla gama de aplicações.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. Prepare a mídia e os buffers.

  1. Prepare o meio 2xYTPG.
    1. Misture 62 g 2xYT em pó, 5,99 g de fosfato de potássio monobásico, 13,93 g de fosfato de potássio dibasic e água desionizada a 2 L.
    2. Autoclave no ciclo líquido com um tempo de exposição de 30 min14.
    3. A 400 mL de mídia 2xYTP a partir de 1.1.2, adicione 7,2 g D-glicose (dextrose) e misture até dissolver.
    4. Esterilize o filtro através de um filtro de 0,2 μm.
  2. Prepare o buffer S30A.
    1. Mix Tris-HCl (pH 7.7, 50 mM concentração final), glutamato de potássio (final de 60 mM) e glutamato de magnésio (final de 14 mM).
    2. Ajuste o pH para 7,7 usando 10 M KOH.
  3. Preparar a solução 1 (ver Tabela 1).
    1. Resuspend 4-(2-hidroxitila)-1- ácido piperazineetanesulfônico (HEPES) em 2 mL de água.
    2. Ajuste o pH para 8.0 usando KOH.
    3. Adicione todos os outros componentes da Tabela 1.
    4. Ajuste o pH para 7,6 usando 10 M KOH. Esterilizar filtros.
  4. Prepare a solução de pré-10x (ver Tabela 2).
    1. Misture todos os componentes na Tabela 2.
    2. Ajuste o pH para 7,5 usando KOH.
    3. Alíquota e congelamento a -80 °C.
      NOTA: Uma reação de 20 μL usa 8,9 μL de pré-x.

2. Prepare as células.

  1. Estiche as células de auto-lise em placas de ágar LB contendo 50 μg/mL ampicillin usando um laço inoculante e cresça a 37 °C (ver Nota 1).
  2. Escolha uma única colônia em uma cultura inicial de meio LB/ampicillin usando uma ponta de pipeta e cresça a 37 °C durante a noite.
  3. Inocular 400 mL de meio 2xYTPG contendo 50 μg/mL ampicillin com 400 μL de cultura inicial, e crescer a 37 °C em um frasco de 1 L Erlenmeyer, tremendo a 300 rpm.
  4. Meça periodicamente a densidade óptica da cultura a 600 nm (OD600) usando um espectotómetro para ler um cuvette óptico com um comprimento de caminho de 1 cm. Quando o OD600 exceder 1, comece a diluir a cultura 5 vezes antes das medições para garantir que as medidas permaneçam dentro da faixa linear de um espectrofotômetro de laboratório típico. Continue crescendo as células até que a cultura diluída de 5 vezes atinja OD600 de 0,3 (correspondente a uma cultura OD600 de 1,5).

3. Prepare o lise.

  1. Prepare o tampão S30A complementado com dithiothreitol de 2 mM (DTT). Misture 3 mL de tampão S30A com 6 μL de solução de estoque DTT a 1 M. Coloque no gelo para uso na etapa 3.7.
  2. Colher as células por centrifugação a 1800 × g por 15 min a temperatura ambiente.
  3. Descarte o supernatante derramando-o e usando uma tubulação para remover qualquer líquido restante.
  4. Resuspenha a pelota em 45 mL de tampão S30A frio (4-10 °C) usando um misturador de vórtice.
  5. Pesar um tubo vazio de centrífugas de 50 mL, transferir as células para ele e repetir as etapas 3.2-3.3 para lavar as células.
  6. Pese a pelota, subtraindo o peso de um tubo vazio de 50 mL. Certifique-se de aspirar cuidadosamente qualquer supernante restante para garantir uma medição precisa do peso da pelota.
    NOTA: Um rendimento típico é de ~1,3 g de pelota celular de 400 mL de cultura de produção.
  7. Adicione 2 volumes de tampão S30A frio suplementado com dithiothiothreitol de 2 mM, ou seja, 2 mL de tampão para cada 1 g de pelota celular, e resuspenque as células por uma mistura vigorosa de vórtice.
  8. Congele as células. Coloque o tubo de 50 mL contendo as células em um congelador de -20 °C ou -80 °C até que a pelota esteja completamente congelada.
    NOTA: O passo de congelamento é um bom ponto de parada para o dia.
  9. Descongele as células em um banho de água de temperatura ambiente.
  10. Vórtice vigorosamente por 2-3 min.
  11. Incubar a 37 °C por 45 min com agitação a 300 rpm.
  12. Limpe a amostra de detritos celulares pesados por centrifugação em tubos de centrífuga transparente a 30.000 × g por 45 min a 4 °C.
    NOTA: Se uma centrífuga capaz de 30.000 x g não estiver disponível, centrífuga por 45 min a 21.000 × g, e tome cuidado adicional na etapa 3.13, pois a pelota será menos compacta.
  13. Transfira cuidadosamente o supernatante para um novo tubo com uma pipeta, evitando perturbar a pelota o máximo possível. Se o supernante transferido estiver contaminado com material da pelota, repita a etapa anterior.
  14. Transfira o supernatante para tubos de centrífuga de 1,5 mL e centrífuga mais uma vez a 21.000 × g (ou a velocidade máxima de uma centrífuga de mesa) por 5 minutos.
  15. Alíquotar o auto-lisato limpo nos volumes desejados, evitando cuidadosamente qualquer pelota restante, e congele a -80 °C ou use imediatamente.
    NOTA: Uma única reação de 20 μL usa 8 μL de autolysato.

