Summary
Målet med metoden er å screene for hypertermi eller varmeinduserte anfall i musemodeller. Protokollen beskriver bruken av et spesialbygd kammer med kontinuerlig overvåking av kroppstemperaturen for å avgjøre om forhøyet kroppstemperatur fører til anfall.
Abstract
Transgene musemodeller har vist seg å være kraftige verktøy for å studere ulike aspekter av menneskelige nevrologiske lidelser, inkludert epilepsi. SCN1A-assosierte genetiske epilepsier utgjør et bredt spekter av anfallsforstyrrelser med ufullstendig penetrans og klinisk variasjon. SCN1A-mutasjoner kan resultere i et stort utvalg av anfall fenotype som spenner fra enkle, selvbegrensede feberrelaterte feberrelaterte feberanfall (FS), genetisk epilepsi på moderat nivå med feberanfall pluss (GEFS+) til mer alvorlig Dravet syndrom (DS). Selv om FS ofte ses hos barn under 6-7 år som ikke har genetisk epilepsi, fortsetter FS hos GEFS+ pasienter å forekomme i voksen alder. Tradisjonelt har eksperimentell FS blitt indusert hos mus ved å utsette dyret for en strøm av tørr luft eller varmelamper, og endringshastigheten i kroppstemperaturen er ofte ikke godt kontrollert. Her beskriver vi et spesialbygd varmekammer, med en plexiglassfront, som er utstyrt med en digital temperaturregulator og en varmeapparatutstyrt elektrisk vifte, som kan sende oppvarmet tvungen luft inn i testarenaen på en temperaturkontrollert måte. Kroppstemperaturen til en mus plassert i kammeret, overvåket gjennom en rektal sonde, kan økes til 40-42 °C på en reproduserbar måte ved å øke temperaturen inne i kammeret. Kontinuerlig visuell overvåking av dyrene i oppvarmingsperioden viser induksjon av varmeinduserte anfall hos mus som bærer en FS-mutasjon ved en kroppstemperatur som ikke fremkaller atferdsmessige anfall hos villtype kullkamerater. Dyr kan enkelt fjernes fra kammeret og plasseres på en kjølepute for raskt å returnere kroppstemperaturen til normal. Denne metoden gir en enkel, rask og reproduserbar screeningprotokoll for forekomst av varmeinduserte anfall i epilepsimusmodeller.
Introduction
Epilepsi, den fjerde vanligste familien av nevrologiske lidelser i USA1, er preget av en ubalanse av eksitatorisk og hemmende drivkraft i CNS som fører til tilbakevendende anfall. Feberbeslag (FS) eller feberrelaterte anfall kan forekomme i befolkningen generelt, oftest hos barn så tidlig som 3 måneder opp til 6-7 år. Men hos enkelte individer med genetiske mutasjoner, oftest i et natriumkanalgen, kan FS vedvare utover 7 år i voksen alder. Denne tilstanden kalles feberanfall pluss eller FS+. Raske fremskritt innen genomsekvensering har identifisert over 1300 mutasjoner i det humane natriumionkanalgenet SCN1A, noe som gjør det til et hotspot for epilepsimutasjoner. SCN1A-mutasjoner har vært knyttet til et bredt spekter av anfallsforstyrrelser, inkludert feberbeslag (FS), genetisk epilepsi med feberanfall pluss (GEFS+) og Dravet syndrom (DS)2,3,4,5,6. Omtrent 20% av SCN1A missense mutasjoner fører til GEFS + 5,7,8. Pediatrisk historie med kompleks eller langvarig FS i barndommen kan senere utvikle seg til mer svekkende former for epilepsi som temporal lobe epilepsi (TLE)9,10,11. Dravet syndrom oppstår på grunn av avkortingsmutasjoner eller tap av funksjonsmutasjoner i SCN1A og er en alvorlig form for intractable epilepsi, med barndoms utbrudd av feberanfall som utvikler seg til ildfaste anfall, og er ofte forbundet med kognitive, utviklingsmessige og motoriske svekkelser2,5,12 . Siden mange individer med GEFS+ og/eller DS viser feberanfall, blir det viktig å utvikle nye terapier for bedre å bekjempe disse anfallsforstyrrelsene.
