Artigo de método

Usando oxigênio hiperbárico para melhorar a radiossensibilidade de células de glioma U251 humano

DOI:

10.3791/62769

⸱

20 de outubro de 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiotherapy, Second Hospital Affiliated to Lanzhou University, 2Department of Ultrasound, Second Hospital Affiliated to Lanzhou University, 3Department of Cardiology, Hubei Lichuan Dongfang Harmonious Hospital

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo mostra que o oxigênio hiperbárico pode aumentar a proliferação, inibição e apoptose de células de glioma U251 tratadas com irradiação de raios-X, bloqueando as células na fase G2/M. Isso melhora a radiossensibilidade das linhagens celulares de glioma humano.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O objetivo deste estudo foi explorar o uso de oxigênio hiperbárico para aumentar a radiossensibilidade das células de glioma humano. As células de glioma humano U251 subcultivadas foram divididas aleatoriamente em quatro grupos: um grupo de controle não tratado, células tratadas apenas com oxigênio hiperbárico (HBO), células tratadas apenas com irradiação de raios-X (raios-X) e células tratadas com HBO e raios-X. Morfologia celular, atividade de proliferação celular, distribuição do ciclo celular e apoptose foram observadas nesses grupos para avaliar o papel da OHB na melhoria da radiossensibilidade das células de glioma. Com o aumento das doses de raios-X (0 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy), a fração de sobrevivência (SF) das células de glioma diminuiu gradualmente.

Observou-se SF significativamente menor para as células tratadas com HBO e raios-X juntos do que no grupo de raios-X para cada dose (todos P < 0,05). A inibição da proliferação foi significativamente maior no grupo HBO combinado com raios-X do que no grupo raios-X para cada dose (todos os P < 0,05) para a linhagem celular U251. A porcentagem de células da fase G2/M foi significativamente maior no grupo OHB combinado com raios-X (2 Gy) (26,70% ± 2,46%) e no grupo OHB (22,36% ± 0,91%) do que no grupo controle (11,56% ± 2,01%) e no grupo raios-X (2 Gy) (10,35% ± 2,69%) (todos P < 0,05). A apoptose de células U251 foi significativamente maior no grupo HBO combinado com raios-X (2 Gy) do que no grupo HBO, no grupo raio-X (2 Gy) e no grupo controle (todos P < 0,05). Concluímos que a HBO pode aumentar a proliferação, inibição e apoptose das células de glioma U251, bloqueando as células de glioma na fase G2 / M e melhorar a radiossensibilidade das células de glioma U251.

Introdução

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O glioma é um tumor intracraniano primário que se origina das células gliais do sistema nervoso central1. A estratégia atual de tratamento para o glioma é a cirurgia combinada com radioterapia e quimioterapia. A radioterapia pós-operatória para glioma pode fornecer benefícios de sobrevida (evidência grau I), e a radioterapia pós-operatória precoce pode efetivamente prolongar a sobrevida do paciente (evidência grau II)2. Para gliomas de alto grau (grau III ou IV), especialmente glioblastoma altamente maligno e invasivo (evidência de grau III)3, a radioterapia pós-operatória deve ser realizada o mais cedo possível (<6 semanas). No entanto, apesar da intervenção precoce, o glioma ainda apresenta uma alta taxa de recorrência e mau prognóstico após tratamento abrangente. Esses resultados estão associados principalmente à baixa radiossensibilidade do glioma. Os fatores relacionados à radiossensibilidade tumoral incluem a radiossensibilidade inerente das células tumorais, células tumorais hipóxicas ou não hipóxicas, a proporção de células tumorais hipóxicas e a capacidade do tecido peritumoral de reparar danos causados pela radiação4.

Dentre esses fatores, as células tumorais hipóxicas ou não hipóxicas e a proporção de células tumorais hipóxicas têm efeitos importantes sobre a radiossensibilidade tumoral. O oxigênio hiperbárico (OHB) pode melhorar o armazenamento de oxigênio nos tecidos, aumentando a tensão de oxigênio nos tecidos e a difusão de oxigênio no sangue. A OHB também pode produzir uma série de efeitos bioquímicos, citológicos e fisiológicos benéficos5. Por exemplo, a OHB tem um efeito reparador marcante nos danos causados pela radiação induzida por radioterapia. Embora a OHB combinada com radioterapia ou quimioterapia seja relatada para melhorar a eficácia clínica da radioterapia ou quimioterapia para o glioma6, há um debate considerável sobre como a OHB sozinha afeta o crescimento do glioma maligno. Ding et al.7 e Wang et al.8 demonstraram que a OHB promove o crescimento de glioma in situ em camundongos por meio de mecanismos que envolvem a inibição da apoptose e a promoção da angiogênese tumoral. Em condições fisiológicas, a OHB promove a angiogênese tumoral por induzir estresse oxidativo9.