4. Expressão genética livre de células

NOTA: O auto-acordo está agora pronto para qualquer uso final desejado. A seguir, um protocolo padrão de exemplo para a expressão genética livre de células.

  1. Para uma reação de 20 μL, misture no gelo 8 μL de autolysato e 8,9 μL de pré-x. Consulte NOTA no final da seção de protocolo sobre a otimização de glutamato de magnésio e concentrações PEG 8000.
  2. Adicione DNA (por exemplo, pBEST-OR2-OR1-PR-UTR1-deGFP-T500 a uma concentração final de 8 nM), quaisquer outros reagentes e água a 20 μL.
  3. Coloque a reação em uma microplaca de 384 poços e meça o curso de tempo de fluorescência e/ou pontos finais usando um leitor de placas. Para proteína fluorescente verde (GFP), use um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 520 nm.

5. Modificações de protocolo

NOTA: As seguintes modificações do protocolo permitem que ele atenda outras aplicações.

  1. Expressão genética livre de células usando modelos lineares de DNA
    1. Realize as etapas na seção 4, complementando a reação com proteína GamS purificada de 2,2 μM (expressa e purificada como descrito12) antes da adição do DNA linear.
  2. Expressão genética livre de células incorporando a degradação da proteína
    1. Na etapa 2.1, use células de autolysato contendo o plasmid pACYC-FLAG-dN6-His (ver a Tabela de Materiais). Em todas as mídias de crescimento, além disso, incluem 34 μg/mL chloramphenicol.
    2. Na etapa 2.3, inclua 40 μM isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) no meio de crescimento para induzir a expressão do plasmídeo.
    3. Repita as etapas 3.2-3.4 (lavagem) duas vezes adicionais (para um total de três lavagens) para garantir a remoção completa do clororamfenicol, que é um inibidor de tradução. Para as duas primeiras lavagens (etapa 3.4), substitua o tampão S30A por soro fisiológico tamponado por fosfato (pH 7.4).
    4. Na etapa 4.2, complemente com um ATP adicional de 3 mM (adicionado a partir de uma solução de estoque de 100 mM ATP em água, pH 7.2) e glúteo de magnésio de 4,5 mM (usando uma solução de estoque de 1 M em água) (concentrações finais) para compensar o alto uso de ATP pelo ClpXP, bem como a quelação de magnésio pelo ATP adicional.
  3. Expressão genética livre de células usando leituras baseadas em LacZ (incluindo colorimétrica)
    1. Na etapa 2.1, utilize células de auto-liseto que não expressem nativamente LacZ (ver a Tabela de Materiais).
  4. Alternativamente, prepare o lise diretamente de células congeladas.
    1. Realize todas as etapas de 1,1 a 3,7.
    2. Misture 8 μL de suspensão celular com 8,9 μL de pré-x.
    3. Adicione DNA plasmídeo (se desejar), outros reagentes personalizados e água para atingir um volume final de 20 μL.
    4. Transfira a reação para uma microplacão de 384 poços e congele-a.
      NOTA: As amostras congeladas podem ser armazenadas por até uma semana e possivelmente por mais tempo.
    5. Para começar a reação, reidrate-o com 18 μL de água deionizada suplementada com qualquer DNA desejado ou outros reagentes.
    6. Siga a dinâmica da fluorescência em um leitor de placas.

NOTA 1: As células de auto-lise são projetadas para lise em um ciclo de congelamento, por isso é particularmente importante usar crioprotetor ao fazer estoques congelados. Congelamos os estoques em 24% de glicerol wt/vol e armazenamos a -80 °C.