Dyremodeller av SCN1A assosiert epilepsi har vist seg uvurderlig i karakterisering av ulike typer anfall (febril vs generalisert) og dissekering av nevronmekanismen for anfallsgenerasjon13,14,15,16,17,18. Mens studien av spontane anfall via EEG / EMG-opptak i gnagerhjerner er godt etablert og er et veldig nyttig verktøy, har bare noen få studier forsøkt å etterligne feberbeslag i musemodeller14,16,19,20,21,22,23 . Tidligere studier har brukt en stråle med oppvarmet tørr luft, eller en metakrylatsylinder utstyrt med et termisk system, eller varmelamper med temperaturregulator i lukkede testarenaer9,16,21,22,23,24 for å indusere anfall via hypertermi. For å øke kroppstemperaturen i et mer kontrollert miljø, bruker protokollen som er beskrevet her et spesialbygget kammer med et temperaturkontrollert varmesystem som tillot reproduserbare økningshastigheter i kroppstemperaturen til en mus inne i kammeret. Varmekammeret ble konstruert av tre (lengde 40 cm x bredde 34 cm x høyde 31 cm) og ble utstyrt med en digital temperaturregulator med K termokobling. En liten aksialvifte utstyrt med en varmeapparat på baksiden av kammeret leder oppvarmet luft inn i kammeret regulert av en digital temperaturregulator. Dette tvungne luftvarmesystemet gjør det mulig å kontrollere hastigheten kammertemperaturen øker med. (Figur 1A,B). K-termoelementet inne i trevarmekammeret sender tilbakemelding til den digitale temperaturregulatoren for å opprettholde konstante temperaturer inne i esken under analysen. Hvis du stiller inn temperaturen på den digitale temperaturregulatoren, kan den elektriske viften sende oppvarmet tvungen luft gjennom ventiler for å varme opp kammeret jevnt (figur 1A). Frontpanelet på varmekammeret er et klart plexiglassark for å muliggjøre enkel videoopptak av forsøkene.
Voksne (P30-P40) mus, heterozygote for en missense mutasjon i SCN1A som får GEFS+ og et likt antall villtype kullkamerater til å fungere som kontrollgruppen, ble valgt for hvert eksperiment. Dyr, både menn og kvinner, som ble brukt i disse studiene veide minst 15 g, da villmus som veide mindre var mer følsomme for varmeinduserte anfall enn tyngre dyr i samme alder. I pilotstudien ble både mutant- og villtypemus observert for å oppsøke de kjøligere hjørnene av kammeret på baksiden og forble der i lengre perioder. For å omgå dette ble effektiv gulvstørrelse inne i varmekammerets testarena redusert til lengde 16,5 cm x bredde 21,5 cm x høyde 27,5 cm ved å plassere en treblokk B (mål 20 cm x 8 cm x 7,2 cm) på høyre side av kammeret (figur 1A). Varmekammeret ble konstruert av 1,9 cm tykt kryssfiner (lengde 40 cm x bredde 34 cm x høyde 31 cm) dekket med hvitt laminat og utstyrt med en digital temperaturregulator med K termokobling. Kammerveggenes laminatoverflate er ugjennomtrengelig og kan enkelt desinfiseres mellom forsøk ved å tørke av med 70% etanol. Temperaturen på varmekammeret ble i utgangspunktet satt til 50 °C og forvarmet i minst 1 time før starten av eksperimentet, for å sikre jevn oppvarming inne i kammeret. Hver mus var utstyrt med et rektal termometer for kontinuerlig overvåking av kroppstemperatur gjennom hele eksperimentet. En enkelt mus ble plassert i kammeret om gangen og temperaturen ble holdt ved 50 °C mellom 1.-10. Temperaturen ble deretter hevet til 55 °C i 11.-20. minutt, og til slutt hevet til 60 °C i 21.-30. Dette resulterte i en reproduserbar økning i musens kroppstemperatur (figur 2A). Hver prøveversjon ble filmet, og atferdsanalyse ble utført offline.
Varmeprotokollen kan enkelt modifiseres for å endre den opprinnelige temperaturen på varmekammeret og hastigheten som kammeret oppvarmes, noe som igjen endrer hvor raskt kroppstemperaturen til musen er forhøyet under analysen. Dermed gir denne metoden mer fleksibilitet i forhold til tradisjonelle metoder for å sette opp atferdsskjermer som involverer varmeinduserte anfall. Den varmeinduserte anfallsprotokollen kan også brukes til å screene for antiepileptika som gjør mutantmus mer motstandsdyktige mot varmeinduserte anfall eller øker terskeltemperaturen der anfall observeres. På samme måte kan gunstige effekter av restriktive diettregimer som keto-diett på varmeinduserte anfall undersøkes i normale chow-matet vs keto-matede mus.
Figur 1: Beskrivelse av det spesialbygde musevarmekammeret. (A) Frontpanelet på tremusens varmekammer viser sidekontrollpanelet som inneholder Power ON/OFF-bryteren som slår på digital temperaturregulator, K-termokobling, vifteovnens PÅ/AV-bryter og varmeindikator. De ytre dimensjonene på boksen og den indre testarenaen vises i cm. En treblokk B som brukes til effektivt å redusere testarenaoverflaten, vises også. Bunnen av testarenaen er dekket med cob sengetøy for å forhindre at mus kommer direkte i kontakt med oppvarmede treflater. (B) Bakpanelet på varmekammeret viser viften montert på toppluftventilen og strømledningen for å levere strøm til kammeret. Dette tallet er modifisert fra figur 3 i Das et al., 2021, eNeuro14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Protocol
Alle dyreprosedyrer ble utført i samsvar med retningslinjene til Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of California, Irvine.