No entanto, um estudo indicou que a exposição a curto prazo à OHB promove a proliferação de células tumorais, enquanto a exposição prolongada à OHB promove a apoptose e inibe a proliferação10. Portanto, mais estudos são necessários para explorar se a OHB promove ou inibe o crescimento do glioma e como a OHB combinada com radioterapia ou quimioterapia pode induzir sensibilização terapêutica. Em particular, são necessários detalhes mecanicistas sobre como a HBO melhora a radiossensibilidade do glioma. Para explorar como a HBO melhora a radiossensibilidade das células de glioma U251 humanas neste estudo, usamos HBO combinada com irradiação de raios-X na proliferação de células de glioma e observamos os efeitos na distribuição do ciclo celular e na apoptose.

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Protocolo

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Todos os métodos de estudo foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional e pelo Comitê de Ética do Segundo Hospital Afiliado à Universidade de Lanzhou e foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes.

1. Tratamento de células de glioma

NOTA: A linha celular de glioma U251 foi usada neste experimento.

  1. Cultura de células U251
    1. Semeie células U251 em várias placas com DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e cultive-as a 37 ° C com 5% de CO2.
    2. Ao atingir 50%-60% de confluência, dissocie as células usando solução de tripsina-EDTA (0,25%, sem vermelho de fenol) e deixe-as crescer até 80% de confluência.
  2. Irradiação de raios X
    1. Cobrir as placas ou balões de cultura com um compensador tecidual equivalente com uma espessura máxima de 1 cm. Em seguida, exponha as células à irradiação de raios X fornecida por um acelerador linear de 6 MV com uma distância fonte-célula de 100 cm, ajustada clicando no botão de rotação na placa de controle remoto.
    2. Peça a um físico que meça a dose de radiação e corrija a atenuação. Como controle, coloque frascos contendo meios em um detector antes da irradiação de raios-X.
  3. Oxigênio hiperbárico (OHB)
    1. Desinfete a câmara HBO ligando a luz ultravioleta por 15 min e depois inunde-a com 0.02 MPa de oxigênio puro por 5 min.
    2. Depois de colocar as células em placas ou frascos de cultura na câmara, clique no botão regulador de pressão na placa de controle fora da câmara para aumentar a pressão HBO na câmara para 0.2 MPa (2.0 ATA) dentro de 30 minutos de irradiação.
    3. Trinta minutos depois, clique no botão regulador de pressão para diminuir a pressão HBO para o nível de pressão anterior (0.1 MPpa). Em seguida, trate os frascos ou placas de cultura com HBO 1x por dia durante 3 dias consecutivos.

2. Células de glioma U251 em diferentes grupos

  1. Defina um grupo de controle, grupo de raios-X (2 Gy) e HBO combinado com grupo de raios-X (2 Gy) para calcular as curvas de crescimento celular.
  2. Prepare suspensões unicelulares a partir das células do glioma U251 mostrando as taxas máximas de crescimento (consulte a etapa 1.1.2). Ajuste a densidade celular para 1 × 106 / mL contando as células usando uma lâmina de hemocitômetro. Em seguida, adicionar 1 ml da suspensão celular a um frasco de cultura (densidade celular: 1 × 106/frasco) com três frascos separados para cada grupo.
  3. Avalie a morfologia celular com ampliação de 100x com um microscópio de campo claro para enumerar as células aderentes em 24 h, 48 h e 72 h de cultura.

