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Artigo de método

Medição da Composição do Complexo de Sinalização e Processamento de Indução de Morte CD95 de Procaspase-8 neste Complexo

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⸱

DOI:

10.3791/62842

⸱

2 de agosto de 2021

 , 
1Translational Inflammation Research, Center of Dynamic Systems, Otto von Guericke University Magdeburg

Neste artigo

Resumo

Aqui, é apresentado um fluxo de trabalho experimental que permite a detecção do processamento caspase-8 diretamente no complexo de sinalização indutor de morte (DISC) e determina a composição desse complexo. Essa metodologia possui amplas aplicações, desde a desvendação dos mecanismos moleculares das vias de morte celular até a modelagem dinâmica das redes de apoptose.

Resumo

A apoptose extrínseca é mediada pela ativação de receptores de morte (DRs) como CD95/Fas/APO-1 ou ligante indutor de fator de necrose tumoral (TRAIL)-receptor 1/receptor 2 (TRAIL-R1/R2). A estimulação desses receptores com seus ligantes cognatos leva à montagem do complexo de sinalização indutor da morte (DISC). O DISCO compreende dr, a proteína adaptadora Fas com domínio de morte (FADD), procaspases-8/-10, e interleucina semelhante a FADD celular (IL)-1β-conversão de proteínas inibitórias de enzimas (c-FLIPs). O DISCO serve como uma plataforma para processamento e ativação procaspase-8. Este último ocorre por meio de sua dimerização/oligomerização nos filamentos de domínio de efeito de morte (DED) montados no DISC.

A ativação do procaspase-8 é seguida pelo seu processamento, que ocorre em várias etapas. Neste trabalho, descreve-se um fluxo de trabalho experimental estabelecido que permite a medição da formação de DISC e o processamento do procaspase-8 neste complexo. O fluxo de trabalho é baseado em técnicas de imunoprecipitação apoiadas pela análise de manchas ocidentais. Este fluxo de trabalho permite um monitoramento cuidadoso de diferentes etapas do recrutamento procaspase-8 para o DISCO e seu processamento e é altamente relevante para investigar mecanismos moleculares de apoptose extrínseca.

Introdução

Um dos receptores de morte (DRs) mais bem estudados é o CD95 (Fas, APO-1). A via poptótica extrínseca começa com a interação do DR com seu ligante cognato, ou seja, o CD95L interage com cd95 ou trail liga-Rs. Isso resulta na formação do DISCO no DR. DISC correspondente composto por CD95, FADD, procaspase-8/-10 e proteínas c-FLIP1,2. Além disso, o DISCO é montado por interações entre proteínas contendo domínio de morte (DD), como CD95 e FADD, e proteínas contendo DED, como FADD, procaspase-8/-10 e c-FLIP(Figura 1). O Procaspase-8 passa por oligomerização via associação de seus DEDs, resultando na formação de filamentos de DED, seguido pela ativação e processamento do Procaspase-8. Isso desencadeia uma cascata de caspase, que leva à morte celular(Figura 1)3,4. Assim, o procaspase-8 é um caspase iniciador central da via de apoptose extrínseca mediada por CD95 ou trail-Rs, ativada na plataforma macromolecular correspondente, DISC.

Dois isóformes de procaspase-8, ou seja, procaspase-8a (p55) e -8b (p53), são conhecidos por serem recrutados para o DISC5. Ambas as isoformas compreendem dois DEDs. DED1 e DED2 estão localizados na parte n-terminal do procaspase-8a/b seguido pelos domínios catalíticos p18 e p10. A análise detalhada da microscopia crio-elétron (crio-EM) dos DEDs procaspase-8 revelou a montagem de proteínas procaspase-8 em estruturas filamentos filamentos de ded chamados filamentos DED4,6. Notavelmente, as cadeias lineares procaspase-8 foram inicialmente sugeridas para serem engajadas na dimerização seguida pela ativação procaspase-8 no DISC. Agora, sabe-se que essas cadeias são apenas uma subestrutura do filamento procaspase-8 DED, este último compreendendo três cadeias montadas em uma tríplice hélice3,4,6,7.