NOTA 2: Íons de magnésio e PEG 8000 são fundamentais para o desempenho do lysate. A precex base de 2,5x, baseada em dados publicados anteriormente, contém glúteo de magnésio de 6 mM e 4,8% wt/vol PEG 8000, que se tornam 2,4 mM e 1,9%, respectivamente, na reação final. O autolysate preparado com o protocolo aqui normalmente tem melhor desempenho com um adicional de 5 mM Mg-glutamato e 1,5% PEG 8000 na reação final. No entanto, isso pode ser otimizado na faixa de um glutamato adicional de 0-10 mM Mg e um adicional de 0-3% PEG 8000 (em comparação com a pré-mistura base). Para preparar a pré-mistura com o recomendado adicional de 5 mM Mg-glutamato e 1,5% PEG 8000 (concentrações finais), misture 380 μL de pré-x com 4,75 μL de glutamato de magnésio a 1 M e 36,1 μL de PEG 8000 a 40% de peso/volume.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Os resultados representativos podem ser observados usando o auto-desapedo para expressar GFP a partir de um plasmídeo expresso constitutivamente, aqui pBEST-OR2-OR1-PR-UTR1-deGFP-T500, e registrando um curso de tempo de fluorescência GFP em um leitor de placas(Figura 1B). Uma série de diluição de DNA plasmídeo encontrou forte expressão mesmo em DNA de 1 nM. Em comparação com um lysate comercialmente disponível, o autolysato pode produzir um rendimento total maior e alcançar uma taxa máxima d...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

O protocolo descrito aqui produz lisesto bacteriano altamente ativo para a expressão genética livre de células. A chave é usar células que carregam o plasmídeo pAD-LyseR, que expressa a lambda phage endolysin citosolicamente. Essas células são potencializados para se desobrilarem após a permeabilização da membrana interna, permitindo o acesso da endolise à parede celular, que o método consegue através de um simples ciclo de congelamento. Como as células se lisem efetivamente, o produto é referido como auto-lysate. Após a...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

J.H. é um co-fundador da GenCirq Inc, que se concentra na terapêutica do câncer. Ele faz parte do Conselho de Administração e tem participação na GenCirq.

Agradecimentos

Os autores agradecem zachary Sun e Richard Murray (Instituto de Tecnologia da Califórnia) por fornecer gentilmente o plasmídeo P_araBAD-gamS, e Kaeko Kamei (Instituto de Tecnologia de Kyoto) por gentilmente fornecer uma centrífuga de resfriamento de alta velocidade. Este trabalho foi apoiado por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde e do programa ARO MURI e foi parcialmente apoiado pela Iniciativa Líder para Excelentes Jovens Pesquisadores, MEXT, Japão.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2xYT mediaEMD Millipore4.85008ou equivalente
3-PGASigma AldrichP8877ou
equivalente Amicon Ultra-15 unidade de filtro centrífugo, corte de 3 kDaMillipore SigmaUFC900308opcional, pode ser usado para concentrar o lisado, selecione a capacidade do concentrador apropriada para o volume a ser concentrado
ampicilinaSigma AldrichA0166-5Gou carbenicilina, uma variante mais estável
ATPSigma AldrichA8937ou
equivalente cAMPSigma AldrichA9501ou equivalente
CoASigma AldrichC4282ou
equivalente CTPUnited States Biosciences14121ou
equivalente D-glicose (dextrose)Fisher ScientificAAA1749603ou
ditiotreitol equivalente (DTT)Sigma AldrichD0632-1Gou
equivalente E. coli BL21-Gold (DE3) portador de pAD-LyseRAddgene99244
E. coli BL21-Gold (DE3) e Delta; lacZ carregando pAD-LyseRAddgene99245
Ácido folínicoSigma AldrichF7878ou equivalente
GTPUnited States Biosciences16800ou equivalente
HEPESSigma AldrichH3375-25Gou
equivalente LB meioFisher ScientificDF0446075ou
equivalente glutamatode magnésioSigma Aldrich49605-250Gou equivalente
NADSigma AldrichN6522ou
equivalente glutamato de potássioSigma AldrichG1501-100Gou
equivalente hidróxido de potássio (KOH)Sigma Aldrich221473-25Gpara ajustar
o pH fosfato de potássio dibásicoFisher ScientificBP363-500ou equivalente
fosfato de potássio monobásicoFisher ScientificBP362-500ou equivalente
EspermidinaSigma Aldrich85558ou equivalente
Tris-HClFisher Scientific9310500GMou
equivalente tRNA mixRoche10109541001ou equivalente
UTPUnited States Biosciences23160ou equivalente

Referências

  1. Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
  2. Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
  3. Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
  4. He, M. Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology. New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).
  5. Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  6. Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  7. Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  8. Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard". ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).
  9. Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027(2018).
  10. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762(2013).
  11. Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  12. Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
  13. Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. Artificial cell on a chip integrated with protein degradation. 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).
  14. Garibaldi, B., et al. Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).
  15. Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  16. Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 0154614(2016).
  17. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8(2010).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Express o G nica Livre de C lulasLisado de C lulas BacterianasLisado de Escherichia ColiLise por Congelamento e DescongelamentoProtocolo de Aut liseExpress o de Circuitos G nicosBiossensoriamento Livre de C lulasExpress o da Protease ClpXLeitura Colorim tricaLeitura Fluorescente
Produção rápida, acessível e descomplicada de lysate sem células bacterianas
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.