Summary
Questo protocollo presenta una tecnica per la mappatura ad alta risoluzione dei siti di replicazione in cromatina strutturalmente conservata in situ che impiega una combinazione di marcatura EdU-streptavidin-Nanogold pre-incorporante e ChromEMT.
Abstract
I principi del ripiegamento del DNA nel nucleo cellulare e le sue trasformazioni dinamiche che avvengono durante l'adempimento delle funzioni genetiche di base (trascrizione, replicazione, segregazione, ecc.) rimangono poco compresi, in parte a causa della mancanza di approcci sperimentali alla visualizzazione ad alta risoluzione di specifici loci di cromatina in nuclei strutturalmente conservati. Qui presentiamo un protocollo per la visualizzazione di domini replicativi in colture cellulari monostrato in situ, combinando l'etichettatura EdU del DNA appena sintetizzato con la successiva rilevazione dell'etichetta con Ag-amplificazione delle particelle Nanogold e colorazione ChromEM della cromatina. Questo protocollo consente l'etichettatura pre-incorporamento ad alto contrasto e ad alta efficienza, compatibile con la tradizionale fissazione della glutaraldeide che fornisce la migliore conservazione strutturale della cromatina per l'elaborazione dei campioni a temperatura ambiente. Un altro vantaggio dell'etichettatura pre-incorporante è la possibilità di preselezionare le celle di interesse per il sezionamento. Ciò è particolarmente importante per l'analisi di popolazioni cellulari eterogenee, nonché per la compatibilità con gli approcci di tomografia elettronica all'analisi 3D ad alta risoluzione dell'organizzazione della cromatina nei siti di replicazione e all'analisi del riarrangiamento della cromatina post-replicativa e della segregazione cromatidica sorella nell'interfase.
Introduction
La replicazione del DNA è un processo biologico di base necessario per la copia fedele e la trasmissione delle informazioni genetiche durante la divisione cellulare. Negli eucarioti superiori, la replicazione del DNA è soggetta a una stretta regolazione spazio-temporale, che si manifesta nell'attivazione sequenziale delle origini di replicazione1. Le origini di replica vicine che sparano in modo sincrono formano cluster di replicons2. A livello di microscopia ottica, i siti di replicazione del DNA in corso vengono rilevati come focolai di replicazione di vari numeri e dimensioni. I focolai di replicazione mostrano modelli specifici di distribuzione spaziale all'interno del nucleo cellulare a seconda dei tempi di replicazione del DNA marcato 3,4, che, a sua volta, è strettamente correlato con la sua attività genica. Grazie a una sequenza ben definita di replicazione del DNA, rigorosamente ordinata nello spazio e nel tempo, l'etichettatura replicativa è un potente metodo di marcatura precisa del DNA non solo per lo studio del processo di replicazione in sé, ma anche per discriminare una specifica sottofrazione del DNA con attività di trascrizione e livello di compattazione definiti. La visualizzazione della cromatina replicante viene solitamente eseguita attraverso la rilevazione dei principali componenti proteici del meccanismo di replicazione del DNA (mediante immunocolorazione o espressione di tag proteici fluorescenti 5,6) o mediante incorporazione di precursori di sintesi del DNA modificati 7,8,9,10 . Di questi, solo i metodi basati sull'incorporazione di nucleotidi modificati nel DNA appena replicato consentono la cattura di cambiamenti conformazionali nella cromatina durante la replicazione e tracciano il comportamento dei domini replicativi dopo che la loro replicazione è stata completata.