Após a dimerização no filamento de DED, alterações conformais no procaspase-8a/b levam à formação do centro ativo do procaspase-8 e sua ativação3,8. Isso é seguido pelo processamento procaspase-8, que é mediado por duas vias: a primeira passa pela geração de um produto de decote p43/p41 e a segunda através da geração inicial de um produto de decote p30. A via p43/p41 é iniciada pelo decote de procaspase-8a/b em Asp374, resultando em produtos de decote p43/p41 e p12(Figura 2). Além disso, esses fragmentos são auto-catalicamente cortados em Asp384 e Asp210/216, dando origem à formação do heterotetramer caspase ativo-8, p102/p1829,10,11. Além disso, mostrou-se que paralelamente à via p43/p41 de processamento, o procaspase-8a/b também é cortado em Asp216, o que leva à formação do produto de decote terminal C p30, seguido por sua proteólise para p10 e p1810 (Figura 2).

A ativação procaspase-8a/b no filamento DED é estritamente regulada por proteínas chamadas c-FLIPs12. As proteínas c-FLIP ocorrem em três isoformas: c-FLIPLong (c-FLIPL),c-FLIPShort (c-FLIPS)e c-FLIPRaji (c-FLIPR). Todos os três isoforms contêm dois DEDs em sua região n-terminal. c-FLIPL também possui um terminal C catalyticamente inativo como o domínio caspase12,13. Ambos os isoformes curtos de c-FLIP-c-FLIPS e c-FLIPR-ajam de forma anti-apoptótica interrompendo a formação de filamento de DED no DISC6,14,15. Além disso, o C-FLIPL pode regular a ativação caspase-8 de forma dependente da concentração. Isso pode resultar em efeitos pró e anti-apoptóticos16,17,18. Ao formar o catalisticamente ativo procaspase-8/c-FLIPL heterodimer, c-FLIPL leva à estabilização do centro ativo do procaspase-8 e sua ativação. A função pró ou anti-apoptótica do c-FLIPL depende diretamente de sua quantidade nos filamentos de DED e da quantidade subsequente de heterímeros procaspase-8/c-FLIPL 19. Concentrações baixas ou intermediárias de c-FLIPL no DISCO resultam em quantidades suficientes de heterodimers procaspase-8/c-FLIPL no filamento DED, que suporta a ativação de caspase-8. Em contraste, o aumento das quantidades de c-FLIPL levam diretamente aos seus efeitos anti-apoptóticos no DISC20.

Em conjunto, a ativação e processamento do procaspase-8a/b no DISCO é um processo altamente regulamentado envolvendo várias etapas. Este artigo discute a medição do processamento procaspase-8 diretamente no DISCO, bem como a análise da composição deste complexo. Este será apresentado utilizando o CD95 DISC como o complexo dr exemplar.

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Protocolo

Os experimentos com células T foram realizados de acordo com o acordo ético 42502-2-1273 Uni MD.

1. Preparando células para o experimento

NOTA: O número médio de células para esta imunoprecipitação é de 1 × 107. Células aderentes devem ser semeadas um dia antes do experimento para que haja 1 × 107 células no dia do experimento.

  1. Preparando células aderentes para o experimento
    1. Semente 5-8 × 106 células aderentes em 20 mL de meio (ver a Tabela de Materiais para a composição) para cada condição em pratos de 14,5 cm um dia antes do início do experimento.
    2. No dia do experimento, certifique-se de que as células são 80-90% confluentes e aderentes ao prato. Descarte o meio e adicione meio fresco às células aderentes.
  2. Preparando células de suspensão para o experimento
    1. Coloque cuidadosamente 1 × 107 células de suspensão em 10 mL de meio de cultura (ver a Tabela de Materiais para a composição) por condição em pratos de 14,5 cm imediatamente antes do início do experimento.
    2. Se usar células primárias, isole as células T primárias de acordo com o procedimento descrito anteriormente21. T tratar células T primárias com fitohemagglutinina de 1 μg/mL por 24 h, seguido por 25 tratamento U/mL IL2 por 6 dias.
    3. Coloque cuidadosamente 1 × 108 células T primárias em 10 mL de meio de cultura (ver a Tabela de Materiais para a composição) por condição em pratos de 14,5 cm imediatamente antes do início do experimento.
      NOTA: Recomenda-se um maior número de células T primárias, uma vez que essas células são menores.