1. Forberedelse for den varmeinduserte anfallsanalysen
- Slå på strøm på-knappen på varmekammeret, etterfulgt av Heat On-knappen .
- Still inn temperaturen på varmekammeret ved 50 °C ved hjelp av tastaturet på den digitale temperaturregulatoren.
- Vent i minst 1 time for å forvarme kammeret ved 50 °C før du introduserer den første musen i kammeret. Forvarming sikrer jevn oppvarming inne i kammeret.
- Line gulvet i musen varmekammer med cob sengetøy.
- Monter et videoopptakskamera foran varmekammeret for opptak av hver varmeinduserte anfallsanalyseforsøk.
- Line en 140 mm diameter Petri parabolen med tykke lag med vev papir og plassere den på is for å tjene som en kjølepute.
MERK: På slutten av analysen vil den enkelte musen bli overført på den forhåndsstøttede kjøleputen for å bidra til å få ned den forhøyede kroppstemperaturen.
2. Forbereder musen for varmeindusert anfallsanalyse
- Velg 10 voksne mus (P30-P40), 5 som bærer epilepsien som forårsaker mutasjon og 5 av de ville kullkameratene for varmeindusert anfallsscreeningsanalyse.
MERK: Ville mus, som ikke har epilepsi som forårsaker mutasjon, viser ikke varmeinduserte anfall ved temperaturer under 44 °C og fungerer som kontrollgruppe. - Vei hver mus som skal brukes til screeninganalysen og registrer kroppsvekten. Bare mus som veier 15 g eller mer, bør brukes til analysen.
- Screen én mus om gangen i musens varmekammer.
- Bedøv musen kort i 10-15 s ved hjelp av noen dråper isofluran på bunnen av en klokkeburk.
- Ta dyret ut av klokkeburken og legg det på et papirhåndkle.
- Kontroller at musen er fullstendig bedøvet ved å kontrollere at musen ikke reagerer på en skadelig knip.
- Belegge metallspissen på rektal temperatursonden med et smøremiddel (for eksempel petroleumjell) og sett den forsiktig inn i musen på en dybde på mindre enn eller lik 2 cm.
- Fest rektalsonden til musens hale med tape, slik at sonden ikke kommer ut under analysen.
MERK: Alternativt kan du plassere dyret i en musestøttekjeks og sette inn rektal temperatursonden. Fest den ved å teipe til halen. - Kontroller at rektalsonden er koblet til et multimeter som viser musens indre kroppstemperatur.
- Plasser dyret i et friskt bur foret med cob sengetøy, det vil si gjenopprettingsburet.
- Start en timer og vent i 5 min. Vær oppmerksom på musen til den er fullstendig gjenopprettet fra anestesi og musen er aktiv og grooming.
- Samtidig kan du overvåke musens kjernetemperatur til den stabiliserer seg ved 35-36 °C.
- På slutten av 5 min, legg merke til musens kroppstemperatur. Dette er den første kroppstemperaturen på tidspunktet "0" min.
MERK: Hvis musens kjernetemperatur er under 35 °C, må du vente på ekstra tid til dyret kommer seg etter anestesiindusert hypotermi. - Overfør raskt den enkelte musen til det forvarmede musekammeret. Dette markerer starten på eksperimentforsøket. Bare én mus vises på et gitt tidspunkt.
3. Varmeindusert anfallsanalyse
- Etter å ha plassert musen forsiktig på gulvet i det forvarmede musevarmekammeret, lukker du plexiglassdøren og starter kameraet for videoopptak av eksperimentet.
- Start stoppeklokken. Registrer kroppstemperaturen til musen fra rektaltermometeret med 1 min intervaller i løpet av eksperimentet.
- Med jevne mellomrom øker temperaturen på musens varmekammer slik at musens kroppstemperatur øker med en hastighet på 0,25-0,5 °C /min.
MERK: Rask økning i kroppstemperaturen kan føre til varmeslag eller død og bør unngås. - Etter denne protokollen, øke temperaturen på musen varmekammeret med 5 °C hver 10 min som vist i figur 2A.
- På 9,5 min, sett temperaturen på varmekammeret til 55 °C, for å stabilisere varmekammerets temperatur til 55 °C i det tiende minuttet som vist på den digitale temperaturdisplayet.
- På samme måte øker du temperaturen til 60 °C ved 19,5 min for å stabilisere varmekammerets temperatur til 60 °C ved 20 minutter . Hver beslag screening studie varer i 30 min.
- Hvis musen har et anfall (vokaliserer, viser hodeknusing, forbensklonus, bakhåndsforlengelse, faller på siden eller opplever generaliserte tonic / kloniske kramper), skriv inn følgende informasjon.
