Summary
Målet med metoden är att screena för hypertermi eller värmeinducerade anfall i musmodeller. Protokollet beskriver användningen av en specialbyggd kammare med kontinuerlig övervakning av kroppstemperaturen för att avgöra om förhöjd kroppstemperatur leder till anfall.
Abstract
Transgena musmodeller har visat sig vara kraftfulla verktyg för att studera olika aspekter av mänskliga neurologiska störningar, inklusive epilepsi. SCN1A-associerade genetiska epilepsies består av ett brett spektrum av beslag störningar med ofullständig penetrance och klinisk variabilitet. SCN1A mutationer kan resultera i en stor variation av beslag fenotyp allt från enkel, självbegränsad feber-associerade febrile beslag (FS), måttlig nivå genetisk epilepsi med febrile beslag plus (GEFS +) till allvarligare Dravet syndrom (DS). Även om FS ofta ses hos barn under 6-7 år som inte har genetisk epilepsi, fortsätter FS i GEFS + patienter att uppstå i vuxen ålder. Traditionellt har experimentella FS inducerats hos möss genom att utsätta djuret för en ström av torr luft eller värmelampor, och förändringshastigheten i kroppstemperaturen är ofta inte väl kontrollerad. Här beskriver vi en specialbyggd värmekammare, med plexiglasfront, som är utrustad med en digital temperaturregulator och en värmeutrustad elektrisk fläkt, som kan skicka uppvärmd forcerad luft till testarenan på ett temperaturstyrt sätt. Kroppstemperaturen hos en mus som placeras i kammaren, övervakad genom en rektal sond, kan ökas till 40-42 °C på ett reproducerbart sätt genom att öka temperaturen inuti kammaren. Kontinuerlig visuell övervakning av djuren under uppvärmningsperioden visar induktion av värmeinducerade anfall hos möss som bär en FS-mutation vid en kroppstemperatur som inte framkallar beteendemässiga anfall hos vilda kullkamrater. Djur kan enkelt avlägsnas från kammaren och placeras på en kylplatta för att snabbt återställa kroppstemperaturen till det normala. Denna metod ger en enkel, snabb och reproducerbar screening protokoll för förekomsten av värme-inducerade beslag i epilepsi mus modeller.
Introduction
Epilepsi, den fjärde vanligaste familjen av neurologiska störningar i USA1, kännetecknas av en obalans av excitatorisk och hämmande enhet i CNS som leder till återkommande anfall. Feberkramper (FS) eller feberassocierade anfall kan förekomma i den allmänna befolkningen, oftast hos barn så tidigt som 3 månader upp till 6-7 år. Men hos vissa individer med genetiska mutationer, oftast i en natriumkanalgen, kan FS kvarstå efter 7 års ålder in i vuxen ålder. Detta tillstånd kallas feberkramper plus eller FS+. Snabba framsteg inom genomsekvensering har identifierat över 1 300 mutationer i den mänskliga natriumjonkanalgenen SCN1A, vilket gör den till en hotspot för epilepsimutationer. SCN1A mutationer har kopplats till ett brett spektrum av beslag störningar, inklusive febrile beslag (FS), genetisk epilepsi med febrile beslag plus (GEFS +) och Dravet syndrom (DS)2,3,4,5,6. Cirka 20% av SCN1A missense mutationer leder till GEFS +5,7,8. Pediatrisk historia av komplexa eller långvariga FS i barndomen kan därefter utvecklas till mer försvagande former av epilepsi såsom temporala lob epilepsi (TLE)9,10,11. Dravets syndrom uppstår på grund av trunkationsmutationer eller förlust av funktionsmutationer i SCN1A och är en allvarlig form av svårbehandlad epilepsi, med barndomens uppkomst av feberkramper som utvecklas till eldfasta anfall och är ofta förknippad med kognitiva, utvecklingsmässiga och motoriska funktionsnedsättningar2,5 12 . Eftersom många individer med GEFS + och/eller DS uppvisar febrile beslag, blir det absolut nödvändigt att utveckla nya terapier för att bättre bekämpa dessa beslag störningar.