2. Estimulação CD95L

  1. Estimule as células com CD95L (produzido como descrito anteriormente20 ou comercialmente disponível (ver a Tabela de Materiais).).
    NOTA: A concentração do CD95L e o tempo de estimulação são dependentes do tipo celular13,15,22,23,24,25. Prepare duas vezes uma condição de estimulação para gerar uma amostra de "controle de contas".
    1. Estimule as células aderentes com a concentração selecionada de CD95L. Segure a placa em um ângulo e coloque a ligadura no meio sem tocar nas células aderentes.
    2. Estimule as células de suspensão com CD95L, canalização da solução de ligadura na suspensão celular.

3. Colheita celular e lise

  1. Coloque os pratos de celular no gelo.
    NOTA: Não descarte o meio. Células moribundas flutuam no meio e são importantes para a análise.
  2. Adicione 10 mL de soro fisiológico a frio (PBS) à suspensão celular e raspe as células anexadas da placa. Colete a suspensão da célula em um tubo de 50 mL.
  3. Lave o prato da célula com 10 mL de PBS frio duas vezes e coloque a solução de lavagem no mesmo tubo de 50 mL. Centrifugar a suspensão da célula a 500 × g por 5 min, 4 °C.
  4. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota celular com 1 mL de PBS frio. Transfira a suspensão da célula para um tubo de 1,5 mL.
  5. Centrifugar a suspensão da célula a 500 × g por 5 min, 4 °C. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota celular com 1 mL de PBS frio.
  6. Centrifugar a suspensão da célula a 500 × g por 5 min, 4 °C. Descarte o supernascimento e resuspenque a pelota celular com 1 mL de tampão de lise (contendo 4% de coquetel inibidor de protease). Incuba-lo por 30 minutos no gelo.
  7. Centrifugar o lysate em velocidade máxima (~17.000 × g) por 15 min, 4 °C.
  8. Transfira o supernatante (lise) para um tubo limpo. Descarte a pelota. Tome 50 μL do lysate em outro tubo. Analise a concentração de proteínas pelo ensaio de Bradford e tome a quantidade de lise correspondente a 25 μg de proteína em um frasco. Adicione o tampão de carga (consulte a tabela de materiais para a composição) ao frasco. Armazene-o a -20 °C como controle de lise.

4. Imunoprecipitação (IP)

  1. Adicione 2 μL de anticorpos anti-APO-1 e 10 μL de proteínaS A sepharose (preparada conforme recomendado pelo fabricante) ao liseto. Adicione apenas 10 μL das contas a um tubo separado contendo liseto (amostra estimulada) para gerar um "controle de contas".
    NOTA: Use pontas de pipet com orifícios largos, cortando as pontas ou comprando dicas especiais para IP enquanto manuseia as contas de proteína A sepharose.
  2. Incubar a mistura de liseto com anticorpos/proteínaSA contas de sepharose com mistura suave durante a noite a 4 °C. Centrifugar os lises com anticorpos/proteínaS Uma semente de sepharose a 500 × g por 4 min, 4 °C. Descarte o supernatante, adicione 1 mL de PBS frio às contas e repita esta etapa pelo menos três vezes.
  3. Descarte o supernatante. Aspire as contas de preferência com uma seringa Hamilton de 50 μL.

5. Mancha ocidental

  1. Adicione 20 μL de tampão de carga de 4x (consulte a tabela de materiais para a composição) às contas e aqueça a 95 °C por 10 min. Aqueça os controles de lise a 95 °C por 5 min.
  2. Carregue os lises, IPs e um padrão proteico em um gel de sulfato de dodecyl de sódio (SDS) de sódio de 12,5% (veja a tabela de materiais para a preparação do gel) e corra com uma tensão constante de 80 V.
  3. Transfira as proteínas do gel SDS para uma membrana nitrocelulose.
    NOTA: Aqui, a técnica semi-seca, otimizada para as proteínas de interesse, foi utilizada para a transferência ao longo de 12 min (25 V; 2,5 A= constante). Mergulhe a membrana de nitrocelulose e duas mini-pilhas de transferência em tampão de eletroforese (consulte a Tabela de Materiais para a composição, prepare-se de acordo com as instruções do fabricante) por alguns minutos antes da mancha ocidental.
  4. Coloque a membrana manchada em uma caixa e bloqueie-a por 1h na solução de bloqueio (0,1% Tween-20 em PBS (PBST) + 5% de leite). Incubar a membrana com a solução de bloqueio sob agitação suave.
  5. Lave a membrana três vezes com PBST por 5 min cada lavagem.