Negli eucarioti superiori, il confezionamento del DNA in cromatina aggiunge un altro livello di complessità alla regolazione delle funzioni genetiche di base (trascrizione, replicazione, riparazione, ecc.). Il ripiegamento della cromatina influisce sull'accessibilità del DNA ai fattori trans regolatori e ai cambiamenti conformazionali del DNA (svolgimento a doppia elica) necessari per la sintesi del modello. Pertanto, è generalmente accettato che i processi sintetici dipendenti dal DNA nel nucleo cellulare richiedano una transizione strutturale della cromatina dal suo stato condensato e repressivo a una conformazione più accessibile e aperta. Citologicamente, questi due stati della cromatina sono definiti come eterocromatina ed eucromatina. Tuttavia, non c'è ancora consenso riguardo alla modalità di ripiegamento del DNA nel nucleo. Le ipotesi vanno da un modello di "fusione polimerica"11, in cui la fibra nucleosomiale si comporta come un polimero casuale per il quale la densità di impacchettamento è controllata da meccanismi di separazione di fase, a modelli gerarchici di piegatura postulando la formazione sequenziale di strutture simili a fibre di cromatina di spessore crescente12,13. I modelli di ripiegamento gerarchico hanno recentemente ottenuto il supporto di approcci molecolari basati sull'analisi dei contatti DNA-DNA in situ (cattura della conformazione cromosomica, 3C), dimostrando l'esistenza della gerarchia dei domini strutturali della cromatina14. È importante notare che le unità di replicazione sono correlate molto bene a questi domini della cromatina15. La principale critica di questi modelli si basa sulla potenziale aggregazione di cromatina artificiale causata da procedure di preparazione del campione, come la permeabilizzazione delle membrane cellulari e la rimozione di componenti non cromatinici, al fine di migliorare il contrasto della cromatina per studi ultrastrutturali migliorando al contempo l'accessibilità della cromatina per varie sonde (ad esempio, anticorpi). I recenti progressi tecnici nella colorazione selettiva del DNA per la microscopia elettronica mediante foto-ossidazione mediata da fluoroforo-legante il DNA della diaminobenzidina (ChromEMT6) hanno permesso l'eliminazione di questo ostacolo. Tuttavia, le stesse considerazioni valgono per la visualizzazione al microscopio elettronico del DNA replicante17,18. Qui descriviamo una tecnica che consente la mappatura ultrastrutturale simultanea ad alta risoluzione del DNA appena sintetizzato e della cromatina totale in cellule aldeidi-reticolate intatte. La tecnica combina il rilevamento del DNA marcato edU mediante Click-chemistry con sonde biotinilate e streptavidina-Nanogold e ChromEMT.
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Protocol
Il protocollo è ottimizzato per le cellule aderenti ed è stato testato su linee cellulari HeLa, HT1080 e CHO.
1. Etichettatura e fissazione delle celle
- Cellule di piastre su coperture pulite con acido in una capsula di Petri di 3 cm. Far crescere le cellule nel mezzo raccomandato per la linea cellulare utilizzata al 70% di confluenza.
- Aggiungere EdU (5-etinile-2'-deossiuridina) da 10 mM di stock a 10 μM di concentrazione finale e posizionare le cellule nell'incubatore per 10 minuti o più (a seconda dell'obiettivo dell'esperimento). Per impulsi più brevi (fino a 2 minuti), preparare una capsula di Petri con terreno di coltura fresco preriscaldato integrato con EdU da 10 μM e trasferire i coperchi in essa, piuttosto che aggiungere EdU direttamente alle cellule.
NOTA: Tutti i passaggi successivi vengono eseguiti a temperatura ambiente se non diversamente indicato. - Fissare le cellule etichettate con glutaraldeide al 2,5%, appena prodotta diluendo il 25% di brodo in tampone cacodilato da 100 mM, per 1 ora.
NOTA: i successivi passaggi di rilevamento EdU sono sensibili ai tempi di fissazione. Tempi di fissazione più lunghi possono influire negativamente sull'etichettatura EdU, causando un rapporto segnale-rumore inferiore. - Rimuovere la glutaraldeide lavando i campioni con PBS integrato con 5 mM MgCl2 (PBS* in seguito). Lavare tre volte con un'incubazione di 10 minuti per ogni lavaggio.
- Permeabilizzare le membrane plasmatiche con l'1% di Triton X-100 in PBS* (PBS*T in seguito). Lavare due volte con un'incubazione di 5 minuti per ogni lavaggio.
- Lavare abbondantemente il campione con PBS*. Eseguire cinque modifiche e incubare per 5 minuti in ogni cambiamento.
- Spegnere i gruppi aldeidi privi di residui con 20 mM di glicina in PBS*, due volte per 10 minuti ciascuno.
- Bloccare i campioni in BSA all'1% in PBS* per 30 minuti.
2. Click-reazione
Nota : questa procedura viene modificata da un protocolloprecedentemente pubblicato 19.
- Immediatamente prima dell'uso, preparare la miscela Click-reaction per il rilevamento edU: in un tubo microcentrifuga, miscelare 430 μL di 100 mM Tris-HCl (pH = 8,5), 20 μL di 100 mM CuSO4, 1,2 μL di biotina-azide (10 mM in DMSO) e 50 μL di acido ascorbico 0,5 M. Per il controllo di qualità dell'etichettatura replicativa e della procedura Click a livello di microscopia fluorescente, la biotina-azide può essere sostituita da AlexaFluor 488-azide.
NOTA: l'ordine di aggiunta dei componenti nella reazione di cui sopra è importante. - Eseguire la reazione a clic in una camera umida per ridurre al minimo l'evaporazione e gli spostamenti di concentrazione nel cocktail di reazione. Preparare la camera umida posizionando un foglio umido di carta da filtro sul fondo della capsula di Petri e coprendolo con un film di paraffina. Posizionare i coverslip sulla superficie del film con le cellule rivolte verso l'alto e lo strato di 50-100 μL del cocktail di reazione sul coverslip. La reazione dura 30 minuti a temperatura ambiente.
- Interrompere la reazione lavando il campione nello 0,1% di Triton X-100 in PBS* (PBS*T), cinque volte per 5 minuti ciascuno.
- Blocco in BSA all'1% in PBS*T per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Preparare la soluzione di streptavidina-Nanogold con PBS*T contenente l'1% di BSA. Incubare il campione con streptavidina, coniugata con particelle nanogold da 1,4 nm (nanosonde) in 1% BSA + PBS*T durante la notte a +4 °C nella camera umida appena preparata.
- Interrompere la reazione e lavare il campione in PBS*T, cinque volte per 10 minuti ciascuno.
- Stabilizzare il complesso di streptavidina biotina postfissorendo in glutaraldeide all'1% in PBS* per 30 min.
- Rimuovere la glutaraldeide mediante lavaggio intenso con acqua deionizzata e lavare il campione in PBS*, cinque volte per 20 minuti ciascuna.
- Spegnere i gruppi di aldeide libera con 1 mg/ mL di NaBH4 appena preparato in acqua, due volte per 10 minuti ciascuno. Durante l'incubazione, si formano bolle di H2 che possono sollevare le coperture. Spingili con attenzione verso il basso con le pinzette.
- Lavare con acqua deionizzata cinque volte per 5 minuti ciascuno.
NOTA: Per il controllo di qualità nella fase di etichettatura, è consigliabile eseguire l'etichettatura di controllo con streptavidina etichettata in modo fluorescente (Figura 2). Ciò fornirebbe una stima dell'intensità di etichettatura e del livello di fondo prima di passare a passaggi successivi noiosi e inclini agli artefatti.
3. Ag-amplificazione
NOTA: Questa procedura è stata modificata da Gilerovitch et al., 1995 (vedi 20,21).
- Sospendere 50 g di polvere di acacia in 100 ml di acqua deionizzata. Sciogliere per 3 giorni, degas e filtrare attraverso quattro strati di garza. Conservare congelato in aliquote da 5 mL in tubi da 50 mL. Scongelare immediatamente prima dell'uso.
- Aggiungere 2 mL di 1 M MES (pH = 6,1) a 5 mL di aliquota scongelata di soluzione di polvere di acacia per produrre 7 mL di 0,28 M MES (pH = 6,1) in soluzione di polvere di acacia. Mescolare facendo oscillare lentamente il tubo per 30 minuti. Avvolgere il tubo con un foglio per proteggerlo dalla luce.
- Contemporaneamente al passaggio 3.2., lavare le coperture con tampone di lavaggio (50 mM MES, pH = 5,8, 200 mM saccarosio), tre volte per 10 minuti ciascuna.
- Preparare la soluzione fresca di N-propil gallato (NPG). In un tubo da 15 ml, sciogliere 10 mg di GPL in 250 μL di etanolo al 96% e regolare a 5 ml con acqua deionizzata.
- Mettere 36 mg di lattato d'argento in un tubo da 15 ml avvolto in un foglio.
- Dopo il passaggio 3.2. è completato, aggiungere 1,5 ml di soluzione NPG alla miscela di polvere di acacia e roccia per altri 3 minuti.
NOTA: Tutti i passaggi successivi vengono eseguiti in camera oscura. Utilizzare safelight non attinica (gialla o rossa). - Equilibrare il campione con tampone di lavaggio e procedere verso la stanza buia. Contemporaneamente, aggiungere 5 ml di acqua deionizzata al lattato d'argento e sciogliere agitando vigorosamente per 1-2 min.
- Aggiungere 1,5 ml di soluzione di lattato d'argento alla miscela di polvere di acacia, dondolare lentamente per 1 minuto. Evitare la formazione di bolle, poiché l'ossigeno nella miscela rallenterà la reazione.
