Este protocolo apresenta uma técnica para mapeamento de alta resolução de locais de replicação em cromatina estruturalmente preservada in situ que emprega uma combinação de rotulagem EdU-streptavidin-Nanogold pré-incorporação e ChromEMT.
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Artigo de método
Domínios replicativos de imagem em Cromatina Ultraestruturalmente Preservada por Tomografia Eletrônica
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os princípios de dobramento do DNA no núcleo celular e suas transformações dinâmicas que ocorrem durante o cumprimento de funções genéticas básicas (transcrição, replicação, segregação, etc.) permanecem mal compreendidos, em parte devido à falta de abordagens experimentais para visualização de alta resolução de locis de cromatina específica em núcleos estruturalmente preservados. Aqui apresentamos um protocolo para a visualização de domínios replicativos na cultura de células monocamadas in situ, combinando rotulagem EdU de DNA recém-sintetizado com posterior detecção de rótulo com amplificação ag de partículas nanogold e coloração chromEM de cromatina. Este protocolo permite a rotulagem pré-incorporação de alto contraste e alta eficiência, compatível com a fixação tradicional de glutaraldeído que fornece a melhor preservação estrutural da cromatina para o processamento da amostra de temperatura ambiente. Outra vantagem da rotulagem pré-incorporação é a possibilidade de pré-selecionar células de interesse para secção. Isso é especialmente importante para a análise de populações de células heterogêneas, bem como compatibilidade com abordagens de tomografia eletrônica para análise 3D de alta resolução da organização cromatina em locais de replicação, e a análise do rearranjo pós-replicativo da cromatina e da segregação cromátide irmã na interfase.
Introdução
A replicação do DNA é um processo biológico básico necessário para cópia e transmissão fiel das informações genéticas durante a divisão celular. Em eucariotes mais altos, a replicação de DNA é submetida a uma regulação espátula-temporal apertada, que se manifesta na ativação sequencial das origens de replicação1. Origens de replicação vizinhas disparando sincronizadamente formam aglomerados de replicons2. Ao nível da microscopia óptica, locais de replicação contínua de DNA são detectados como focos de replicação de vários números e tamanhos. Os focos de replicação exibem padrões específicos de distribuição espacial dentr....
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Protocolo
O protocolo é otimizado para células aderentes e foi testado nas linhas celulares HeLa, HT1080 e CHO.
1. Rotulagem e fixação de células
- Células de placa em tampas limpas com ácido em uma placa de Petri de 3 cm. Cultivar as células na mídia recomendadas para a linha celular sendo usada para 70% de confluência.
- Adicione EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) de 10 mM de estoque para 10 μM de concentração final e coloque as células na incubadora por 10 minutos ou mais (dependendo do objetivo do experimento). Para pulsos mais curtos (até 2 minutos), prepare uma placa de Petri com mídia de cultura fresca pré-aquecid....
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Resultados
Os focos de replicação nos núcleos de células mamíferas apresentam padrões distintos de distribuição dentro do núcleo, dependendo da progressão da fase S. Esses padrões se correlacionam com a atividade transcricional do loci sendo replicado. Uma vez que o método aqui apresentado utiliza um procedimento de fixação bastante forte, é bastante simples o uso de rotulagem de pulso replicativo para detecção específica de cromatina loci em vários estados transcricionais, mesmo em condições que oferecem melhor preservação estrutu.......
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Discussão
O método descrito aqui tem várias vantagens em relação aos protocolos publicados anteriormente. Primeiro, o uso de Click-química para rotular DNA replicado elimina a necessidade de pré-requisito de desnaturação de DNA para detecção de BrdU com anticorpos, preservando assim melhor a ultraestrutura de cromatina.
Em segundo lugar, a utilização da biotina como um ligante secundário que é gerado após a fixação do glutaraldeído e a sacieciação adequada de grupos de aldeído desvinculados minimiza a .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado em parte pela RSF (subvenção nº 17-15-01290) e RFBR (subvenção nº 19-015-00273). Os autores agradecem ao programa de desenvolvimento da Universidade Estadual de Moscou Lomonosov (PNR 5.13) e ao Centro de Excelência Nikon em imagens correlativas do Instituto Belozersky de Biologia Físico-Química pelo acesso à instrumentação por imagem.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagente | |||
| 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| Ácido sulfônico 2-(4-morfolino)etano (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azida | Termo Fisher | A20012 | |
| biotina-azida | Lumiprobe | C3730 | |
| Albumina de soro bovino | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | |||
| (25%, grau EM) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Goma arábica | ACROS Organics | 258850010 | |
| Cloreto de magnésio | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| Galato de N-propila | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Lactato de prata | ALDRICH | 359750-5G | |
| Estreptavidina-AlexaFluor 488 conjugado | Termo Fisher | S11223 | |
| Conjugado estreptavidina-nanoouro | Nanoprobes | 2016 | |
| ácido tetracloroáurico | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris (hidroximetil) aminometano (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instrumentos | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper grades de slot único | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 conjunto de filtros de fluorescência (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternativas: Zeiss, Leica, Olympus |
| Faca de diamante Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternativas: Ted Pella |
| Microscópio fluorescente | Nikon | Ti-E | Alternativas: Zeiss, Leica, Olympus |
| Suporte de amostra de alta inclinação | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Microscópio eletrônico de transmissão operando a 200 kV no modo EFTEM, com goniômetro de alta inclinação | Jeol | JEM-2100 | Alternativas: FEI, Hitachi |
| Pinças | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrótomo | Leica | UltraCut-E | Alternativas: RMC |
| SoftwareAquisição de | |||
| imagem | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Processamento de imagem | Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
Referências
- Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. Replicating large genomes: divide and conquer. Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).
- Méchali, M. Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. ....
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Reimpressões e permissões