3. Radiossensibilidade das células de glioma U251 (ensaio de formação de clones) dentro de 30 minutos após HBO

  1. Semeie a suspensão unicelular U251 em todos os poços a 5 × 102 células/mL em placas de 6 poços e, em seguida, exponha-os à dose indicada de irradiação de raios-X (0 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy e 8 Gy), com três amostras paralelas sendo examinadas para cada dose de raios-X.
  2. Para o grupo HBO combinado com raios-X (2 Gy), exponha as células à irradiação de raios-X dentro de 30 minutos após o tratamento com OHB. Após o tratamento, cultivar as células a 37 °C com 5% de CO2 durante 14 dias.
  3. Depois que os clones estiverem visíveis, remova o meio e lave os clones 2x com PBS.
  4. Fixe as células em 1 mL de metanol a 10% por 15 min antes de corar com 1 mL de violeta cristal a 0,1% por 20 min.
  5. Após a coloração, lave as células com 6 mL de água destilada usando uma pipeta e, em seguida, aspire a solução de cristal violeta. Deixe as células secarem ao ar.
  6. Conte os clones com um diâmetro entre 0,3 mm e 1,0 mm ao microscópio para garantir que haja >50 células por clone.
  7. Calcular a fração de sobrevivência (SF) utilizando a equação (1):
    SF = figure-protocol-1 × 100% (1)
  8. Usando software estatístico, gere uma curva de sobrevivência de dose de radiação com base no modelo multialvo de acerto único (SHMT) usando a equação (2):
    S = 1 - (1 - figure-protocol-2)N (2)
    Onde S = probabilidade de sobrevivência; k = dose letal média (a dose que causa uma resposta positiva média por célula); x = o número de ocorrências por célula; N = o número de alvos (o número de acertos para morte celular).
  9. Calcule os parâmetros radiobiológicos, incluindo a dose letal média (D0), dose quase-limiar (Dq), número de extrapolação (N), fração de sobrevivência em uma dose de irradiação de 2 Gy (SF2), taxa de aumento de sensibilização (D0) (SER = D0 no grupo controle / D0 no grupo experimental) e SER (Dq) (SER = Dq no grupo controle / Dq no grupo experimental) para avaliar o efeito da HBO na radiossensibilidade das células de glioma U251.
    Em que D0 = valor recíproco da inclinação da porção linear da curva de sobrevivência (a dose reduz a taxa de sobrevivência em 63%)
    N = o valor do ponto de interseção formado pela extrapolação da porção linear para encontrar a ordenada (refletindo a capacidade celular de reparar o dano causado pela radiação)
    Dq = valor do ponto projetivo de intersecção na abscissa e da intersecção formada pelo desenho de uma linha que passa por 1,0 na ordenada e paralela à abscissa para encontrar a recta de extrapolação.

4. Ensaio de contagem de células para avaliar a proliferação de células de glioma U251

  1. Defina um grupo de controle, um grupo HBO e grupos tratados com raios-X (0 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy) sozinho ou combinado com HBO.
  2. Ajuste a densidade celular para 1 × 104 células/mL usando células U251 em suspensões unicelulares.
  3. Semeie as suspensões celulares (100 μL, densidade: 1 × 103 / poço) em placas de 96 poços (cinco poços por grupo). Efectuar o ensaio de contagem de células (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, determinar a densidade óptica (DO) a 450 nm utilizando um leitor de microplacas após 48 h de cultura com o reagente.
  4. Calcular a taxa de inibição da proliferação celular (IR) de acordo com a equação (3):
    IR = figure-protocol-3 × 100% (3)

5. Detecção de apoptose de células de glioma U251

  1. Controle de conjunto, HBO, raio-X (2 Gy) e HBO combinados com grupos de raios-X (2 Gy).
  2. Remova o meio após a cultura e lave as células com 1x PBS.
  3. Separe as células com tripsina e, em seguida, desative a tripsina adicionando DMEM quando uma morfologia celular arredondada for observada ao microscópio.
  4. Transferir as células para um tubo de centrifugação e centrifugar durante 5 min a 200 × g.
  5. Descarte o sobrenadante, adicione 3 mL de 1x PBS ao pellet e pipete suavemente para ressuspender as células.
  6. Centrifugue as células novamente a 200 × g por 5 min. Em seguida, aspire o PBS sobrenadante e lave as células 2x antes de ressuspendê-las com pipetagem suave em 50 μL de tampão de ligação.
  7. Adicione 5 μL de anexina V-FITC às células a 4 ° C e incube as células no escuro a 4 ° C por 15 min antes de adicionar 400 μL de tampão de ligação. Transferir a mistura para um tubo de citometria de fluxo contendo 5 μl de solução de corante de iodeto de propídio (PI) (10 mg/ml). Detecte células apoptóticas 5 min depois por citometria de fluxo11.
  8. Registre a fluorescência vermelha na onda de excitação de 488 nm, insira-a em um computador para analisar a porcentagem de cada ciclo celular em 5.000 células e, em seguida, imprima os picos das células apoptóticas.
  9. Colete a fluorescência vermelha e verde por anexina V e rotulagem dupla PI, insira-as no computador para analisar e, em seguida, imprima o gráfico de pontos.

6. Detecção da distribuição do ciclo celular do glioma U251

  1. Lave as células mencionadas acima 2x com 1 mL de PBS antes de tratá-las com tripsina.
  2. Quando uma morfologia celular arredondada for detectada por microscopia de luz, adicione DMEM contendo 10% de FBS.
  3. Centrifugue as células por 5 min a 200 × g à temperatura ambiente.
  4. Remova o sobrenadante e ressuspenda essas células em 1 mL de PBS antes de adicionar solução pré-resfriada de etanol a 75%.
  5. Incubar a mistura durante pelo menos 4 h ou durante a noite a -20 °C.
  6. Lave as células 2x com PBS gelado e 180 μL de EDTA (0,1 mM, 3,7 mg de EDTA + 100 mL de PBS), 20 μL de RNase A (10 mg/mL), 35 μL de Triton X-100 (2%, 2 mL de Triton + 98 mL de FBS) e 96,5 μL de PBS. Em seguida, adicione 17,5 μL de solução de IP (1 mg/mL).
  7. Incubar a mistura a 4 °C na escuridão durante 10 min.
  8. Lave as células em 200 μL de PBS e, em seguida, coloque-as em um citômetro de fluxo para avaliar a distribuição do ciclo celular, conforme descrito anteriormente12.
  9. Opere o citômetro de fluxo no modo de excitação de laser duplo, espaço tridimensional, com um tamanho de ponto de 22 μm x 66 μm e 13 μm x 66 μm. Use uma sala de fluxo de 430 μm x 180 μm, espectro de 300-1.100 nm, detectabilidade ≤100 MESF e resolução CV <2%. Em seguida, exponha as células à luz de excitação de 488 nm e detecte e meça os sinais de fluorescência com o software do instrumento para determinar a distribuição do ciclo celular13.
  10. Determine o conteúdo de DNA e, de acordo com o conteúdo de DNA, analise o ciclo celular.

7. Análise estatística

  1. Realizar análises estatísticas.
  2. Apresente os dados como média ± desvio padrão.
  3. Utilizar o teste t de Student para comparar os grupos, com significância estatística definida como P < 0,05.

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Resultados

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Cultura de células de glioma U251
As células de glioma U251 apresentaram formato fusiforme 24 h a 48 h após o cultivo em DMEM e foram aderentes. Essas células foram utilizadas para estudo posterior (Figura 1).

Morfologia e contagem de células de glioma
As contagens de células para as células de glioma U251 no grupo HBO combinado com raios-X (2 Gy) foram significativamente menores do que para o grupo de raios-X (2 Gy) após 24...

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Discussão

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A linhagem celular de glioma U251 é uma das linhagens celulares de glioma humano mais clássicas e é amplamente utilizada como modelo de glioma em muitos estudos.

Efeitos da OHB na proliferação de células de glioma U251
HBO normalmente se refere à respiração de oxigênio puro (concentração de oxigênio de 100%) em uma câmara selada com uma pressão 1,5-3 vezes maior que a pressão atmosférica normal, o que pode aumentar o conteúdo de oxigênio no...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Buffer de Ligação   Dickinson and CompanyRH10 9RR
CCK-8 DOJINDO Ensaio de contagem de célulasNJ
CELL FIT análise do ciclo celular (conteúdo de DNA)
Análise de células apoptóticasCELLQUEST
DMEM e Anexina V-FITCGibco BRL
citômetro de fluxoDickinson
Glioma U251 e U87 linha celularInstitute of Cell Biology
câmara hiperbárica de oxigênioInstitutoHongyuan
acelerador linear médicoElekta Limited Company
leitor de microplacas
MOD FITLT formac v1.01 análise celular - fase do ciclo celular
tripsinaHyclone Laboratories  Inc
Kit de teste Shanghai

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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