- Scolare la soluzione dal piatto con i coperchi e versare 3 ml di miscela di polvere di lattato d'argento e acacia sulle cellule. Cullare il piatto più volte e incubare per 2-5 minuti. Il tempo di incubazione dipende dal lotto di polvere di acacia e dalla temperatura. Questo dovrebbe essere definito sperimentalmente.
NOTA: un tempo di incubazione più lungo può comportare un legame d'argento non specifico. - Per fermare la reazione, scolare la miscela di reazione e lavare ampiamente il piatto con tre o cinque cambi di acqua deionizzata, seguiti da altri tre cambi per 5 minuti ciascuno.
- Controllare la colorazione al microscopio a campo luminoso. Una buona colorazione dovrebbe essere da marrone chiaro a marrone scuro con uno sfondo giallastro molto debole.
NOTA: Se la colorazione non si sviluppa, è possibile ripetere immediatamente con la miscela già fatta (la miscela è attiva per circa 15 minuti se mantenuta al buio). Tuttavia, la colorazione in questo caso potrebbe svilupparsi troppo velocemente.
4. Tonificazione dell'oro
NOTA: Al fine di proteggere le nanoparticelle d'argento dalla dissoluzione mediante ossidazione OsO4 nelle procedure successive, in questa fase viene utilizzata un'impregnazione con oro (Sawada, Esaki, 1994)22.
- Risciacquare le coperture con acqua deionizzata.
- Al fine di proteggere le nanoparticelle d'argento dalla dissoluzione mediante ossidazione OsO4 , incubare i campioni in acido tetracloroaurico allo 0,05% per 2 minuti al buio.
- Lavare accuratamente con acqua deionizzata per 10 minuti.
NOTA: In questa fase viene aggiunto un ulteriore contrasto al materiale contenente DNA. Il colore del campione dovrebbe cambiare da marrone a nero.
5. ChromEM
NOTA: Questo protocollo è stato modificato da Ou et al., 201716.
- Incubare i coverslip e saturare i campioni in DRAQ5 da 10 μM in PBS per 10 minuti al buio.
- Preparare la soluzione allo 0,2% di diaminobenzidina tetracloridrato (DAB) in 50 mM Tris o PBS:
sciogliere dab nel 90% del volume finale mescolando vigorosamente al buio, quindi regolare il pH a 7,0-7,4 con NaOH. Regolare il volume al 100% e filtrare attraverso un filtro da 0,22 μM, conservare avvolto in un foglio. - Aggiungere la soluzione dab alle cellule (2 mL per capsula di Petri da 3 cm) e incubare per 1 minuto.
- Spostare il coperchio nella capsula di Petri con fondo di vetro e posizionarlo sullo stadio di un microscopio invertito. Irradiare il campione (diversi campi visivi) su un microscopio invertito con sorgente luminosa ad alogenuri metallici e set di filtri Cy5 (640 nm, 1 W/cm2 sul piano focale) attraverso la lente Plan Apo λ 40х (NA = 0,95) per 10 min.
NOTA: Un'indicazione del successo della fotoconversione DAB è il completo fotosbiancamento DRAQ5 e la formazione di precipitati DAB scuri nei nuclei irradiati. Tuttavia, quest'ultimo non è sempre evidente su un intenso segnale EdU-argento-oro (specialmente quando vengono utilizzati impulsi EdU estesi). - Lavare con acqua deionizzata tre volte per 5 minuti ciascuna.
6. Disidratazione e incorporamento di resina epossidica
- In un tubo di microcentrifuga, preparare una soluzione di tetraossido di osmio parzialmente ridotta mescolando una soluzione acquosa al 2% di K4Fe(CN)6 con una quantità uguale di soluzione acquosa al 2% di OsO4, per ottenere una concentrazione finale dell'1% di entrambi i componenti. Incubare le coperture in OsO4 ridotto per 1 ora e lavare in acqua deionizzata tre volte per 5 minuti ciascuna.
NOTA: In questa fase il composto osmio ridotto reagisce con le deposizioni di DAB e aumenta il contrasto del DNA.
ATTENZIONE: l'osmio è tossico, lavora sotto una cappa aspirante e gestisce i rifiuti secondo le normative di sicurezza locali. - Disidratare i campioni in una serie di soluzioni di etanolo graduato in percentuali crescenti: 50% EtOH - 3 x 10 min; 70% EtOH - 3 x 10 min, 80% EtOH - 3 x 10 min, 96% EtOH - 3 x 10 min, 100% EtOH - 3 x 10 min.
- Per l'infiltrazione e l'incorporamento utilizzare la formula della resina con il rapporto volumetrico del componente come segue: monomero di resina epossidica: DDSA: MNA: DMP-30 = 9: 6: 4: 0.23 (w / w). Questa formula è miscibile con etanolo.
