Apresentamos um protocolo de imagem ao vivo sem rótulos usando técnicas de microscopia de luz transmitida para capturar imagens, analisar e quantificar a cinética de crescimento do fungo filamentoso A. nidulans em culturas submersas e mídia sólida. Este protocolo pode ser usado em conjunto com microscopia de fluorescência.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Análise quantitativa da taxa de crescimento de nidulans aspergillus usando microscopia ao vivo e software de código aberto
Neste artigo
Resumo
Resumo
Está bem estabelecido que o crescimento de fungos filamentosos, principalmente dependentes de mudanças na taxa de crescimento hifa/micáceico, é macroscopicamente estimado em mídia solidificada comparando o tamanho da colônia. No entanto, medir quantitativamente a taxa de crescimento de cepas ou cepas fúngicas geneticamente diferentes sob diferentes condições ambientais/de crescimento (pH, temperatura, fontes de carbono e nitrogênio, antibióticos, etc.) é um desafio. Assim, a busca de abordagens complementares para quantificar a cinética do crescimento torna-se obrigatória para entender melhor o crescimento das células fúngicas. Além disso, é sabido que fungos filamentosos, incluindo aspergillus spp., possuem modos distintos de crescimento e diferenciação sob condições sub-aéreas em mídia sólida ou culturas submersas. Aqui, detalhamos um método microscópico quantitativo para analisar a cinética de crescimento do fungo modelo Aspergillus nidulans, utilizando imagens vivas em culturas submersas e mídia sólida. Capturamos imagens, analisamos e quantificamos as taxas de crescimento de diferentes cepas fúngicas de forma reprodutível e confiável usando um software livre de código aberto para bioimagens (por exemplo, Fiji), de uma forma que não exija qualquer experiência prévia de análise de imagem do usuário.
Introdução
Os fungos filamentosos são de grande importância socioeconômica e ecológica, sendo tanto cruciais quanto ferramentas industriais/agrícolas para a produção de enzimas e antibióticos1,2 e como patógenos de plantas agrícolas3, insetos depragas 4 e humanos3. Além disso, fungos filamentosos como os nidulans Aspergillus são amplamente utilizados como organismos-modelo para pesquisas fundamentais, como estudos em genética, biologia celular e evolutiva, bem como para o estudo da extensão hifal5. Fungos fil....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Preparação inóculo
NOTA: Todas as etapas devem ser executadas sob um gabinete de fluxo laminar.
- Estirpe de interesse fúngico, a partir de um estoque de glicerol (-80 °C) utilizando um laço de inoculação estéril, em placas de mídia mínima (MM) complementadas com os requisitos nutricionais adequados relevantes para a cepa examinada [MM: 10,0 g/L de glicose, solução de sal de 20 mL/L (solução de sal: 26 g/L KCl, 26 g/L MgSO4·7H2,O 76 g/L KH2PO4, 2,0 mL/L clorofórmio) e 1 mL/L de traços (elementos de traço: 40 mg/L Na2B4O7· H2O, 400 mg/L CuSO
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Seguindo este protocolo, capturamos e analisamos várias imagens correspondentes a diferentes estágios de crescimento/desenvolvimento do fungo filamentoso A. nidulans. Os dados apresentados neste estudo foram processados e analisados utilizando-se o software Fiji. As medições foram salvas como arquivos csv, estatisticamente analisadas e preparadas como gráficos usando software estatístico comercial e/ou linguagem de programação Python usando bibliotecas de software como pandas, numpy, statsmodels, matplotlib e se.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Monitorar o crescimento e o fenótipo das células fúngicas por microscopia de lapso de tempo é uma abordagem poderosa para avaliar o comportamento celular em tempo real e quantitativamente e com precisão e determinar com precisão se um tratamento medicamentoso específico e/ou intervenção genética resulta em crescimento celular detectável ou diferenças fenotípicas ao longo do tempo.
Neste estudo, foi descrita uma metodologia confiável de imagem de células vivas para medir e analisar quantitativa.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo projeto "Uma Infraestrutura de Pesquisa Grega para Visualização e Monitoramento de Processos Biológicos Fundamentais (BioImaging-GR)" (MIS 5002755) que é implementado sob a Ação "Reforço da Infraestrutura de Pesquisa e Inovação", financiado pelo Programa Operacional "Competitividade, Empreendedorismo e Inovação" (NSRF 2014-2020) e co-financiado pela Grécia e pela E. U.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Lâminas |
| de imagem 4-Ácido aminobenzóico | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genótipo: zhAΔ::p yrGAf; ngnAΔ::p yrGAf; pyroA4 pantoB100 / Referências:Coleção de laboratório, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Ácidos | Gibco | 223030 | |
| Biotina | Merck | B4639 | |
| Clorofórmio | Merck | 67-66-3 | |
| Sulfato de cobre (II) pentahidratado | Merck | C8027 | |
| Glicose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | Software | GraphPad Software Estatístico | |
| ImageJ | NIH | Software de processamento e análise | |
| de imagem Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Fosfato de ferro(III) | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Software do microscópio | |
| Sulfato de magnésio heptahidratado | Merck | 63138 | |
| Sulfato de manganês (II) monohidratado | Merck | M7899 | |
| Microscópio Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamida (Niacinamida) | Supelco | 47865-U | |
| Peptona | Millipore | 68971 | |
| Placas de Petri para Cultura Microbiológica | KISKER | G090 | |
| Cloreto de potássio | Merck | P4504 | |
| Fosfato de potássio monobásico | Merck | P5655 | |
| Cloridrato de piridoxina | Merck | P6280 | |
| Quali - Tubos de microcentrífuga, 1,7 mL, livre de DNase, RNase e pirogênio, estéril | KISKER | G052-S | |
| Quali - Tubos de Microcentrífuga, 2.0 mL, esterilizados | KISKER | G053-S | |
| Quali - Pontas Padrão, Biseladas, 100-1000 µ L | KISKER | VL004G | |
| Quali - Pontas Padrão, Biseladas, 1-200 µ L | KISKER | VL700G | |
| Pontas de Microvolume Quali, DNase-, RNase livre, 0,1-10 µ L/clear | KISKER | GC. DICAS. B | |
| Riboflavina (B2) | Supelco | 47861 | |
| Lâminas de bisturi NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Cloreto de sódio | Merck | S7653 | |
| Hidróxido de sódio | Merck | S8045 | |
| Tetraborato de sódio decahidratado | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP e H1-mRFP) | Genótipo: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / Referências:Coleção de laboratório, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genótipo: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4; pyrG89 / Referências: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Extrato de Levedura | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
Referências
- Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215(2020).
- Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