6. Detecção de manchas ocidentais

  1. Adicione o primeiro anticorpo primário na diluição indicada (ver a Tabela de Materiais) à membrana e incuba-o durante a noite a 4 °C com agitação suave.
  2. Lave a membrana três vezes com PBST por 5 min cada lavagem.
  3. Incubar a membrana com 20 mL de anticorpo secundário (diluído 1:10.000 em PBST + 5% de leite) com agitação suave por 1h à temperatura ambiente.
  4. Lave a membrana três vezes com PBST por 5 min cada lavagem.
  5. Descarte PBST e adicione aproximadamente 1 mL de substrato de peroxidase de rabanete à membrana.
  6. Detecte o sinal quimioluminescente (ver a Tabela de Materiais).
    NOTA: O tempo de exposição e o número de imagens capturadas dependem da quantidade de proteína na célula e da especificidade dos anticorpos utilizados. Deve ser estabelecido empiricamente para cada anticorpo utilizado para a detecção.

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Resultados

Para analisar o recrutamento caspase-8 para o DISCO e seu processamento no DISCO CD95, este artigo descreve um fluxo de trabalho clássico, que combina IP do CD95 DISC com análise de manchas ocidentais. Isso permite a detecção de várias características-chave da ativação caspase-8 no DISCO: a montagem da plataforma macromolecular ativante caspase-8, o recrutamento do procaspase-8 para o DISCO e o processamento desta caspase iniciadora(Figura 1 e Figura 2). Este fl...

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Discussão

Esta abordagem foi descrita pela primeira vez por Kischkel et al.27 e foi desenvolvida com sucesso desde então por vários grupos. Várias questões importantes devem ser consideradas para a eficiente imunoprecipitação disc-imunoprecipitação e monitoramento do processamento caspase-8 neste complexo.

Em primeiro lugar, é essencial seguir todas as etapas de lavagem durante a imunoprecipitação. Especialmente importantes são as etapas finais de lavagem das contas de sepharose ...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

Reconhecemos a Wilhelm Sander-Foundation (2017.008.02), o Centro de Sistemas Dinâmicos (CDS), financiado pelo Programa EUROPEU ERDF (European Regional Development Fund) e o DFG (LA 2386) por apoiar nosso trabalho. Agradecemos a Karina Guttek por apoiar nossas experiências. Reconhecemos o Prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburg) por nos fornecer células T primárias.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
12,5% de gel SDSpor si mesmopara dois géis separadores:
3,28 mL destilado H2O
2,5 mL Tris; pH 8,8; 1,5 M
4,06 mL acrilamida
100 µ L 10% SDS
100 µ L 10% APS
7,5 µ L TEMED

para dois géis coletores:
3,1 mL de H2O
1,25 mL de Tris; pH 6,8; 1,5 M
0,5 mL de acrilamida
50 µ L 10% SDS
25 µ L 10% APS
7,5 µ L TEMED
14,5 cm pratos de célulasGreiner639160
acrilamidaCarl RothA124.1
Pontas de pipeta de filtro de aerossol com filtro de alta recuperação e orifício largoVWR46620-664 (América do Norte) ou 732-0559 (Europa)Usado para pipetar grânulos para o lisado
anti-actina AbSigma AldrichA2103diluição: 1:4000 em PBST + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Abfornecido nesses experimentos pelo Prof. P. Krammer ou pode ser adquirido por EnzoALX-805-038-C100usado apenas para imunoprecipitação
anti-caspase-10 AbBiozolMBL-M059-3diluição: 1:1000 em PBST + 1:100 NaN3
>anti-caspase-3 Sinalizaçãode células9662 Sdiluição: 1:2000 em PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-8 Ab C15fornecido nesses experimentos pelo Prof. P. Krammer ou pode ser adquirido por ENZOALX-804-242-C100diluição: 1:20 em PBST + 1:100 NaN3
>anti-CD95 AbSanta Cruzsc-715diluição: 1:2000 em PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Abfornecido nesses experimentos pelo Prof. P. Krammer ou pode ser adquirido por ENZOALX-804-961-0100diluição: 1:10 em PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Abfornecido nesses experimentos pelo Prof. P. Krammer ou pode ser adquirido por ENZOADI-AAM-212-Ediluição: 1:10 em PBST + 1:100 NaN3
>anti-PARP Sinalizaçãode células9542diluição: 1:1000 em PBST + 1:100 NaN3
APSCarl Roth9592.3
β-mercaptoetanolCarl Roth4227.2
Solução de Bradford
Concentrado de Reagente de Corante de Ensaio de Proteína 450ml		Bio Rad500-0006usado de acordo com as instruções do fabricante
CD95Lfornecidas nesses experimentos pelo Prof. P. Krammer ou pode ser adquirido peloALX-522-020-C005