- Incubare il coverslip nella miscela etanolo-resina (3 parti 100% EtOH: 1 parte di resina epossidica) per 30 min.
- Incubare il coverslip nella miscela etanolo-resina (1 parte 100% EtOH: 1 parte resina epossidica) per 2 ore.
- Incubare il coverslip nella miscela etanolo-resina (1 parte 100% EtOH: 3 parti di resina epossidica) durante la notte.
- Sostituire la miscela etanolo-resina con resina pura appena preparata. Incubare in miscela di resina pura per 8 h. Aprire il piatto per far evaporare i resti di etanolo.
- Trasferire i coperchi in un nuovo piatto con resina pura e incubare per 2 ore a 37-42 °C.
- Riempire uno stampo in silicone con resina appena preparata. Posizionare i coverslip con le celle rivolte verso il basso su uno stampo di silicio appropriato riempito con resina epossidica. Polimerizzare la resina per 24 ore a 37 °C, quindi a 60 °C per almeno 2 giorni.
ATTENZIONE: I componenti della miscela di resine epossidiche sono potenziali agenti cancerogeni. Indossare guanti e lavorare sotto il cofano fumi.
- Rimuovere la lastra di resina dallo stampo, pulire la superficie del coperchio con il bisturi o la lama del rasoio. Per rimuovere il coperchio, far cadere il coperchio in azoto liquido e quindi trasferire la lastra nell'acqua bollente. Ripetere l'operazione se necessario.
- Individuare l'area irradiata sotto uno stereomicroscopio e ritagliarla dalla lastra con un seghetto o qualsiasi altro strumento adatto. Preriscaldare la lastra a 70 °C su una piastra calda, se necessario.
- Fissare il ritaglio in un portacampioni ultramicrotomico per il taglio finale del blocco. Usando il rasoio, prepara il campione a forma di piramide. Montare il supporto con piramide sull'ultramicrotomo e installare il coltello.
- Tagliare il blocco in modo che siano incluse le celle irradiate recanti l'etichetta EdU. Preparare una sezione semisottile (spessore 250 nm) adatta alla tomografia elettronica.
NOTA: lo spessore della sezione può essere regolato in base alle esigenze sperimentali.
- Tagliare il blocco in modo che siano incluse le celle irradiate recanti l'etichetta EdU. Preparare una sezione semisottile (spessore 250 nm) adatta alla tomografia elettronica.
- Staccare la sezione dal bordo del coltello e posizionarla sulle griglie a fessura singola. Per la tomografia elettronica, le sezioni da 250 nm vengono raccolte su griglie a fessura singola da 1 mm e dopo l'essiccazione queste sezioni possono essere rivestite di carbonio da entrambi i lati. Non è necessario alcun contrasto aggiuntivo.
NOTA: poiché le sezioni contengono già particelle Au-Ag ad alto contrasto, non è necessario aggiungere particelle di oro fiduciale alla superficie della sezione. - Esaminare le griglie in un microscopio elettronico a trasmissione a basso ingrandimento (circa 600x) per individuare le cellule con modelli di replicazione appropriati.
NOTA: questo protocollo genera una densità di etichettatura sufficientemente elevata per un facile rilevamento dei focolai di replica anche a basso ingrandimento. Si consiglia innanzitutto di creare una mappa della sezione per la successiva navigazione e la raccolta di proiezioni angolari per la tomografia. Passa a un ingrandimento più elevato e scatta immagini ad alta risoluzione.
7. Tomografia elettronica
- Inserire la griglia nel microscopio elettronico a trasmissione con un supporto ad alta inclinazione. Caricare il campione nel microscopio elettronico e individuare la regione di interesse.
- Allineare il microscopio in modalità EFTEM in modalità di illuminazione quasi parallela. Sintonizzare il filtro dell'energia con una fessura di selezione dell'energia a 20 eV posizionata a picco di perdita zero.
- Pre-irradiare l'area di acquisizione della tomografia ad una dose di 40 e/Å2/s per almeno 1,5-2 min, che corrisponde alla dose totale di almeno 3000 e/Å2.
- Regola l'altezza eucentrica con l'attività automatica in SerialEM. Controllare l'attività di messa a fuoco automatica per assicurarsi che funzioni correttamente con un angolo di inclinazione pari a zero e un valore di sfocatura target di -0,8 mkm.
- Inclinare il portacampioni a -60° con l'attività Walk-Up.
- Impostare l'acquisizione tomografica da -60 a +60° con passo 2,0°. L'esposizione deve essere impostata in base all'angolo di inclinazione per mantenere l'intensità media sulla fotocamera. Limitare lo spostamento dell'immagine nel caso in cui causi uno spostamento di energia e quindi un disallineamento della fessura. I dati della tomografia devono essere salvati come file .mrc.
- Importare il file .mrc nel software IMOD per la ricostruzione della tomografia. Rimuovere i valori dei pixel anomali dovuti ai raggi X.
- Allineare la serie di inclinazioni. Esegui la correlazione incrociata iniziale, quindi contrassegna manualmente 10-12 particelle d'oro come fiduciali. Tracciate il modello fiduciario e verificate che ogni fiduciale sia tracciato correttamente attraverso la serie tilt. Creare tomogrammi campione (fette) e contrassegnare manualmente i bordi della sezione sottile per evitare la possibile inclinazione della densità ricostruita all'interno del volume. L'errore residuo medio per l'allineamento fine era inferiore a 1,2 pix.
- Ricostruire il tomogramma con un algoritmo di retroproiezione filtrato e quindi tagliare l'output per adattare la regione di interesse al volume finale.
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Representative Results
I focolai di replicazione nei nuclei cellulari di mammifero mostrano modelli distinti di distribuzione all'interno del nucleo a seconda della progressione della fase S. Questi modelli sono correlati all'attività trascrizionale dei loci replicati. Poiché il metodo qui presentato utilizza una procedura di fissazione piuttosto forte, è abbastanza semplice utilizzare l'etichettatura replicativa degli impulsi per il rilevamento specifico dei loci della cromatina in vari stati trascrizionali, anche in condizioni che offrono la migliore conservazione strutturale della cromatina ottenuta mediante fissazione chimica a temperatura ambiente.
Le fasi di controllo della qualità hanno lo scopo di garantire il completamento con successo delle procedure chiave in questo protocollo. Inizialmente, il successo dell'etichettatura EdU dovrebbe essere confermato dalla reazione Click con azide marcata fluorescentemente, dimostrando i tipici modelli di replicazione se viene utilizzata una popolazione cellulare eterogenea (Figura 2). Il secondo passo importante è l'etichettatura della streptavidina, che può essere fortemente influenzata dalla fissazione della glutaraldeide. Per la valutazione dell'efficienza di legame con la streptavidina, utilizzare la streptavidina coniugata AlexaFluor-488 nelle stesse condizioni della streptavidina-Nanogold (Figura 3). A questo punto, ci si aspetta un po 'di background principalmente a causa dell'autofluorescenza della glutaraldeide e del wash-out incompleto della streptavidina. Se il rapporto segnale/rumore è inaccettabile, provare ad aumentare il numero e la durata delle fasi di lavaggio al passaggio 2.6. In alternativa, aggiungere la tempra della glutaraldeide con NaBH4 (passaggi 2.9-2.10) dopo il passaggio 1.5.
La procedura di miglioramento dell'argento spesso produce risultati incoerenti e richiede ottimizzazione. Innanzitutto, la velocità di reazione varia notevolmente a seconda del lotto di soluzione di polvere di acacia. La viscosità della soluzione è inversamente proporzionale al tempo di sviluppo della colorazione dell'argento. È una buona idea avere diverse aliquote dello stesso lotto e testarle sui campioni di controllo per determinare i tempi di reazione ottimali. Poiché anche la temperatura dei reagenti e dell'ambiente ha un impatto significativo sulla velocità di reazione, prova a eseguire la reazione alla stessa identica temperatura. Se si elaborano più di tre campioni contemporaneamente, è conveniente avviare la reazione a intervalli di 30 secondi per avere abbastanza tempo per le fasi di lavaggio.
Un buon risultato della procedura di potenziamento dell'argento è la colorazione marrone scuro di alcuni (non tutti) nuclei con colorazione citoplasmatica giallastra molto debole (Figura 4). Ciò significa che la dimensione media delle particelle d'argento è di circa 20 nm, che è adatta per un facile rilevamento dell'etichetta in un ampio intervallo di ingrandimento di TEM sulla controcolorazione della cromatina. Per gli esperimenti di tomografia, la dimensione delle particelle dovrebbe essere ridotta a circa 10 nm accorciando il tempo di reazione. Il colore in questo caso dovrebbe essere marrone chiaro o rossastro. Il colore della colorazione dell'argento deve essere controllato prima della tonificazione dell'oro.
La fotoconversione e l'osmificazione DAB vengono eseguite dopo la tonificazione dell'oro per proteggere i gusci d'argento dalla dissoluzione. In caso di insufficiente impregnazione dell'oro, le nanoparticelle d'argento vengono erose e acquisiscono una forma irregolare, ma rimangono ancora visibili sotto TEM. La qualità della fotoconversione DAB viene monitorata prima dallo sbiancamento DRAQ5 (in modalità fluorescenza), poi in modalità campo luminoso, quando i nuclei cellulari in un campo irradiato diventano marrone scuro (Figura 5). L'intensità della colorazione DAB non deve essere molto elevata in modo che la colorazione Ag-Au rimanga ben rilevata per consentire la selezione delle cellule con i tempi di replicazione richiesti per il sezionamento.
Le sezioni ultrasottili o semisottili non richiedono ulteriori macchie e possono essere visualizzate direttamente sotto TEM. L'etichettatura appropriata in genere si traduce in cluster ben definiti di nanoparticelle Ag che delimitano i siti di replicazione (Figura 6), mentre l'etichettatura di fondo è limitata a poche nanoparticelle per micrometro quadrato. Le sezioni semisottili sono pronte per la tomografia e non richiedono l'aggiunta di nanoparticelle d'oro alla superficie della sezione, poiché le nanoparticelle ag presenti in una sezione possono essere utilizzate come segni fiduciali (Figura 7). In questa figura, viene mostrato l'effetto del tempo di marcatura prolungato: i singoli focolai di replicazione si fondono in strutture simili a fibre, delineando domini di cromatina di ordine superiore.
Figura 1. Panoramica del metodo. Le cellule cresciute su coverslip sono etichettate con EdU, fissate con glutaraldeide al 2,5%, permeabilizzate e la reazione Click viene eseguita con azide biotinilato. In alternativa, gli azidi marcati fluorescenti vengono utilizzati nell'osservazione microscopica della luce. I siti di incorporazione della biotina sono etichettati con Nanogold-streptaviin (o streptavidina marcata fluorescentemente come controllo), argento potenziato e dopo la tonificazione dell'oro sottoposto a fotoconversione e osmificazione DAB mediata da DRAQ5. I campioni sono incorporati in resina epossidica, sezionati, esaminati in TEM e sottoposti a tomografia elettronica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Modelli di replicazione nelle cellule di mammifero rivelati dall'etichettatura EdU e dalla reazione Click (verde). La progressione della fase S dalla fase S iniziale a quella tardiva (da sinistra a destra) si manifesta con un cambiamento ordinato nei modelli di replicazione: A,B - fase S iniziale, C - fase S media, D,E - fase S tardiva. Il DNA è macchiato con DAPI (rosso). Barra scala = 10 um. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Modelli di replicazione nelle cellule di mammifero rivelati dall'etichettatura EdU e dalla colorazione Click-biotina e streptavidina-AlexaFluor 488 in due fasi dopo la fissazione della glutaraldeide. Il campione di controllo etichettato con streptavidina-AlexaFluor 488 mostra l'efficienza di etichettatura ottimale e il rapporto S / N dopo la fissazione della glutaraldeide. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Immagine rappresentativa delle cellule dopo la procedura di potenziamento dell'argento (Fase 3). Vari modelli replicativi (fase S iniziale, frecce; fase S media, punta di freccia; frecce tardive e doppie) sono facilmente visibili in una modalità di microscopia a luce brillante. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Un risultato tipico della fotoconversione DAB mediata da DRAQ5. (A) Colorazione DRAQ5 (il cerchio tratteggiato indica l'area irradiata). Si noti un forte sbiancamento DRAQ5 all'interno del cerchio. (B) La stessa area osservata al microscopio luminoso. Si noti una maggiore precipitazione di DAB nei nuclei nell'area irradiata. Inserto: le frecce indicano i primi nuclei della fase S in cui i modelli di replicazione etichettati con Ag-Au sono ancora facilmente rilevabili sullo sfondo della colorazione DAB foto-ossidata DRAQ5. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Focolai di replicazione nei nuclei cellulari di mammifero rivelati dall'etichettatura EdU e dalla colorazione a due fasi di Click-biotina e streptavidina-Nanogold dopo la fissazione della glutaraldeide. Sezioni sottili di 90 nm di una cellula in fase S che mostrano cluster di nanoparticelle ag-Au in focolai di replicazione (A, cerchi rossi). Il livello di fondo può essere apprezzato in una cella non in fase S (B). Le punte di freccia indicano fibre di cromatina di varie scale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7. Proiezione in inclinazione di 0° di sezione di 250 nm. (A) e sezione tomografica virtuale. (B) di un nucleo cellulare etichettato con EdU per 2 ore. Vedi i singoli focolai di replica fusi in strutture simili a fibre (punte di freccia). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo qui descritto presenta diversi vantaggi rispetto ai protocolli pubblicati in precedenza. In primo luogo, l'uso della Chimica del clic per etichettare il DNA replicato elimina la necessità del prerequisito di denaturazione del DNA per il rilevamento di BrdU con anticorpi, preservando così meglio l'ultrastruttura della cromatina.
