Vesículos extracelulares (EVs) contribuem para a biologia celular e comunicações intercelulares. Há necessidade de ensaios práticos para visualizar e quantificar a absorção de EVs pelas células. O protocolo atual propõe o ensaio de absorção de EV utilizando imagens de fluorescência tridimensional através de microscopia confocal, após o isolamento do EV por um dispositivo microfluido baseado em nanofilição.
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Artigo de método
Ensaio de absorção de vesícula extracelular via análise de imagens de microscópio confocal
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Há necessidade de ensaios práticos para visualizar e quantificar a absorção de vesícula extracelular (EV) das células. A captação de EV desempenha um papel na comunicação intercelular em diversas áreas de pesquisa; biologia do câncer, neurociência e entrega de drogas. Muitos ensaios de absorção de EV foram relatados na literatura; no entanto, há uma falta de metodologia experimental prática e detalhada. A absorção de EV pode ser avaliada rotulando fluorescentemente EVs para detectar sua localização dentro das células. A distinção entre EVs internalizados nas células e os EVs superficiais nas células é difícil, mas crítica, determinar com precisão a absorção de EV. Portanto, um ensaio que quantifica eficientemente a absorção de EV através de microscopia de fluorescência tridimensional (3D) é proposto neste trabalho. Os EVs fluorescentes foram preparados usando um dispositivo microfluido baseado em nanofiliação, visualizado por microscopia confocal 3D e, em seguida, analisados através de software avançado de processamento de imagem. O protocolo fornece uma metodologia robusta para a análise de EVs em nível celular e uma abordagem prática para uma análise eficiente.
Introdução
Vesículas extracelulares (EVs) são partículas nano-dimensionadas e ligadas à membrana lipídica que são categorizadas por seus tamanhos: ectosomos (100-500 nm) e exosósmos (50-150 nm)1. Os EVs contêm várias biomoléculas, como proteínas, ácidos nucleicos e lipídios. Essas biomoléculas originam-se das células antes de serem encapsuladas como carga e liberadas no espaço extracelular via EVs1,2,3.
Devido à variedade de sua carga, acredita-se que os EVs desempenham um papel ativo na comunicação intercelular. A liberação e....
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Protocolo
1. Isolamento de EV e rotulagem EV imuno-fluorescente on-chip
- Coleta de mídia de cultura celular (CCM) e pré-processamento de CCM para isolamento de EV
- Células de semente PC3 a 30% de confluência em um frasco de cultura celular de 75 cm2 . Permitir que as células de controle cresçam até 90% de confluência (~48 h) em mídia padrão e suplementos específicos de linha celular.
NOTA: Para evitar que os componentes contendo EV afetem a captação celular (ou seja, soro bovino fetal), use mídia e suplementos exososome-esgotados. - Colhe o CCM.
- Centrifugar o CCM a 1000 x g por 10 minutos à temperatura ambiente (RT) par....
- Células de semente PC3 a 30% de confluência em um frasco de cultura celular de 75 cm2 . Permitir que as células de controle cresçam até 90% de confluência (~48 h) em mídia padrão e suplementos específicos de linha celular.
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Resultados
Utilizando um dispositivo microfluido à base de nano-filtração, os EVs foram isolados do PC3 CCM e rotulados com um anticorpo ev específico (CD63) conjugado por fluoroforeiro (Figura 1). Os EVs rotulados foram visualizados com sucesso pela microscopia confocal 3D (Figura 2). Os EVs rotulados foram incubados com células por várias horas em mídia exosome-esgotada. Após a incubação, as células foram lavadas com mídia exósia esgotada. Os EVs restantes foram internal.......
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Discussão
Um ensaio de absorção de EV baseado em imagens de fluorescência 3D via microscopia confocal fornece uma metodologia eficiente e uma análise sensível. Esta rotulagem fluorescente de EV facilita a visualização de EVs e executa com sucesso um ensaio preciso de absorção de EV. Métodos anteriores para rotular EVs e remover o corante residual foram relatados removendo a precipitação usando ultracentrifugação (UC); no entanto, a UC pode co-precipitar EVs, e o corante imobilizado pode levar a um sinal .......
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Divulgações
Y.-K. Cho é um inventor das patentes do dispositivo microfluido baseado em nanofiliação, Exodisc, que são licenciados para Labspinner (Ulsan, Coreia). Todos os outros autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo NCI Grant Nos. U54CA143803, CA163124, CA093900 e CA143055 a K. J. P. Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa do Korea Health Technology P&D Project através do Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), financiado pelo Ministério da Saúde & Bem-Estar, República da Coreia (número de subvenção: HI19C1122). Trabalho de J. Kim e Y.-K. Cho foi apoiado pelo Institute for Basic Science (IBS-R020-D1), financiado pelo Governo coreano. Os autores agradecem aos atuais e antigos membros do Instituto Urológico Brady, especialmente membros do laboratório Pienta-Amend, pela leitura crítica do manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 anticorpo anti-CD63 humano | Biolegend | 353038 | Anticorpo específico EV conjugado com corante fluorescente |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Reagente de marcação fluoressent de células vivas (citoplasma) |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objetiva para imagens confocais, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objetivo para imagens confocais, NA=0,75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | Um dispositivo microfluídico baseado em nanofiltração para isolamento EV |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Dispositivo de operação para |
| Exodisc FBS Thermo | Fisher Scientific | A2720801 | Nutriente de meios de cultura celular para coleção EV derivada de linha celular PC3 |
| Soro bovino fetal (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutriente para cultivo celular |
| Cabra Anti-rato IgG H& L abcam pré-adsorvido | ab7063 | Anticorpo IgG de camundongo para controle negativo da rotulagem EV | |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Prato de cultura para imagem confocal |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Software de processamento pós-imagem |
| Sistema de incubadora + CO2/O2/N2 misturador de gás | Instrumento de célula viva | TU-O-20 | Sistema de incubadora para imagem de células vivas |
| Câmera Nikon A1 HD25 / A1R HD25 | Nikon | NA | Câmera para imagem confocal |
| Nikon Eclipse Ti microscópio | Nikon | NA | Microscópio invertido para imagem confocal |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Software de processamento de imagem para microscópio Nikon |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Dispositivo de medição para concentração EV |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Software gráfico |
| Penicilina-Estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibióticos para cultivo celular |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Meios de cultura celular para cultivo de linha celular PC3 |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solução em DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | Corante fluorescente de coloração de RNA para a rotulagem EV |
Referências
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Sunkara, V., Woo, H. -K., Cho, Y. -K. Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular ve....
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Reimpressões e permissões
