Este artigo fornece um protocolo detalhado para a preparação de grades de amostras a temperaturas tão altas quanto 70 °C, antes do congelamento por imersão para experimentos de crio-EM.
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Artigo de método
Preparação de grades de amostras de alta temperatura para crio-EM
Neste artigo
Resumo
Resumo
As grades de amostras para experimentos de microscopia crioeletrônica (crio-EM) são geralmente preparadas a uma temperatura ideal para o armazenamento de amostras biológicas, principalmente a 4 °C e, ocasionalmente, à temperatura ambiente. Recentemente, descobrimos que a estrutura proteica resolvida a baixa temperatura pode não ser funcionalmente relevante, particularmente para proteínas de archaea termofílicas. Um procedimento foi desenvolvido para preparar amostras de proteína em temperaturas mais altas (até 70 °C) para análise crio-EM. Mostramos que as estruturas de amostras preparadas em temperaturas mais altas são funcionalmente relevantes e dependentes da temperatura. Aqui descrevemos um protocolo detalhado para a preparação de grades de amostras em alta temperatura, usando 55 °C como exemplo. O experimento utilizou um aparelho de vitrificação modificado com um tubo de centrífuga adicional, e as amostras foram incubadas a 55 °C. Os procedimentos detalhados foram ajustados para minimizar a condensação de vapor e obter uma fina camada de gelo na grade. Exemplos de experimentos bem-sucedidos e malsucedidos são fornecidos.
Introdução
A tecnologia crio-EM para a resolução das estruturas de complexos proteicos tem continuado a melhorar, particularmente no sentido da obtenção de estruturas de alta resolução 1,2. Nesse ínterim, o cenário de sua aplicação também foi ampliado pela variação das condições da amostra, como pH ou ligantes, antes do processo de vitrificação3, que envolve a preparação de grades de amostra seguidas de congelamento por imersão 4,5. Outra condição importante é a temperatura. Embora os experimentos de crio-EM, como a cristalografia de raios-X, sejam realizados a baixas temperaturas, a estrutura resolvida pela crio-EM reflete a estrutura no estado da solução antes da vitrificação. Até recentemente, a maioria dos estudos de crio-EM de análise de partícula única (SPA) usa amostras que são mantidas no gelo (ou seja, a 4 °C) antes da vitrificação6, embora vários estudos usem amostras em torno da temperatura ambiente 7,8,9,10 ou tão alto quanto 42 °C 11. Em um relatório recente, realizamos estudos dependentes da temperatura da enzima reducionoisorase cetola-ácida (KARI) do arqueão termofílico Sulfolobus solfataricus (Sso) em seis temperaturas diferentes de 4 °C a 70 °C12. Nossos estudos sugerem que é importante preparar grades de amostras a temperaturas funcionalmente relevantes e que o crio-EM é o único método estrutural praticamente viável para resolver a estrutura do mesmo complexo proteico em múltiplas temperaturas.
A maior dificuldade para a vitrificação em altas temperaturas é minimizar a condensação de vapor e alcançar gelo fino. Aqui relatamos o protocolo detalhado usado para preparar grades de amostras em altas temperaturas em nosso estudo anterior do Sso-KARI 12. Assumimos que os leitores ou espectadores já são experientes nos procedimentos gerais de preparação de amostras e processamento de dados para experimentos de crio-EM e enfatizamos os aspectos relevantes para a alta temperatura.
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Protocolo
NOTA: Este protocolo tem como objetivo utilizar um aparelho de vitrificação comercial modificado para preparar as amostras de microscopia crio-eletrônica (crio-EM) em temperaturas específicas, especialmente superiores a 37 °C. A configuração experimental geral é mostrada na Figura 1. O protocolo usa 55 °C como exemplo. Para as condições específicas a outras temperaturas, consultar o quadro suplementar 2 na referência12.
1. Preparação do aparelho de vitrificação
- Faça um furo de 1 cm em um tubo de centrífuga de 50 mL em sua extremidade fechada.
- Colocar o tubo na câmara do aparelho de vitrificação na saída de água ultra-sônica, como mostra a Figura 2.
NOTA: O objetivo é minimizar a condensação de água, guiando o vapor de água para o trocador de calor através do tubo antes de atingir toda a câmara. - Ajustar a temperatura do aparelho de vitrificação à temperatura especificada (por exemplo, 55 °C, como indicado na figura 3) e permitir que a câmara do aparelho de vitrificação atinja 55 °C e 100% de humidade relativa. Deixe repousar por pelo menos meia hora para estabilizar as condições antes de iniciar o experimento.
2. Aquecendo a amostra e as ferramentas
- Coloque o banho de água numa placa de aquecimento e ajuste a placa de aquecimento para a temperatura desejada (aqui 55 °C). Verifique com um termômetro para garantir que a água atinja 55 °C.
- Incubar a amostra em banho-maria e pré-aquecer a ponta da pipeta na borda da placa de aquecimento por 2 minutos ou mais antes do experimento de blotting.
NOTA: A temperatura mais elevada para a câmara do aparelho de vitrificação é de 60 °C. Para preparar grelhas de temperatura mais elevadas para a experiência cyro-EM (por exemplo, 70 °C), a amostra é incubada em banho-maria a 80 °C, e a média entre a temperatura da amostra e a temperatura do aparelho de vitrificação é estimada como sendo a temperatura real da amostra na grelha (70 °C neste caso). Consulte a seção Discussão para obter mais detalhes e limitações sobre essa estimativa.
3. Preparação para o experimento de blotting
- Descarga de brilho de uma grade suportada por carbono holey a 25 mA por 30 s, ou alternativa aos valores, dependendo do dispositivo usado.
- Incubar a pinça com a grelha no aparelho de vitrificação durante 2 min ou mais.
- Encha o recipiente de etano com etano de acordo com os procedimentos padrão. Não deixe o etano transbordar.
NOTA: Esta etapa leva cerca de 10 minutos e deve ser seguida imediatamente com o experimento de blotting para evitar o congelamento. - Coloque o papel de filtro de vitrificação na câmara do aparelho de vitrificação não antes de 5 minutos antes da experiência de blotting.
NOTA: Colocar o papel de filtro na câmara muito cedo fará com que ele fique muito molhado.
4. Experiência de blotting
NOTA: Ao segurar a grade, verifique se a grade está estável e se há uma área de contato mínima com a pinça (Figura 4). Isso é feito para manter a melhor eficiência de resfriamento do etano e evitar o gelo não vítreo.
- Use uma ponta de pipeta para aplicar 7-9 μL da amostra à grade. Em seguida, aguarde 1-2 s, limpe por 1-1,5 s e mergulhe rapidamente a amostra em etano líquido.
- Transfira a grade do etano líquido para a caixa criogênica, que é armazenada em nitrogênio líquido.
NOTA: Esta etapa deve ser executada com muito cuidado, porque a pinça ainda está quente, então todo o tanque de resfriamento está cheio de vapor neste momento.
5. Verificação de qualidade para as grades
- Recorte as grades e carregue-as para um instrumento crio-EM.
- Use a tela de exibição do instrumento crio-EM e a função de baixa dose do software para rastrear a condição de gelo na grade e a distribuição da amostra na grade.
NOTA: Muitas vezes, as grades são muito secas, ou a camada de gelo é muito espessa. A taxa de sucesso das grelhas preparadas a altas temperaturas é substancialmente inferior à temperatura ambiente ou a 4 °C. Resultados representativos de grades boas e grades insatisfatórias são mostrados na próxima seção. - Se a qualidade da grade resultante não for boa, repita o processo de preparação da grade com condições variadas (como tempo de espera, tempo de blotting, etc.). Se a qualidade da grade resultante for boa, repita as mesmas etapas para criar grades a uma temperatura diferente.
6. Coleta de dados
- Transfira as grades de boa qualidade para um instrumento crio-EM de alta resolução.
- Realizar coleta e análise de dados de acordo com os procedimentos estabelecidos.
NOTA: Como mostrado em nossa publicação anterior, a resolução da estrutura não é afetada pela alta temperatura12.
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Resultados
A visão geral de baixa ampliação é mostrada na Figura 5A,B. O Painel A é um exemplo de uma grade bem-sucedida. Há um gradiente de gelo do canto superior esquerdo (mais espesso) para o canto inferior direito (mais fino ou vazio). Essa grade facilita a localização de uma espessura apropriada da camada de gelo na área do meio adequada para a coleta de dados, como as caixas azul e verde. A grade B está muito seca. Os quadrados na grade têm contraste brilhante, o que significa qu...
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Discussão
Na etapa 1 do protocolo, certifique-se de que o tubo de centrífuga foi bem instalado e não cai quando o experimento está em andamento. Devido ao acúmulo de um grande número de gotículas de água na câmara, o que poderia alterar a capacidade de adsorção do papel de filtro, recomenda-se que o tempo total do experimento não exceda 30 min após a câmara do aparelho de vitrificação atingir a temperatura de equilíbrio. Se o tempo de operação exceder 30 min, o operador precisa substituir o papel de filtro e esperar que a cabine e...
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Dr. Hervé Remigy da Thermo Fisher Scientific por conselhos úteis. Os experimentos de crio-EM foram realizados na Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). A ASCEM é apoiada pela Academia Sinica (Grant No. AS-CFII-108-110) e Taiwan Protein Project (Grant No. AS-KPQ-109-TPP2). Os autores também agradecem à Sra. Hui-Ju Huang pela assistência na preparação da amostra.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo Falcon | Falcon | 352070 | tamanho: 50 mL |
| Papel de filtro | Ted Pella | 47000-100 | Ø 55/20mm, Grau 595 |
| HI1210 | Leica | banho-maria | |
| K100X | Ciências de Microscopia | incandescente | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh grade | Ted Pella | 658-200--100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | imagem de baixa dose Vitrobot |
| Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Pinça Vitrobot | Ted Pella | 47000-500 |
Referências
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al. Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase. Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).
- Cabra, V., Samsó, M. Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (95), e52311(2015).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales. Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. Specimen preparation for high resolution cryo-EM. J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -F., Savage, D. F., Davies, K. M. Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis. Nature. 566, 411-414 (2019).
- Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363, (2019).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364, 355-362 (2019).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23, 1097-1105 (2015).
- Singh, A. K., et al. Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3. Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).
- Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions. Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).
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Reimpressões e permissões