In secondo luogo, l'utilizzo della biotina come ligando secondario generato dopo la fissazione della glutaraldeide e la corretta tempra dei gruppi aldeidici non legati riduce al minimo la modifica chimica del bersaglio, migliorando così l'efficienza dell'etichettatura e riducendo lo sfondo a causa della biotina endogena. La biotina-streptavidina aggiunge anche versatilità in quanto l'uso di streptavidina etichettata fluorescentemente fornisce un facile controllo di qualità nella fase iniziale della procedura. Il protocollo può essere ulteriormente semplificato con l'introduzione della streptavidina marcata con FluoroNanogold, tuttavia, nelle nostre mani questi reagenti hanno dato uno sfondo leggermente più elevato rispetto a Nanogold-streptavidina, forse a causa delle maggiori dimensioni delle sonde.
In terzo luogo, una combinazione di piccole sonde, streptavidina-Nanogold essendo il componente più grande di circa 5 nm, fornisce un'ottima penetrazione anche nelle cellule reticolate alla glutaraldeide. Ciò rende la tecnica adatta per l'etichettatura pre-incorporamento di cellule conservate in modo ottimale ultrastrutturalmente e facilmente compatibile con varie tecniche di microscopia elettronica 3D, tra cui la ricostruzione della sezione seriale, la tomografia array, la tomografia elettronica, l'imaging del volto a blocchi seriali e FIB-SEM.
Il miglioramento dell'argento è il passaggio più critico, che richiede un controllo preciso delle fasi di diffusione e lavaggio del reagente, che è più facile da eseguire con le cellule aderenti. D'altra parte, poiché una forte reticolazione con la glutaraldeide può anche influenzare il miglioramento dell'argento, le condizioni di fissazione dovrebbero essere messe a punto al fine di bilanciare la conservazione della struttura della cromatina e l'efficienza di miglioramento dell'argento. Per questo motivo, le tecniche di crio-fissazione/crio-sostituzione, che richiedono una post-fissazione estesa e scarsamente controllata, pur consentendo una conservazione della struttura ancora migliore, potrebbero non essere pienamente compatibili con la strategia di etichettatura proposta23. La tecnica può essere ulteriormente migliorata utilizzando Au-amplification invece di silver enhancement24. Questa modifica permette di saltare la fase di tonificazione dell'oro, tuttavia, nelle nostre mani, dà uno sfondo notevolmente più alto.
Infine, l'etichettatura pre-incorporamento consente la preselezione delle cellule bersaglio per ChromEM e il sezionamento in base al modello di replica rilevabile al microscopio a campo luminoso o fluorescente. Inoltre, il metodo può essere facilmente esteso al CLEM, comprese varie tecniche di super-risoluzione. Questo apre nuovi orizzonti negli studi sulla struttura e la dinamica della cromatina di ordine superiore in vari stati fisiologici. L'approccio che abbiamo descritto qui può essere utilizzato per studi sull'organizzazione della cromatina nei siti di replicazione, per l'analisi del riarrangiamento post-replicativo della cromatina, compresa l'imaging ad alta risoluzione della segregazione cromatidica in interfase, e per l'etichettatura replicativa di grandi domini cromosomici e studi di ripiegamento della cromatina di ordine superiore di specifiche frazioni del genoma (eucromatina o eterocromatina, etichettata in base ai tempi di replicazione). Questi tipi di tecniche di imaging sono anche importanti come punto di riferimento per i dati generati da approcci alternativi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato in parte da RSF (grant #17-15-01290) e RFBR (grant #19-015-00273). Gli autori ringraziano il programma di sviluppo della Lomonosov Moscow State University (PNR 5.13) e il Nikon Center of Excellence in correlative imaging presso il Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology per l'accesso alla strumentazione di imaging.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
References
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