Djurmodeller av SCN1A associerade epilepsi har visat sig ovärderliga för att karakterisera olika typer av anfall (febrile vs generalized) och dissekera den neuronala mekanismen för beslag generation13,14,15,16,17,18. Medan studien av spontana anfall via EEG/EMG-inspelningar i gnagarehjärnor är väletablerad och är ett mycket användbart verktyg, har endast ett fåtal studier försökt efterlikna feberkramper i musmodeller14,16,19,20,21,22,23 . Tidigare studier har använt en stråle av uppvärmd torr luft, eller en metakrylatcylinder utrustad med ett termiskt system, eller värmelampor med temperaturregulator i slutna testarenor9,16,21,22,23,24 för att inducera anfall via hypertermi. För att öka kroppstemperaturen i en mer kontrollerad miljö använder protokollet som beskrivs här en specialbyggd kammare med ett temperaturstyrt värmesystem som tillät reproducerbara ökningshastigheter i kroppstemperaturen hos en mus inuti kammaren. Värmekammaren är tillverkad av trä (längd 40 cm x bredd 34 cm x höjd 31 cm) och var utrustad med en digital temperaturregulator med en K termoelement. En liten axiell fläkt utrustad med en värmare på kammarens bakpanel leder uppvärmd luft in i kammaren som regleras av en digital temperaturregulator. Detta påtvingade luftuppvärmningssystem gör det möjligt att styra hastigheten med vilken kammartemperaturen ökar. (Figur 1A,B). K-termoelementet inuti trävärmekammaren skickar återkoppling till den digitala temperaturregulatorn för att bibehålla konstanta temperaturer inuti lådan under analysen. Genom att ställa in temperaturen på den digitala temperaturregulatorn kan den elektriska fläkten skicka uppvärmd forcerad luft genom ventiler för att värma kammaren jämnt (figur 1A). Värmekammarens frontpanel är ett tydligt plexiglasark för att möjliggöra enkel videoinspelning av försöken.
Vuxna (P30-P40) möss, heterozygous för en missense mutation i SCN1A som orsakar GEFS + och ett lika antal vilda-typ kull mates att fungera som kontrollgrupp, valdes för varje experiment. Djur, både hanar och kvinnor, som användes i dessa studier vägde minst 15 g eftersom möss av vildtyp som vägde mindre var mer känsliga för värmeinducerade anfall än tyngre djur i samma ålder. I pilotstudien observerades både muterade möss av vildtyp och möss av vild typ för att söka efter de svalare hörnen av kammaren på baksidan och stannade där under längre tidsperioder. För att kringgå detta reducerades den effektiva golvstorleken inuti värmekammarens testarena till längd 16,5 cm x bredd 21,5 cm x höjd 27,5 cm genom att placera ett träblock B (måtten 20 cm x 8 cm x 7,2 cm) på kammarens högra sida (figur 1A). Värmekammaren är tillverkad av 1,9 cm tjock plywood (längd 40 cm x bredd 34 cm x höjd 31 cm) täckt med vitt laminat och utrustad med en digital temperaturregulator med en K-termoelement. Kammarväggarnas laminatyta är ogenomtränglig och kan lätt saneras mellan försök genom att torka av med 70% etanol. Temperaturen i värmekammaren sattes ursprungligen till 50 °C och förvärmdes i minst 1 h före försökets början, för att säkerställa enhetlig uppvärmning inuti kammaren. Varje mus var utrustad med en rektaltermometer för kontinuerlig övervakning av kroppstemperaturen under hela experimentet. En enda mus placerades i kammaren åt gången och temperaturen hölls vid 50 °C mellan 1:a och 10:e minuten. Temperaturen höjdes sedan till 55 °C för 11-20:e minuten och höjdes slutligen till 60 °C i 21-30:e minuten. Detta resulterade i en reproducerbar ökningshastighet i musens kroppstemperatur (figur 2A). Varje studie var videotejpad och beteendeanalys utfördes offline.
Värmeprotokollet kan enkelt ändras för att ändra värmekammarens ursprungliga temperatur och den hastighet som kammaren värms upp, vilket i sin tur ändrar hur snabbt musens kroppstemperatur höjs under analysen. Således ger denna metod mer flexibilitet över traditionella metoder för att ställa in beteendemässiga skärmar som involverar värmeinducerade anfall. Det värmeinducerade anfallsprotokollet kan också användas för att screena för antiepileptika som gör muterade möss mer resistenta mot värmeinducerade anfall eller ökar den tröskeltemperatur vid vilken anfall observeras. På samma sätt kan positiva effekter av restriktiva dietregimer som ketodiet på värmeinducerade anfall undersökas i normala chow-matade vs ketomatade möss.
Bild 1: Beskrivning av den specialbyggda musvärmekammaren. (A) Frontpanelen i trämusvärmekammaren visar sidokontrollpanelen som innehåller Power ON/OFF-strömbrytare som slår på digital temperaturregulator, K termoelement, värmefläktens ON/OFF-strömbrytare och värmeindikator. Lådans yttre dimensioner och den inre testarenan visas i cm. Ett träblock B som används för att effektivt minska testarenans yta visas också. Botten av testarenan är täckt med cob sängkläder för att förhindra möss från direkt komma i kontakt med uppvärmda träytor. (B) Värmekammarens baksida visar fläkten monterad på den övre luftventilen och nätsladden för att leverera el till kammaren. Denna siffra ändras från figur 3 i Das et al., 2021, eNeuro14. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med riktlinjerna från Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of California, Irvine.
1. Förberedelse för värmeinducerad beslagsanalys
- Slå på strömbrytaren i värmekammaren, följt av knappen Värme på .
- Ställ in värmekammarens temperatur på 50 °C med hjälp av knappsatsen på den digitala temperaturregulatorn.
- Vänta tills minst 1 h förvärm kammaren vid 50 °C innan du för in den första musen i kammaren. Förvärmning säkerställer jämn uppvärmning inuti kammaren.
- Fodra golvet i musvärmekammaren med cob sängkläder.
- Montera en videoinspelningskamera framför värmekammaren för inspelning av varje värmeinducerad anfallsanalysstudie.
- Fodra en Petri-skål med 140 mm diameter med tjocka lager av mjukpapper och placera den på is för att fungera som en kylplatta.
OBS: I slutet av analysen kommer individuell mus att överföras på den försbackade kylplattan för att hjälpa till att sänka deras förhöjda kroppstemperatur.
2. Förbereda musen för värmeinducerad anfallsanalys
- Välj 10 vuxna möss (P30-P40), 5 som bär epilepsi som orsakar mutation och 5 av vilda kullkamrater för värmeinducerad anfallsscreeningsanalys.
OBS: Möss av vild typ, som inte hyser någon epilepsi som orsakar mutation uppvisar inte värmeinducerade anfall vid temperaturer under 44 °C och fungerar som kontrollgrupp. - Väg varje mus som ska användas för screeninganalysen och registrera dess kroppsvikt. Endast möss som väger 15 g eller mer ska användas för analysen.
- Skärma en mus i taget i musens värmekammare.
- Bedöva musen i 10-15 s med några droppar isofluran i botten av en klockburk.
- Ta djuret ur klockburken och placera den på en pappershandduk.
- Se till att musen är helt sövd genom att kontrollera att musen inte svarar på en skadlig bitp.
- Täck metallspetsen på rektaltemperatursonden med ett smörjmedel (t.ex. petroleumgel) och sätt försiktigt in den i musen på ett djup av mindre än eller lika med 2 cm.
- Fäst rektalsonden på musens svans med tejp, så att sonden inte kommer ut under analysen.
OBS: Alternativt, placera djuret i en mushållhållskon och sätt in rektal temperatursonden. Säkra den genom att tejpa fast den i svansen. - Se till att rektalsonden är ansluten till en multimeter som visar musens inre kroppstemperatur.
- Placera djuret i en färsk bur fodrad med cob sängkläder, dvs. återhämtningsburen.
- Starta en timer och vänta i 5 min. Observera musen tills den helt har återhämtat sig från anestesi och musen är aktiv och grooming.
- Övervaka samtidigt musens kroppstemperatur tills den stabiliseras vid 35-36 °C.
- Observera musens kroppstemperatur i slutet av 5 minuter. Detta är den ursprungliga kroppstemperaturen vid tiden "0" min.
OBS: Om musens kärnkroppstemperatur är under 35 °C, vänta på ytterligare tid för djuret att återhämta sig från anestesiinducerad hypotermi. - Överför snabbt den enskilda musen till den förvärmda muskammaren. Detta markerar början på experimentförsöket. Endast en mus visas vid en viss tidpunkt.
3. Värmeinducerad anfallsanalys
- Efter att försiktigt ha placerat musen på golvet i den förvärmda musvärmekammaren stänger du plexiglasdörren och startar kameran för videoinspelning av experimentet.
- Starta stoppuret. Registrera musens kroppstemperatur från rektaltermometern med 1 min intervall under experimentets varaktighet.
- Öka med jämna mellanrum temperaturen i musvärmekammaren så att musens kroppstemperatur ökar med en hastighet av 0,25-0,5 °C /min.
OBS: Snabba ökningar av kroppstemperaturen kan leda till värmeslag eller död och bör undvikas. - Öka temperaturen på musvärmekammaren med 5 °C var 10:e minut enligt figur 2A.
- Vid 9,5 min, ställ in temperaturen i värmekammaren på 55 °C för att stabilisera temperaturen i värmekammaren till 55 °C vid den 10:e min enligt den digitala temperaturdisplayen.
- På samma sätt, öka temperaturen till 60 °C vid 19,5 min för att stabilisera temperaturen i värmekammaren till 60 °C vid den 20:e min. Varje provundersökning av anfall varar i 30 minuter.
- Om musen har ett anfall (vocalizes, visar huvudet nickar, avskydd clonus, hindlimb förlängning, faller på sin sida, eller upplever generaliserade tonic / kloniska konvulsioner), spela in följande information.
- Registrera musens kroppstemperatur under krampanfallet (kramptröskeltemperaturen) från termometern för rektal temperatur.
- Registrera anfallsbeteendeegenskaper som huvud nickning, framben clonus, bakben förlängning, faller på sidan och/eller generaliserade tonic/kloniska anfall (GTCS) visas av musen.
- Snabbt men försiktigt plocka upp musen från kammaren och placera den på kylplattan förberedd i steg 1.6.
OBS: Om en mus upplever Racine-skalning 5-anfall och uppvisar okontrollerad hoppning kan det vara svårt att plocka upp djuret från värmekammaren och överföras till kylplattan utanför. Ett typiskt värmeinducerat anfall varar dock mellan 30 s och 60 s.Således bör musen tas ut ur värmekammaren och sättas på kylplattan inom 60 s från början av värmeinducerad anfallsepisod. - Vänta tills musens kroppstemperatur kommer ner till 36-37 °C innan du överför den till en återhämtningsbur. Endast en mus placeras i en återhämtningsbur åt gången.
OBS: Blanda inte möss som ännu inte har använts för värmeinducerad screening med musen som redan har upplevt den värmeinducerade anfallsexperimentstudien. - Skär försiktigt och försiktigt tejpen mellan mussvansen och rektalsondtråden med en sax för att ta bort rektalsonden från musen.
- Torka av metallspetsen på rektalsonden med 70% alkohol- och mjukvävnadsservetter för att hålla den redo för nästa försök.
- Fortsätt att observera musen i återhämtningsburen tills den återupptar normal aktivitet (promenader, grooming, etc.), innan du återvänder musen till sin hembur. Detta markerar slutet på experimentförsöket för den här musen.
- Registrera djurstatusen efter att analysen har levt och återfunnits från testsessionen eller dött. Högintensiva anfall som involverar okontrollerad hoppning och generaliserade toniska/kloniska anfall kan ibland leda till att musen dör.
- Om en mus inte upplever värmeinducerade anfall inom 30 minuters observationsperiod eller musens kroppstemperatur når 44 °C, ta bort musen från värmekammaren och placera på kylplattan tills musens kroppstemperatur återgår till 36-37 °C.
- Återställ temperaturen på musvärmekammaren till 50 °C och låt den balansera tills displaytemperaturen på den digitala temperaturregulatorn visar 50 °C.
- Byt cob sängkläder mellan enskilda musförsök.
- Förbered nästa mus för screeningförsök enligt beskrivningen i avsnitt 2 och upprepa stegen från avsnitt 3.
4. Avliva djuren
- Även om de flesta djur återhämtar sig efter värmeinducerade anfall, genomgår enligt vår erfarenhet några av mössen SUDEP (Sudden Unexplained Death in EPilepsy) i sin hembur inom 24-48 timmar av värmeinducerade anfall. Efter att ha avslutat screeningen på alla möss individuellt för värmeinducerade anfall efter 30 minuters studie, avliva alla möss enligt institutionens IACUC-riktlinjer.
5. Analysera värmeinducerade anfallsdata
- Efter avslutad screening av en kohort av djur, beräkna procentandelen möss i en given genotyp som visar anfall med hjälp av följande formel:
- Uppskatta den genomsnittliga anfallströskeltemperaturen för möss inom en given genotyp genom att beräkna i genomsnitt anfallströskeltemperaturen för alla möss (noterat i steg 3.7) i den genotyp som uppvisar värmeinducerade anfall.
- Medan du fortfarande är blind för identiteten och genotypen, spela upp videoinspelningarna av var och en av musen under värmeinducerade beslag analys screening på en datorskärm för att få svårighetsgraden av beslag anfall.
- Ge poäng till enskilda mus uppvisar värmeinducerade beslag beteende genom att använda den modifierade Racine skala13 som beskrivs av tidigare studier13,14. Se tabell 1 för mer information.
- Om en mus, medan den upplever värmeinducerade anfall, bara visar huvud nickning, ge den en poäng på 2. Om en mus startar en anfallsepisod med huvud nickande men också uppvisar förben clonus, faller omkull och / eller hoppar ge det en poäng på 5.
- Registrera den maximala poängen för varje mus med hjälp av den modifierade Racine-skalan13 enligt beskrivningen ovan.
- Rita upp ett spridningsdiagram med maximala Racine-poäng som uppvisas av alla möss i en given genotyp.
- Statistiskt jämföra maximala Racine poäng mellan olika musgrupper som en metod för att bestämma svårighetsgraden av beteendemässiga anfall såsom värmeinducerade anfall.
OBS: Racine poäng är till hjälp för att jämföra beslag egenskaper mellan olika mutanta möss grupper eller genotyper. Det förväntas att möss av vildtyp inte skulle genomgå värmeinducerade anfall och inte behöva beaktas för jämförelser av Racine-poäng. - Baserat på experimentell design, utför lämplig statistisk analys för att avgöra om andelen möss som uppvisar anfall mellan vilda och muterade möss, och deras genomsnittliga anfallströskeltemperaturvärden skiljer sig avsevärt från varandra.
| Racine poäng | Anfallsegenskaper | ||
| 0 | Inga anfall | ||
| 1 | Mun- och ansiktsrörelser | ||
| 2 | Nickande huvud | ||
| 3 | Förbensklonus, vanligtvis en lem | ||
| 4 | Förbensklonus med uppfödning | ||
| 5 | Generaliserat toniskt kloniskt anfall, uppfödning, hoppning, fall över | ||
Tabell 1: Racine poäng.
Representative Results
Djurmodeller med feberkrampermutationer förväntas genomgå värmeinducerade anfall vid förhöjda kroppstemperaturer som inte inducerar anfall i de vilda kullkamraterna. SCN1A mutationer har kopplats till febrile beslag, inklusive K1270T GEFS + patienter, som visar både febrile och afebrile generaliserade beslag7. Vi screenade CRISPR genererade SCN1A K1270T GEFS + mutant möss nyligen beskrivs i en studie14 för förekomsten av värme beslag i två genetiska bakgrunder - beslag resistenta 129X1/SvJ (129X1) och beslag mottagliga C57BL/NJ (B6N) bakgrunder. Ålder matchade vilda kull mates i musen värmekammare som inte hyser några GEFS + mutationer och därmed, förväntas inte uppvisa värme-inducerade beslag, tjänade som kontrollgrupp. Hastigheten på kroppstemperaturförändringen över tid utvärderades genom att plotta medeltemperaturen hos möss som registreras varje minut under analysen. Det fanns ingen skillnad i förändringshastigheten för kroppstemperaturen mellan heterozygous mutanta möss och vilda kull mates testas i respektive 129X1 och B6N genetisk bakgrund (figur 2B, C). Detta tyder på att termoregulering inte ändras i K1270T GEFS + heterozygous mutant möss.
Alla heterozygous mutant möss från 129X1 (n = 15) eller B6N (n = 9) genetisk bakgrund uppvisade värmeinducerade anfall (figur 2D). Ingen av möss av vildtyp i den 129X1 berikade bakgrunden (n = 13) uppvisade värmeinducerade anfall (figur 2D). Däremot uppvisade en tredjedel av de testade mössen (n = 3 av de 9 mössen) i den anfallskänsliga B6N-bakgrunden värmeinducerade anfall. Statistisk jämförelse visar att andelen heterozygous mutanta möss som uppvisar värmeinducerade anfall var betydligt högre än deras respektive vilda motsvarighetmöss i både 129X1 och B6N genetiska bakgrunder (figur 2D, Fishers exakta test, 129X1 p < 0,0001; B6NJ p = 0,009). Den genomsnittliga beslag tröskelvärdet mellan heterozygous mutant möss i 129X1 och B6N genetisk bakgrund var liknande. 129X1 muterade möss har en genomsnittlig anfallströskeltemperatur på 42,6 ± 0,20 °C, vilket inte skilde sig nämnvärt från den genomsnittliga anfallströskeltemperaturen på 42,7 ± 0,06 °C sett hos B6N-möss (figur 2E; tvåsidigt opared Students t-test, p = 0,782). Det är viktigt att notera att den genomsnittliga anfallströskeltemperaturen för tre B6N vildtypsmöss som uppvisade värmeinducerade anfall var 43,7 ± 0,08 °C och betydligt högre än den genomsnittliga anfallströskeln på 42,7 ± 0,06 °C som visas av B6N heterozygous mutantmöss (figur 2E, tvåstjärtad opared Students t-test, s <. 001).
Plexiglasets framsida i kammaren gör det möjligt att göra kontinuerliga videoinspelningar under analysen som kan användas senare för att få för anfalls svårighetsgrad i varje mus på en modifierad Racine-skala som beskrivits tidigare14,20. Under en typisk analys skulle heterozygous mutant möss visa värmeinducerade anfall med vocalization och/eller head-nickande (Racine poäng 2), och snabbt övergå till framben clonus, faller på sidan, hoppar, hindlimb förlängning och/eller generaliserade tonic/kloniska beslag (Racine poäng 3-5) när kroppstemperaturen nådde ca 42 °C. Den maximala Racine poängen representerar det allvarligaste värmeinducerade anfallsbeteendet bland mutantmössen. Den maximala Racine poängen för heterozygous mutant möss i 129X1 berikad bakgrund (n = 15) skiljer sig inte från heterozygous mutant möss i B6N (n = 9) genetisk bakgrund (figur 2F; Mann-Whitney testar, p > 0.9999). Detta tyder på att värmeinducerade beslag beteende egenskaper i K1270T GEFS + mutant möss är oberoende av stam bakgrund.
Sammantaget visar data att alla muterade möss uppvisar värmeinducerade anfall med liknande frekvens, anfallströskeltemperatur och beteendemässiga anfall svårighetsgrad på ett stamoberoende sätt. Majoriteten av kullkamrater av vild typ uppvisar inte sådana anfall vid eller under 44 °C. Ungefär en tredjedel av de vilda kontrollmössen i en anfallskänslig B6N-bakgrund visade värmeinducerade anfall (möjligen på grund av genetiska bakgrundseffekter) men anfallströskelns temperatur var betydligt högre jämfört med muterade möss i samma bakgrund. Dessa resultat tyder på att mutanta möss i B6N genetisk bakgrund är mottagliga för värme-inducerade beslag vid lägre temperatur trösklar på grund av att SCN1A GEFS + mutation de hyser. Således kan man med hjälp av detta protokoll utvärdera värmeinducerade anfall hos epilepsimutant möss och skilja från vilda kullkamratmöss, som antingen inte genomgår värmeinducerade anfall eller visar värmeanfall vid betydligt högre temperaturer.
Figur 2: Muterade möss uppvisar värmeinducerade anfall. (A) Värmeprotokollet för beteendekontroll av värmeinducerade anfall hos möss. (B-C) Genomsnittlig kroppstemperatur hos möss över tid i vilda (Scn1a+/+ - svarta trianglar) och heterozygous mutant (Scn1aKT/+ - orange cirklar) möss i två genetiska bakgrunder 129X1 respektive B6N. D) Andel möss som uppvisar värmeinducerade anfall i båda genetiska bakgrunderna. Möss av vildtyp (Scn1a+/+) och heterozygous (Scn1aKT/+) representeras av svarta respektive orangea staplar. Heterozygous mutanter i 129X1 och B6N bakgrunder visas i orange fasta barer och orange barer med svarta ränder, respektive. E) Tröskelvärde för krampanfall till värmeinducerade anfall hos möss av vild typ (Scn1a+/+) och heterozygous mutanta möss (Scn1aKT/+) i båda stammarna. (F) Spridningsfördelning av maximala Racine-poäng av värmeinducerade anfall som uppvisas av heterozygous (Scn1aKT/+) möss i båda genetiska bakgrunderna. Varje punkt representerar maximal Racine-poäng i en enda mus. Antal djur i varje genotyp visas inom parenteser. Data som visas i panel B-F är medelvärde ± S.E.M. Denna siffra ändras från figur 3 i Das et al., 2021, eNeuro14. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Discussion
Vi beskriver ett enkelt och effektivt protokoll för att screena för förekomst av värme-inducerade beslag hos möss, beteendemässiga motsvarigheten till febrile beslag hos mänskliga patienter. Analysen utvärderar flera parametrar - inklusive andelen möss som visar anfall, anfallströskel, svårighetsgraden av anfall på en Racine-skala, för att jämföra känsligheten hos kontroll- och testmössgrupper med ökningar av kroppstemperaturen.
Ett kritiskt steg i detta protokoll innebär att öka värmen i kammaren samtidigt som man kontinuerligt övervakar musens kroppstemperatur. Det är absolut nödvändigt att den maximala kroppstemperaturen som mössen kommer att uppleva i dessa analyser är 44 °C eftersom vilda djur kan genomgå värmeinducerade anfall vid kroppstemperaturer >44 °C. Förbehandling med generell anestesi eller smärtstillande medel kan minska djurens kroppstemperatur eller störa termoreguleringen, vilket i sin tur skulle förvirra insamlingen av temperaturdata för anfallströskeln. Möss enligt detta screeningprotokoll kunde således inte förses med dessa medel under 30 minuters försöksfönster. Alla förfaranden måste godkännas av institutionens IACUC-kommitté. För att säkerställa kontinuerlig övervakning av musens kärntemperatur under analysen, tejpa säkert rektaltemperatursonden på mössens svans. Om musens kroppstemperatur under analysen visar sig vara oförändrad under längre tidsperioder även efter att muskammarens temperatur har ökat, se till att rektaltemperatursonden inte har kommit ut ur musen eller är fastsatt löst på svansen.
Genetisk bakgrund av musmodeller kan påverka känsligheten för SCN1A mutationen och farmakologiskt inducerad beslag18,25,26,27. Som diskuteras i resultaten ovan kan mössens genetiska bakgrund påverka deras mottaglighet för värmeinducerade anfall. Scn1a K1270T GEFS+ mutant möss testades i två genetiska bakgrunder - 129X1 och B6NJ, och en liten andel vilda möss (33%) i beslag känsliga B6NJ bakgrund, observerades också att genomgå värme-inducerade beslag. I jämförelse med heterozygous mutant Scn1aKT/+ möss upplevde dock B6NJ vilda möss värmeinducerade anfall vid en betydligt högre temperaturtröskel. Detta bekräftar att den genetiska mutationen (Scn1a K1270T) som introducerades av CRISPR knock-in gör mutanta möss mer mottagliga för hypertermi-inducerade anfall.
Det finns flera fördelar med att anta detta protokoll, som sammanfattas nedan. För det första, till skillnad från användningen av ström av torr luft eller uppvärmda lampor, ger en temperaturstyrd forcerad luft som ställts upp inom ett slutet utrymme experimenteraren mer kontroll över uppvärmningen av testarenan i önskad takt. Stegen i värmeprotokollet kan enkelt modifieras för att öka/ minska starttemperaturen, varaktigheten för varje steg etc. för att screena äldre möss som är tyngre eller större gnagare som råttor. För det andra ger kontinuerlig övervakning av musens kroppstemperatur via den bifogade rektalsonden värdefull information om hastigheten på kroppstemperaturförändringen hos enskilda möss, under hela analysen. Detta gör det möjligt för experimenteraren att noga observera att temperaturförändringen i musen inte överstiger 0,25-0,5 °C/min (vilket kan vara stressande för djuren) när detta protokoll anpassas till andra testarenor. Viktigt är att förändringstakten av kroppstemperaturen över tiden i olika mössgrupper kan kasta ljus över deras förmåga att termoregulera och kan vara till hjälp för att förstå om febrile beslag som orsakar mutationer också förändra termoreguleringen hos möss. För det tredje säkerställer kontinuerlig övervakning av kroppstemperaturen att mätningarna av anfallströskeln med detta protokoll är korrekta, eftersom de registreras samtidigt med den första anfallsattacken som musen upplever. Om djurets kroppstemperatur inte övervakas kontinuerligt eller tröskeltemperaturen för anfall mäts efter att djuret har tagits ut ur testarenan, kan tröskelvärdena för anfall variera beroende på den tid det tar att hantera mössen efter anfallen. Slutligen kringgår denna metod behovet av att använda invasiva metoder för att inducera feber (genom att injicera patogener) hos möss för att efterlikna feberkramper hos mänskliga patienter.
En av begränsningarna i detta protokoll är att det är svårt att screena juvenila (mindre än P30 i ålder) möss för värmeinducerade anfall. Protokollet utvecklades för att screena för känslighet hos vuxna möss (P30-P40 och högre) till värme- eller hypertermi-inducerade anfall. Enligt vår erfarenhet är de yngre mössen av vildtyp, särskilt de som väger under 15 g, mer benägna att genomgå värmeinducerade anfall, vilket kan bero på underutvecklade termoreguleringsmekanismer, fysiologisk termisk stress eller en kombination av båda. Därför är det inte idealiskt att utföra den värmeinducerade anfallsskärmen på juvenila möss med hjälp av detta protokoll.
Framtida studier som kombinerar EEG-övervakning samtidigt som musen utsätts för värmeinducerade anfall kan kasta ljus över EEG-anfallsmönster av värmeinducerade anfall, liknande en tidigare studie19. Neuronal aktivitet i specifika områden i mushjärnan kan spåras genom att kombinera optogenetiska metoder och immunohistokemibaserade studier efter skörd av hjärnvävnaden. Effekterna av restriktiva dieter som ketodiet på att minska feberkramper kan också utvärderas genom att utsätta ketomatade möss och normala chow-matade möss för värmeinducerat anfallsprotokoll. På samma sätt kan epilepsiläkemedelsscreeningsparadigm utvecklas för att testa och identifiera läkemedelskandidater som lindrar eller undertrycker värmeinducerade anfall hos läkemedelsmatade eller behandlade möss jämfört med fordonsmatade eller kontrollmöss.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi vill tacka Connor J. Smith för hans hjälp med att bygga den anpassade musvärmekammaren. Vi bekräftar hjälpen från O'Dowd lab-medlemmar, Lisha Zeng och Andrew Salgado för att standardisera värmeprotokollet under de tidiga stadierna av analysutvecklingen. Vi tackar också Danny Benavides och Kumar Perinbam för videoinspelningsdelar av det experimentella förfarandet för manuskriptet. Detta arbete stöddes av NIH-bidraget (NS083009) som tilldelades D.O.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axial fan | Farnam | AF20-200-120-xx10-3.1 | Farnam custom products -Axial Fan Heater with Fan |
| Digital temperature controller | Inkbird | ITC-100RH | Inkbird digital PID temperature controller ITC-100RH with K thermocouple |
| Mouse rectal temperature probe | ThermoWorks, Braintree Scientific, Inc | RET-3 | Mouse rectal temperature probe with thermometer |
References
- Hirtz, D., et al. How common are the 'common' neurologic disorders. Neurology. 68, 326-337 (2007).
- Catterall, W. A. Sodium Channel Mutations and Epilepsy. Jasper's Basic Mechanisms of the Epilepsies. , Center for Biotechnology Information. US. Internet (2012).
- Mantegazza, M., Broccoli, V. SCN 1A /Na V 1.1 channelopathies: Mechanisms in expression systems, animal models, and human iPSC models. Epilepsia. 60, (2019).
- Stafstrom, C. E. Persistent Sodium Current and Its Role in Epilepsy. Epilepsy Currents. 7, 15-22 (2007).
- Schutte, S. S., Schutte, R. J., Barragan, E. V., O'Dowd, D. K. Model systems for studying cellular mechanisms of SCN1A-related epilepsy. Journal of Neurophysiology. 115, 1755-1766 (2016).
- Wei, F., et al. Ion Channel Genes and Epilepsy: Functional Alteration, Pathogenic Potential, and Mechanism of Epilepsy. Neuroscience Bulletin. 33, 455-477 (2017).
- Abou-Khalil, B., et al. Partial and generalized epilepsy with febrile seizures plus and a novel SCN1A mutation. Neurology. 57, 2265-2272 (2001).
- Zhang, Y. -H., et al. Genetic epilepsy with febrile seizures plus: Refining the spectrum. Neurology. 89, 1210-1219 (2017).
- Patterson, K. P., et al. Enduring memory impairments provoked by developmental febrile seizures are mediated by functional and structural effects of neuronal restrictive silencing factor. Journal of Neuroscience. 37, 3799-3812 (2017).
- Rossi, M. A. SCN1A and febrile seizures in mesial temporal epilepsy: An early signal to guide prognosis and treatment. Epilepsy Currents. 14, 189-190 (2014).
- Zhang, Y., et al. Altered gut microbiome composition in children with refractory epilepsy after ketogenic diet. Epilepsy Research. 145, 163-168 (2018).
- Meng, H., et al. The SCN1A mutation database: Updating information and analysis of the relationships among genotype, functional alteration, and phenotype. Human Mutation. 36, 573-580 (2015).
- Cheah, C. S., et al. Specific deletion of NaV1.1 sodium channels in inhibitory interneurons causes seizures and premature death in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 109, 14646-14651 (2012).
- Das, A., et al. Interneuron dysfunction in a new mouse model of SCN1A GEFS. eNeuro. , (2021).
- Kalume, F., et al. Sudden unexpected death in a mouse model of Dravet syndrome. Journal of Clinical Investigations. 123, 1798-1808 (2013).
- Martin, M. S., et al. Altered function of the SCN1A voltage-gated sodium channel leads to gamma-aminobutyric acid-ergic (GABAergic) interneuron abnormalities. Journal of Biological Chemistry. 285, 9823-9834 (2010).
- Rubinstein, M., et al. Dissecting the phenotypes of Dravet syndrome by gene deletion. Brain. 138, 2219-2233 (2015).
- Yu, F. H., et al. Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy. Nature Neuroscience. 9, 1142-1149 (2006).
- Dutton, S. B. B., et al. Early-life febrile seizures worsen adult phenotypes in Scn1a mutants. Experimental Neurology. 293, 159-171 (2017).
- Cheah, C. S., et al. Specific deletion of NaV1.1 sodium channels in inhibitory interneurons causes seizures and premature death in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 109, 14646-14651 (2012).
- Oakley, J. C., Cho, A. R., Cheah, C. S., Scheuer, T., Catterall, W. A. Synergistic GABA-enhancing therapy against seizures in a mouse model of Dravet Syndrome. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 345, 215-224 (2013).
- Ricobaraza, A., et al. Epilepsy and neuropsychiatric comorbidities in mice carrying a recurrent Dravet syndrome SCN1A missense mutation. Scientific Reports. 9, (2019).
- Warner, T. A., Liu, Z., Macdonald, R. L., Kang, J. -Q. Heat induced temperature dysregulation and seizures in Dravet Syndrome/GEFS+ Gabrg2+/Q390X mice. Epilepsy Research. 134, 1-8 (2017).
- Eun, B. -L., Abraham, J., Mlsna, L., Kim, M. J., Koh, S.
- Miller, A. R., Hawkins, N. A., McCollom, C. E., Kearney, J. A. Mapping genetic modifiers of survival in a mouse model of Dravet syndrome. Genes Brain and Behavior. 13, 163-172 (2013).
- Mistry, A. M., et al. Strain- and age-dependent hippocampal neuron sodium currents correlate with epilepsy severity in Dravet syndrome mice. Neurobiology of Disease. 65, 1-11 (2014).
- Ogiwara, I., et al. Nav1.1 localizes to axons of parvalbumin-positive inhibitory interneurons: a circuit basis for epileptic seizures in mice carrying an Scn1a gene mutation. Journal of Neuroscience. 27, 5903-5914 (2007).
