É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

De células à síntese de proteínas livres de células dentro de 24 horas usando fluxo de trabalho de autoindução sem células

4.9K vistas

⸱

DOI:

10.3791/62866

⸱

22 de julho de 2021

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University San Luis Obispo, 2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University San Luis Obispo

Neste artigo

Aviso de errata

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Resumo

Este trabalho descreve a preparação do extrato celular de Escherichia coli (E. coli) seguido de reações de síntese proteica livre de células (CFPS) em menos de 24 horas. Explicação do protocolo de autoindução automática livre de células (CFAI) detalha melhorias feitas para reduzir a supervisão dos pesquisadores e aumentar as quantidades de extrato celular obtidos.

Resumo

A síntese de proteínas sem células (CFPS) cresceu como uma plataforma de biotecnologia que captura a transcrição e a máquina de tradução in vitro. Inúmeros desenvolvimentos tornaram a plataforma CFPS mais acessível aos novos usuários e expandiram a gama de aplicativos. Para sistemas cfps baseados em lysate, extratos celulares podem ser gerados a partir de uma variedade de organismos, aproveitando a bioquímica única desse hospedeiro para aumentar a síntese proteica. Nos últimos 20 anos, escherichia coli (E. coli) tornou-se um dos organismos mais utilizados para apoiar cfps devido à sua acessibilidade e versatilidade. Apesar de inúmeros avanços importantes, o fluxo de trabalho para a preparação do extrato de células E. coli tem permanecido um gargalo fundamental para que novos usuários implementem CFPS para suas aplicações. O fluxo de trabalho de preparação do extrato é demorado e requer conhecimento técnico para alcançar resultados reprodutíveis. Para superar essas barreiras, relatamos anteriormente o desenvolvimento de um fluxo de trabalho de autoindução livre de células 24 horas (CFAI) que reduz a entrada do usuário e a experiência técnica necessária. O fluxo de trabalho do CFAI minimiza a habilidade laboral e técnica necessária para gerar extratos celulares, ao mesmo tempo em que aumenta as quantidades totais de extratos celulares obtidos. Aqui descrevemos esse fluxo de trabalho de forma passo a passo para melhorar o acesso e apoiar a ampla implementação do CFPS baseado em E. coli .

Introdução

O uso de síntese de proteínas livres de células (CFPS) para aplicações de biotecnologia cresceu substancialmente nos últimos anos 1,2,3. Esse desenvolvimento pode ser atribuído, em parte, ao aumento dos esforços na compreensão dos processos que ocorrem no CFPS e ao papel de cada componente 4,5. Além disso, os custos reduzidos atribuídos a configurações otimizadas e fontes alternativas de energia tornaram a tecnologia livre de células mais fácil de implementar para novos usuários 6,7,8,9. Para implementar os fatores necessários de transcrição e tradução para a síntese proteica, o extrato celular é frequentemente usado para conduzir reações livres de células10. Os guias de usuários publicados recentemente forneceram protocolos simples para a produção de extrato funcional, facilitando a implementação de usuários novos e experientes, tanto 1,11,12,13,14. O extrato celular é geralmente obtido através da lise de uma cultura celular, que pode ser cultivada usando diferentes organismos dependendo do uso específico desejado 1,15,16.

Escherichia coli (E. coli) tornou-se rapidamente um dos organismos hospedeiros mais utilizados para a produção de extratos funcionais17. A cepa BL21 Star (DE3) é preferida porque remove as proteases da membrana externa (OmpT protease) e do citoplasma (Lon protease), proporcionando um ambiente ideal para a expressão proteica recombinante. Além disso, o DE3 contém o λDE3 que carrega o gene para a polimerase T7 RNA (T7 RNAP) sob o controle do promotor lacUV5; o componente estelar contém um gene RNaseE mutado que previne o decote de mRNA 4,14,18,19. Sob o promotor lacUV5, a indução isopropyl-thiogalactopyranoside (IPTG) permite a expressão de T7 RNAP20,21. Essas cepas são usadas para cultivar e colher células, que dão matéria-prima para preparação de extratos. A lise celular pode ser realizada usando uma variedade de métodos, incluindo batida de contas, prensa francesa, homogeneização, sônica e cavitação de nitrogênio 1,11,12,22.

O processo de cultura bacteriana e colheita é consistente na maioria das plataformas ao usar E. coli, mas requer vários dias e intensa supervisão de pesquisadores 1,11,13. Este processo geralmente começa com uma cultura de sementes durante a noite no caldo LB, que após o crescimento da noite para o dia é então inoculado em uma cultura maior de 2xYTPG (levedura, triptona, tampão de fosfato, glicose) no dia seguinte. O crescimento dessa cultura maior é monitorado até chegar à fase de troncos do início ao meio, a uma densidade óptica (OD) de 2,514,20. A medição constante é necessária, pois os componentes da transcrição e da tradução foram previamente demonstrados como altamente ativos na fasede log 23,24 do início ao meio. Embora esse processo possa criar extrato reprodutível, nosso laboratório desenvolveu recentemente um novo método usando a Mídia de Autoindução Livre de Células (CFAI), que reduz a supervisão dos pesquisadores, aumenta o rendimento global do extrato para um determinado litro de cultura celular e melhora o acesso à preparação de extratos baseados em E. coli para usuários experientes e novos (Figura 1 ). Aqui fornecemos o guia passo-a-passo para implementar o fluxo de trabalho DO CFAI, para passar de uma placa de células listradas para uma reação CFPS completa dentro de 24 horas.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. Crescimento da mídia