- Registrer kroppstemperaturen til musen under anfallet (anfallsterskeltemperatur) fra rektal temperaturtermometeret.
- Registrer anfallsadferdsegenskapene som hodeknusing, forbensklonus, bakre lemforlengelse, fallende på siden og / eller generaliserte toniske / kloniske anfall (GTCS) som vises av musen.
- Ta raskt, men forsiktig opp musen fra kammeret og legg den på kjøleputen som er klargjort i trinn 1.6.
MERK: Hvis en mus opplever Racine skala 5 anfall og viser ukontrollert hopping, kan det være vanskelig å plukke opp dyret fra varmekammeret og overføres til kjøleputen utenfor. Imidlertid varer et typisk varmeindusert anfall mellom 30 s og 60 s.Dermed bør musen tas ut av varmekammeret og settes på kjøleputen innen 60 s etter starten av varmeindusert anfallsepisode. - Vent til musens kroppstemperatur kommer ned til 36-37 °C, før du overfører den til et gjenopprettingsbur. Bare en mus er plassert i et gjenopprettingsbur om gangen.
MERK: Ikke bland mus som ennå ikke er brukt til varmeindusert screening med musen som allerede har opplevd den varmeinduserte anfallseksperimentstudien. - Klipp forsiktig og forsiktig båndet mellom musehalen og rektal sondetråden med en saks for å fjerne rektal sonde fra musen.
- Tørk av metallspissen på rektalsonden med 70 % alkohol- og bløtvevsservietter for å holde den klar til neste prøve.
- Fortsett å observere musen i gjenopprettingsburet til den gjenopptar normal aktivitet (turgåing, grooming, etc.), før du returnerer musen til hjemmeburet. Dette markerer slutten på eksperimentforsøket for denne musen.
- Registrer dyrestatusen etter analysen levende og gjenopprettet fra testøkten eller død. Høyintensitetsbeslag som involverer ukontrollert hopping og generaliserte toniske/kloniske anfall kan noen ganger føre til musens død.
- Hvis en mus ikke opplever varmeinduserte anfall innen observasjonsperioden på 30 minutter eller musens kroppstemperatur når 44 °C, fjerner du musen fra varmekammeret og legger den på kjøleputen til kroppstemperaturen på musen går tilbake til 36-37 °C.
- Tilbakestill temperaturen på musens varmekammer til 50 °C og la det likevekte til visningstemperaturen på den digitale temperaturregulatoren viser 50 °C.
- Endre cob sengetøy mellom individuelle museforsøk.
- Forbered neste muse for screeningprøve som beskrevet i avsnitt 2, og gjenta trinnene fra avsnitt 3.
4. Euthanizing dyrene
- Selv om de fleste dyr gjenoppretter etter varmeinduserte anfall, gjennomgår noen av musene etter vår erfaring SUDEP (Sudden Unexplained Death in EPilepsy) i deres hjemmebur innen 24-48 timer etter varmeinduserte anfall. Etter å ha avsluttet screeningen på alle musene individuelt for varmeinduserte anfall etter 30 min-studien, euthanize alle musene i henhold til institusjonens IACUC-retningslinjer.
5. Analysere de varmeinduserte anfallsdataene
- Etter å ha fullført screeningen av en kohort av dyr, beregn prosentandelen mus i en gitt genotype som viser anfall ved hjelp av følgende formel:
- Beregn gjennomsnittlig anfallsterskeltemperatur for mus innenfor en gitt genotype ved å beregne anfallsterskeltemperaturen til alle mus (notert i trinn 3.7) i den genotypen som viser varmeinduserte anfall.
- Mens du fortsatt er blind for identiteten og genotypen, kan du spille av videoopptakene til hver av musene på nytt under den varmeinduserte anfallsanalysescreeningen på en dataskjerm for å score alvorlighetsgraden av anfallskamper.
- Gi score til individuelle mus som viser varmeindusert anfallsatferd ved å bruke den modifiserte Racine scale13 som beskrevet i tidligere studier13,14. Se tabell 1 for mer informasjon.
- Hvis en mus, mens du opplever varmeinduserte anfall, bare viser hode nikking, gi den en poengsum på 2. Hvis en mus starter en anfallsepisode med hode nikking, men også viser forelimb clonus, faller over, og / eller hopping gi den en score på 5.
- Registrer den maksimale poengsummen for hver mus ved hjelp av den endrede Racine-skalaen13 som beskrevet ovenfor.
- Plott en scatter-graf med maksimale Racine-score utstilt av alle mus i en gitt genotype.
- Sammenlign statistisk maksimal Racine-skår mellom forskjellige musegrupper som en metode for å bestemme alvorlighetsgraden av atferdsmessige anfall som varmeinduserte anfall.
MERK: Racine-score er nyttige for å sammenligne anfallsegenskaper mellom forskjellige mutante musgrupper eller genotyper. Det forventes at de ville musene ikke ville gjennomgå varmeinduserte anfall og ikke måtte vurderes for Racine score sammenligninger. - Basert på eksperimentell design, utfør passende statistisk analyse for å avgjøre om prosentandelen mus som viser anfall mellom villtype og mutantmus, og deres gjennomsnittlige anfallsterskeltemperaturverdier er betydelig forskjellig fra hverandre.
| Racine Score | Anfallskarakteristikker | ||
| 0 | Ingen anfall | ||
| 1 | Munn- og ansiktsbevegelser | ||
| 2 | Hode nikker | ||
| 3 | Forelimb clonus, vanligvis en lem | ||
| 4 | Forelimb clonus med oppdrett | ||
| 5 | Generalisert tonisk-klonisk anfall, oppdrett, hopping, fallende over | ||
Tabell 1: Racine scorer.
Representative Results
Dyremodeller med feberanfallmutasjoner forventes å gjennomgå varmeinduserte anfall ved forhøyede kroppstemperaturer som ikke induserer anfall i villtype kullkamerater. SCN1A mutasjoner har vært knyttet til feber anfall, inkludert K1270T GEFS + pasienter, som viser både febril og afebrile generaliserte anfall7. Vi screenet CRISPR genererte SCN1A K1270T GEFS + mutantmus nylig beskrevet i en studie14 for forekomst av varmebeslag i to genetiske bakgrunner - anfallsbestandig 129X1 / SvJ (129X1) og anfallsforutsetter C57BL / NJ (B6N) bakgrunn. Alderstilpassede villtype kullkamerater i musens varmekammer som ikke har noen GEFS + mutasjoner og dermed ikke forventes å vise varmeinduserte anfall, fungerte som kontrollgruppen. Hastigheten på kroppstemperaturendringen over tid ble evaluert ved å plotte gjennomsnittlig kroppstemperatur for mus registrert hvert minutt under analysen. Det var ingen forskjell i endring av kroppstemperatur mellom heterozygote mutantmus og villtype kullkamerater testet i respektive 129X1 og B6N genetisk bakgrunn (figur 2B, C). Dette antyder at termoregulering ikke endres i K1270T GEFS + heterozygote mutantmus.
Alle heterozygote mutantmus fra 129X1 (n = 15) eller B6N (n = 9) genetiske bakgrunner viste varmeinduserte anfall (figur 2D). Ingen av de ville musene i 129X1 beriket bakgrunn (n = 13) viste varmeinduserte anfall (figur 2D). Derimot viste en tredjedel av musene som ble testet (n = 3 av de 9 musene) i den anfallssensitive B6N-bakgrunnen varmeinduserte anfall. Statistisk sammenligning viser at prosentandelen heterozygote mutante mus som viste varmeinduserte anfall var betydelig høyere enn deres respektive motstykkemus av villtype i både 129X1 og B6N genetisk bakgrunn (figur 2D, Fishers eksakte test, 129X1 p < 0,0001; B6NJ p = 0,009). Den gjennomsnittlige anfallsterskeltemperaturen mellom de heterozygote mutantmusene i 129X1 og B6N genetisk bakgrunn var lik. 129X1 mutantmus har en gjennomsnittlig anfallsterskeltemperatur på 42,6 ± 0,20 °C, som ikke var signifikant forskjellig fra den gjennomsnittlige anfallsterskeltemperaturen på 42,7 ± 0,06 °C sett hos B6N-mus (figur 2E; to-tailed uparret student t-test, p = 0,782). Det er viktig å merke seg at den gjennomsnittlige anfallsterskeltemperaturen til tre B6N villtype mus som viste varmeinduserte anfall var 43,7 ± 0,08 °C og betydelig høyere enn den gjennomsnittlige anfallsterskelen på 42,7 ± 0,06 °C vist av B6N heterozygote mutantmus (figur 2E, to-tailed uparret Student t-test, p < 0.0001).
Pleksiglassfronten av kammeret gjør det mulig å gjøre kontinuerlige videoopptak under analysen som senere kan brukes til å score for anfallsgrad i hver mus på en modifisert Racine-skala som beskrevet tidligere14,20. Under en typisk analyse ville heterozygote mutante mus vise varmeinduserte anfall med vokalisering og/eller hode-nikking (Racine score 2), og raskt overgang til forelimb clonus, fallende på siden, hopping, bakbensforlengelse og/eller generaliserte toniske/kloniske anfall (Racine scorer 3-5) når kroppstemperaturen nådde ca. 42 °C. Maksimal Racine-skår representerer den mest alvorlige varmeinduserte anfallsatferden blant mutantmusene. Maksimal Racine-skår av heterozygote mutante mus i 129X1 beriket bakgrunn (n = 15) er ikke forskjellig fra heterozygote mutante mus i B6N (n = 9) genetisk bakgrunn (figur 2F; Mann-Whitney test, p > 0,9999). Dette antyder at varmeinduserte anfallsadferdsegenskaper hos K1270T GEFS + mutantmus er uavhengige av belastningsbakgrunn.
Samlet viser dataene at alle mutante mus viser varmeinduserte anfall med lignende frekvens, anfallsterskeltemperatur og atferdsbeslags alvorlighetsgrad på en belastningsuavhengig måte. De fleste villtype kullkamerater viser ikke slike anfall ved eller under 44 °C. Omtrent en tredjedel av de ville kontrollmusene i en anfallssensitiv B6N-bakgrunn viste varmeinduserte anfall (muligens på grunn av genetiske bakgrunnseffekter), men anfallsterskeltemperaturen var betydelig høyere sammenlignet med mutante mus i samme bakgrunn. Disse resultatene tyder på at mutante mus i B6N genetisk bakgrunn er utsatt for varmeinduserte anfall ved lavere temperaturterskler på grunn av SCN1A GEFS + mutasjonen de har. Ved hjelp av denne protokollen kan man derfor evaluere varmeinduserte anfall hos epilepsimutantmus og skille fra villtype kullkameratmus, som enten ikke gjennomgår varmeinduserte anfall eller viser varmeanfall ved betydelig høyere temperaturer.
Figur 2: Mutantmus viser varmeinduserte anfall. (A) Varmeprotokollen for atferdsscreening av varmeinduserte anfall hos mus. (B-C) Gjennomsnittlig kroppstemperatur for mus over tid i villtype (Scn1a +/+ - svarte trekanter) og heterozygot mutant (Scn1aKT/+ - oransje sirkler) mus i to genetiske bakgrunner 129X1 og B6N, henholdsvis. (D) Prosentandel av mus som viser varmeinduserte anfall i begge genetiske bakgrunner. Wild-type (Scn1a+/+) og heterozygote (Scn1aKT/+) mus er representert av henholdsvis svarte og oransje stenger. Heterozygote mutanter i 129X1- og B6N-bakgrunn vises i oransje heltrukket felt og oransje stenger med henholdsvis svarte striper. (E) Anfallstemperaturterskel for varmeinduserte anfall i villtype (Scn1a+/+) og heterozygot mutant (Scn1aKT/+) mus i begge stammer. (F) Spredningsfordeling av maksimale Racine-skår av varmeinduserte anfall utstilt av heterozygote (Scn1aKT/+) mus i begge genetiske bakgrunner. Hver prikk representerer maksimal Racine-poengsum i én enkelt mus. Antall dyr i hver genotype vises i parentes. Data vist i paneler B-F er gjennomsnittlige ± S.E.M. Dette tallet er modifisert fra figur 3 i Das et al., 2021, eNeuro14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Vi beskriver en enkel og effektiv protokoll for å screene for forekomst av varmeinduserte anfall hos mus, atferdsekvivalenten til feberanfall hos menneskelige pasienter. Analysen evaluerer flere parametere - inkludert prosentandelen mus som viser anfall, anfallsterskel, alvorlighetsgrad av anfall på en Racine-skala, for å sammenligne følsomheten til kontroll- og testmusgrupper for å øke kroppstemperaturen.
Et kritisk skritt i denne protokollen innebærer å øke varmen i kammeret mens du kontinuerlig overvåker kroppstemperaturen til musen. Det er viktig at den maksimale kroppstemperaturen musene vil oppleve i disse analysene er 44 °C fordi villdyr kan gjennomgå varmeinduserte anfall ved kroppstemperaturer >44 °C. Forbehandling med generell anestesi eller smertestillende midler kan redusere kjernetemperaturen til dyr eller forstyrre termoregulering, noe som igjen vil forvirre innsamling av anfallsterskeltemperaturdata. Dermed kunne mus under denne screeningprotokollen ikke leveres med disse agentene i løpet av 30 min prøvevindu. Alle prosedyrer må godkjennes av institusjonens IACUC-komité. For å sikre kontinuerlig overvåking av musens kjernetemperatur under analysen, tape rektal temperatursonden sikkert til musenes hale. Hvis det under analysen viser seg at musens kroppstemperatur forblir uendret i lengre perioder, selv etter å ha økt temperaturen på musekammeret, må du sørge for at rektal temperatursonden ikke har kommet ut av musen eller er festet løst til halen.
Genetisk bakgrunn av musemodeller kan påvirke følsomheten for SCN1A-mutasjonen og farmakologisk induserte anfall18,25,26,27. Som diskutert i resultatene ovenfor, kan musenes genetiske bakgrunn påvirke deres følsomhet for varmeinduserte anfall. Scn1a K1270T GEFS+ mutantmus ble testet i to genetiske bakgrunner - 129X1 og B6NJ, og en liten prosentandel av villtype mus (33%) i den anfallsfølsomme B6NJ-bakgrunnen, ble også observert for å gjennomgå varmeinduserte anfall. Men sammenlignet med de heterozygote mutant scn1aKT /+ musene, opplevde B6NJ villtype mus varmeinduserte anfall med en betydelig høyere temperaturterskel. Dette bekrefter at den genetiske mutasjonen (Scn1a K1270T) som ble introdusert av CRISPR knock-in, gjør mutantmusene mer utsatt for hypertermiinduserte anfall.
Det er flere fordeler med å vedta denne protokollen, som er oppsummert nedenfor. For det første, i motsetning til bruk av strøm av tørr luft eller oppvarmede lamper, gir en temperaturkontrollert tvungen luft satt opp i et lukket rom eksperimentet mer kontroll over oppvarming av testarenaen til ønsket hastighet. Trinnene i varmeprotokollen kan enkelt endres for å øke / redusere starttemperaturen, varigheten av hvert trinn, etc. for å screene eldre mus som er tyngre eller større gnagere som rotter. For det andre gir kontinuerlig overvåking av musens kroppstemperatur via den vedlagte rektalsonden verdifull informasjon om kroppstemperaturendringen i individuell mus, gjennom hele analysen. Dette gjør at eksperimentet kan nøye observere at temperaturendringen i musen ikke overstiger 0,25-0,5 °C/min (noe som kan være stressende for dyrene), når du tilpasser denne protokollen til andre testarenaer. Viktigst, frekvensen av endring av kroppstemperatur over tid i forskjellige musgrupper kan kaste lys over deres evne til å termoregulering og kan være nyttig for å forstå om feberbeslag som forårsaker mutasjoner også endrer termoregulering hos mus. For det tredje sikrer kontinuerlig kroppstemperaturovervåking at anfallsterskeltemperaturmålingene ved hjelp av denne protokollen er nøyaktige, siden de registreres samtidig med den første anfallskampen som musen opplever. Hvis dyrets kroppstemperatur ikke overvåkes kontinuerlig eller anfallsterskeltemperaturen måles etter å ha tatt dyret ut av testarenaen, kan anfallsterskelverdiene variere på grunn av tiden det tar å håndtere musene etter anfall. Til slutt omgår denne metoden behovet for å bruke invasive metoder for å indusere feber (ved å injisere patogener) hos mus for å etterligne feberanfall hos menneskelige pasienter.
En av begrensningene i denne protokollen er at det er vanskelig å screene juvenile (mindre enn P30 i alderen) mus for varmeinduserte anfall. Protokollen ble utviklet for å screene for følsomhet for voksne mus (P30-P40 og over) til varme- eller hypertermiinduserte anfall. Etter vår erfaring er de yngre villtype musene, spesielt de som veier under 15 g, mer sannsynlig å gjennomgå varmeinduserte anfall, noe som kan skyldes underutviklede termoreguleringsmekanismer, fysiologisk termisk stress eller en kombinasjon av begge deler. Derfor er det ikke ideelt å utføre den varmeinduserte anfallsskjermen på juvenile mus ved hjelp av denne protokollen.
Fremtidige studier som kombinerer EEG-overvåking mens musen utsettes for varmeinduserte anfall, kan belyse EEG-anfallsmønstre for varmeinduserte anfall, tilsvarende en tidligere studie19. Nevronaktivitet i bestemte områder i musehjernen kan spores ved å kombinere optogenetiske tilnærminger og immunhiistokjemibaserte studier etter høsting av hjernevevet. Effektene av restriktive dietter som keto-diett på å redusere feberanfall kan også evalueres ved å utsette keto-matede mus og normale chow-matede mus for varmeindusert anfallsprotokoll. På samme måte kan epilepsi narkotika screening paradigmer utvikles for å teste og identifisere kandidat anti-epileptiske legemidler som ameliorate eller undertrykke varmeinduserte anfall i narkotika-matet eller behandlet mus sammenlignet med kjøretøy-matet eller kontroll mus.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi vil takke Connor J. Smith for hans hjelp til å bygge det tilpassede musevarmekammeret. Vi erkjenner hjelp fra O'Dowd labmedlemmer, Lisha Zeng og Andrew Salgado for standardisering av varmeprotokollen i de tidlige stadiene av analyseutviklingen. Vi takker også Danny Benavides og Kumar Perinbam for videoopptak av deler av den eksperimentelle prosedyren for manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av NIH-stipendet (NS083009) tildelt D.O.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axial fan | Farnam | AF20-200-120-xx10-3.1 | Farnam custom products -Axial Fan Heater with Fan |
| Digital temperature controller | Inkbird | ITC-100RH | Inkbird digital PID temperature controller ITC-100RH with K thermocouple |
| Mouse rectal temperature probe | ThermoWorks, Braintree Scientific, Inc | RET-3 | Mouse rectal temperature probe with thermometer |
References
- Hirtz, D., et al. How common are the 'common' neurologic disorders. Neurology. 68, 326-337 (2007).
- Catterall, W. A. Sodium Channel Mutations and Epilepsy. Jasper's Basic Mechanisms of the Epilepsies. , Center for Biotechnology Information. US. Internet (2012).
- Mantegazza, M., Broccoli, V. SCN 1A /Na V 1.1 channelopathies: Mechanisms in expression systems, animal models, and human iPSC models. Epilepsia. 60, (2019).
- Stafstrom, C. E. Persistent Sodium Current and Its Role in Epilepsy. Epilepsy Currents. 7, 15-22 (2007).
- Schutte, S. S., Schutte, R. J., Barragan, E. V., O'Dowd, D. K. Model systems for studying cellular mechanisms of SCN1A-related epilepsy. Journal of Neurophysiology. 115, 1755-1766 (2016).
- Wei, F., et al. Ion Channel Genes and Epilepsy: Functional Alteration, Pathogenic Potential, and Mechanism of Epilepsy. Neuroscience Bulletin. 33, 455-477 (2017).
- Abou-Khalil, B., et al. Partial and generalized epilepsy with febrile seizures plus and a novel SCN1A mutation. Neurology. 57, 2265-2272 (2001).
- Zhang, Y. -H., et al. Genetic epilepsy with febrile seizures plus: Refining the spectrum. Neurology. 89, 1210-1219 (2017).
- Patterson, K. P., et al. Enduring memory impairments provoked by developmental febrile seizures are mediated by functional and structural effects of neuronal restrictive silencing factor. Journal of Neuroscience. 37, 3799-3812 (2017).
- Rossi, M. A. SCN1A and febrile seizures in mesial temporal epilepsy: An early signal to guide prognosis and treatment. Epilepsy Currents. 14, 189-190 (2014).
- Zhang, Y., et al. Altered gut microbiome composition in children with refractory epilepsy after ketogenic diet. Epilepsy Research. 145, 163-168 (2018).
- Meng, H., et al. The SCN1A mutation database: Updating information and analysis of the relationships among genotype, functional alteration, and phenotype. Human Mutation. 36, 573-580 (2015).
- Cheah, C. S., et al. Specific deletion of NaV1.1 sodium channels in inhibitory interneurons causes seizures and premature death in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 109, 14646-14651 (2012).
- Das, A., et al. Interneuron dysfunction in a new mouse model of SCN1A GEFS. eNeuro. , (2021).
- Kalume, F., et al. Sudden unexpected death in a mouse model of Dravet syndrome. Journal of Clinical Investigations. 123, 1798-1808 (2013).
- Martin, M. S., et al. Altered function of the SCN1A voltage-gated sodium channel leads to gamma-aminobutyric acid-ergic (GABAergic) interneuron abnormalities. Journal of Biological Chemistry. 285, 9823-9834 (2010).
- Rubinstein, M., et al. Dissecting the phenotypes of Dravet syndrome by gene deletion. Brain. 138, 2219-2233 (2015).
- Yu, F. H., et al. Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy. Nature Neuroscience. 9, 1142-1149 (2006).
- Dutton, S. B. B., et al. Early-life febrile seizures worsen adult phenotypes in Scn1a mutants. Experimental Neurology. 293, 159-171 (2017).
- Cheah, C. S., et al. Specific deletion of NaV1.1 sodium channels in inhibitory interneurons causes seizures and premature death in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 109, 14646-14651 (2012).
- Oakley, J. C., Cho, A. R., Cheah, C. S., Scheuer, T., Catterall, W. A. Synergistic GABA-enhancing therapy against seizures in a mouse model of Dravet Syndrome. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 345, 215-224 (2013).
- Ricobaraza, A., et al. Epilepsy and neuropsychiatric comorbidities in mice carrying a recurrent Dravet syndrome SCN1A missense mutation. Scientific Reports. 9, (2019).
- Warner, T. A., Liu, Z., Macdonald, R. L., Kang, J. -Q. Heat induced temperature dysregulation and seizures in Dravet Syndrome/GEFS+ Gabrg2+/Q390X mice. Epilepsy Research. 134, 1-8 (2017).
- Eun, B. -L., Abraham, J., Mlsna, L., Kim, M. J., Koh, S.
- Miller, A. R., Hawkins, N. A., McCollom, C. E., Kearney, J. A. Mapping genetic modifiers of survival in a mouse model of Dravet syndrome. Genes Brain and Behavior. 13, 163-172 (2013).
- Mistry, A. M., et al. Strain- and age-dependent hippocampal neuron sodium currents correlate with epilepsy severity in Dravet syndrome mice. Neurobiology of Disease. 65, 1-11 (2014).
- Ogiwara, I., et al. Nav1.1 localizes to axons of parvalbumin-positive inhibitory interneurons: a circuit basis for epileptic seizures in mice carrying an Scn1a gene mutation. Journal of Neuroscience. 27, 5903-5914 (2007).