Chem Doc XRS+		Bio Rad
Coquetel Inibidor de Protese Completo (PIC)Sigma Aldrich11 836 145 001preparado de acordo com as instruções do fabricante
DPBS (10x) sem Ca, MgPAN BiotechP04-53500diluição 1:10 com H2O, armazenamento no
tampão de eletroforesede geladeira de fabricaçãoprópria10x tampão de eletroforese:
60,6 g Tris
288 g glicina
20 g SDS
ad 2 L H2O
diluição 1:10 antes do uso
glicinaCarl Roth3908.3
Cabra Anti-Rato IgG1 HRPSouthernBiotech1070-05diluição 1:10.000 em PBST + 5% leite
Cabra Anti-Rato IgG2b HRPSouthernBiotech1090-05diluição 1:10.000 pol PBST + 5% de leite
de cabra Anti-Rabbit IgG-HRPSouthernBiotech4030-05diluição 1:10.000 em PBST + 5% de leite
Interleucina-2 Humana (hIL-2)Merckgroup / Roche11011456001para ativação de células T
KClCarl Roth6781.2
KH2< / sub>PO4< / sub>Carl Roth3904.1
tampão de carga
4x Tampão de amostra Laemmli, 10 mL		Bio Rad161-0747preparado de acordo com as instruções do fabricante
Substrato Luminata Forte Western HRPTampãoWBLUFO500
auto-fabricado13,3 mL Tris-HCl; pH 7,4; 1,5 M
27,5 mL NaCl; 5 M
10 mL EDTA; 2 mM
100 mL Triton X-100
adicionar 960 mL H2O
meio para células adhaerent DMEM F12 (1:1) w glutamina estável,  2.438 g/LPAN BiotechP04-41154adicionando 10% FCS, 1% Penicilina-Estreptomicina e 0.0001% Puromicina ao meio
para células T primáriasgibco da Life Technologie21875034adicionando 10% FCS e 1% Penicilina-Estreptomicina ao
meio leite em póCarl RothT145.4
Na2HPO4Carl RothP030.3
NaClCarl Roth3957.2
PBSTauto-fabricado20x PBST:
230 g NaCl
8 g KCl
56,8 g Na2HPO4
8 g KH2PO4
20 mL Tween-20
ad 2 L H2O
diluição 1:20 antes do uso
PBST + 5% de leiteself-made50 g de leite em pó + 1 L PBST
PHAThermo Fisher ScientificR30852801para ativação de células T
Power Pac HC BioRad
Precision Plus Protein Standard All BlueBio Rad161-0373use entre 3-5 e micro; L
Protein A Sepharose CL-4B beadsNovodirect/ Th.GeyerGE 17-0780-01grânulos de resina de afinidade preparados de acordo com as instruções do fabricante
raspadorVWR734-2602
SDSCarl Roth4360.2
shakerHeidolph
azida sódicaCarl RothK305.1
TEMEDCarl Roth2367.3
Trans Blot Turbo pilhas de transferência de tamanho miniBio Rad170-4270usado de acordo com as instruções do fabricante
TransBlot Turbo 5x Transfer BufferBio Rad10026938preparado de acordo com as instruções do fabricante
TransBlot Turbo Membrana de nictrocelulose de tamanho miniBio Rad170-4270usado de acordo com as instruções do fabricante
Trans-Blot-TurboBio Rad
TrisChem Solute8,08,51,000
Triton X-100Carl Roth3051.4
Tween-20Pan Reac Appli ChemA4974,1000
feito Ab Ab detector de quimioluminescência ENZO de lise Millipore

Referências

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