  1. Prepare 960 mL de mídia CFAI conforme descrito na Tabela 1 e ajuste o pH para 7.2 usando KOH.
  2. Transfira a mídia cultural para um frasco de 2,5 L e autoclave por 30 min a 121 °C.
  3. Prepare uma solução de açúcar de 40 mL conforme descrito na Tabela 1. Esterilize a solução em um recipiente de vidro autoclavado separado.
    NOTA: A solução de açúcar pode ser armazenada em uma incubadora de 30 °C até que seja usada.
  4. Deixe a mídia esfriar completamente a menos de 40 °C após a autoclavagem.
  5. Antes da inoculação dos meios de comunicação CFAI, adicione a solução de açúcar diretamente à mídia CFAI.
  6. Para inocular a mídia, deslize um loopful de colônias de uma placa E. coli BL21 Star (DE3) anteriormente listrada e insira diretamente na mídia. Gire o laço na mídia, mas evite tocar nas laterais do recipiente. Certifique-se de que a placa de raia está fresca, com células viáveis.
  7. Coloque o frasco com a mídia inoculada em uma incubadora de 30 °C enquanto treme a 200 rpm. Permita que a cultura cresça da noite para o dia. Se as células forem inoculadas à noite, a cultura atingirá uma densidade óptica aproximada, medida a 600 nm (OD600), de 10 na manhã seguinte. Os tempos de inoculação e colheita podem ser ajustados conforme necessário.

2. Colheita celular

  1. Prepare o buffer S30 com antecedência e mantenha-o frio. Prepare o buffer S30 de acordo com a Tabela 2, para um pH final de 8.2.
    NOTA: O tampão S30 pode ser preparado dias antes da colheita da célula. Se isso for feito, prepare-se sem dithiothreitol e armazene a 4 °C. Adicione dithiothreitol pouco antes de usar.
  2. A partir deste ponto, mantenha todas as soluções e materiais no gelo. Transfira 1 L de mídia para uma garrafa de centrífugas de 1 L e centrífuga a 5.000 x g entre 4-10 °C por 10 min. Decantar e se livrar do supernatante. Usando uma espátula estéril, transfira a pelota para um tubo cônico pré-refrigerado e anteriormente pesado 50 mL.
  3. Lave uma vez com 30-40 mL de tampão S30 frio, reutilizando a pelota através de vórtice em rajadas de 30 s com períodos de descanso no gelo.
    NOTA: Devido a um maior volume de pelotas, dividir a pelota celular em dois tubos cônicos de 50 mL pode ser útil para a etapa de lavagem. Armazenar células em alíquotas menores também proporciona flexibilidade para o processamento a jusante.
  4. Centrifugar a resuspensão celular a 5000 x g entre 4-10 °C por 10 min.
  5. Descarte o supernatante e limpe qualquer excesso das paredes internas do tubo cônico de 50 mL usando um tecido limpo, evite tocar a própria pelota. Pesar e piscar congelam a pelota em nitrogênio líquido. Armazene a -80 °C até que use mais.
    NOTA: As pelotas podem não exigir o congelamento de flash se o usuário planeja continuar com o protocolo de preparação do extrato.

3. Preparação do extrato

  1. Combine a pelota congelada com 1 mL de tampão S30 para cada 1 g da pelota celular e deixe descongelar no gelo por aproximadamente 30-60 min. Resuspend degelo de pelota através de vórtice em rajadas de 30 s com períodos de descanso no gelo. Vórtice até que não haja aglomerados visíveis de células restantes.
    NOTA: Aglomerados menores podem ser resuspended misturando-se usando uma pipeta.
  2. Transfira alíquotas de 1,4 mL de ressuspensão celular em tubos de microfuge de 1,5 mL para lise celular. Sonicate cada tubo com uma frequência de 20 kHz e 50% de amplitude para três rajadas de 45 s com 59 s de descanso por ciclo cercado por um banho de gelo. Inverta o tubo entre os ciclos e adicione imediatamente 4,5 μL de 1 M de dithiothiothreitol após o último ciclo de sônica.
    NOTA: Devido ao calor liberado da sônica, é extremamente importante garantir que todas as alíquotas sejam mantidas no gelo quando não forem sônicas. O banho de gelo deve ser constantemente reabastecido ou grande o suficiente para ficar frio durante todo o processo de sônicação.
  3. Centrifugar cada tubo a 18.000 x g e 4 °C por 10 min. Recupere o supernatante e aliquot em tubos de microfuça de 1,5 mL em alíquotas de 600 μL. O flash congela as alíquotas e armazena a -80 °C até que seja mais útil. Deve-se tomar cuidado para pipeta apenas o supernante.

4. Síntese de proteínas sem células

  1. Descongele uma alíquota de extrato da etapa anterior para realizar 15 μL de reações de síntese proteica livre de células em tubos de microfuça de 1,5 mL em quadruplicato.
  2. Prepare cada reação combinando 240 ng de DNA (concentração final de 16 μg/mL), 2,20 μL de Solução A, 2,10 μL da Solução B, 5,0 μL de extrato e um volume variado de água de grau molecular para preencher a reação a 15 μL. Essa reação pode ser dimensionada para volumes maiores. