Este artigo fornece um protocolo detalhado para a preparação de grades de amostras a temperaturas tão altas quanto 70 °C, antes do congelamento por imersão para experimentos de crio-EM.
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Artigo de método
Preparação de grades de amostras de alta temperatura para crio-EM
Neste artigo
Resumo
Resumo
As grades de amostras para experimentos de microscopia crioeletrônica (crio-EM) são geralmente preparadas a uma temperatura ideal para o armazenamento de amostras biológicas, principalmente a 4 °C e, ocasionalmente, à temperatura ambiente. Recentemente, descobrimos que a estrutura proteica resolvida a baixa temperatura pode não ser funcionalmente relevante, particularmente para proteínas de archaea termofílicas. Um procedimento foi desenvolvido para preparar amostras de proteína em temperaturas mais altas (até 70 °C) para análise crio-EM. Mostramos que as estruturas de amostras preparadas em temperaturas mais altas são funcionalmente relevantes e dependentes da temperatura. Aqui descrevemos um protocolo detalhado para a preparação de grades de amostras em alta temperatura, usando 55 °C como exemplo. O experimento utilizou um aparelho de vitrificação modificado com um tubo de centrífuga adicional, e as amostras foram incubadas a 55 °C. Os procedimentos detalhados foram ajustados para minimizar a condensação de vapor e obter uma fina camada de gelo na grade. Exemplos de experimentos bem-sucedidos e malsucedidos são fornecidos.
Introdução
A tecnologia crio-EM para a resolução das estruturas de complexos proteicos tem continuado a melhorar, particularmente no sentido da obtenção de estruturas de alta resolução 1,2. Nesse ínterim, o cenário de sua aplicação também foi ampliado pela variação das condições da amostra, como pH ou ligantes, antes do processo de vitrificação3, que envolve a preparação de grades de amostra seguidas de congelamento por imersão 4,5. Outra condição importante é a temperatura. Embora os experimentos de crio-EM, como a cristalografia de raios....
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Protocolo
NOTA: Este protocolo tem como objetivo utilizar um aparelho de vitrificação comercial modificado para preparar as amostras de microscopia crio-eletrônica (crio-EM) em temperaturas específicas, especialmente superiores a 37 °C. A configuração experimental geral é mostrada na Figura 1. O protocolo usa 55 °C como exemplo. Para as condições específicas a outras temperaturas, consultar o quadro suplementar 2 na referência12.
1. Preparação do aparelho de vitrificação
- Faça um furo de 1 cm em um tubo de centrífuga de 50 mL em sua extremidade fechada.
- Colocar o tubo na câmara....
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Resultados
A visão geral de baixa ampliação é mostrada na Figura 5A,B. O Painel A é um exemplo de uma grade bem-sucedida. Há um gradiente de gelo do canto superior esquerdo (mais espesso) para o canto inferior direito (mais fino ou vazio). Essa grade facilita a localização de uma espessura apropriada da camada de gelo na área do meio adequada para a coleta de dados, como as caixas azul e verde. A grade B está muito seca. Os quadrados na grade têm contraste brilhante, o que significa qu.......
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Discussão
Na etapa 1 do protocolo, certifique-se de que o tubo de centrífuga foi bem instalado e não cai quando o experimento está em andamento. Devido ao acúmulo de um grande número de gotículas de água na câmara, o que poderia alterar a capacidade de adsorção do papel de filtro, recomenda-se que o tempo total do experimento não exceda 30 min após a câmara do aparelho de vitrificação atingir a temperatura de equilíbrio. Se o tempo de operação exceder 30 min, o operador precisa substituir o papel de filtro e esperar que a cabine e.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Dr. Hervé Remigy da Thermo Fisher Scientific por conselhos úteis. Os experimentos de crio-EM foram realizados na Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). A ASCEM é apoiada pela Academia Sinica (Grant No. AS-CFII-108-110) e Taiwan Protein Project (Grant No. AS-KPQ-109-TPP2). Os autores também agradecem à Sra. Hui-Ju Huang pela assistência na preparação da amostra.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo Falcon | Falcon | 352070 | tamanho: 50 mL |
| Papel de filtro | Ted Pella | 47000-100 | Ø 55/20mm, Grau 595 |
| HI1210 | Leica | banho-maria | |
| K100X | Ciências de Microscopia | incandescente | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh grade | Ted Pella | 658-200--100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | imagem de baixa dose Vitrobot |
| Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Pinça Vitrobot | Ted Pella | 47000-500 |
Referências
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al.
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Reimpressões e permissões
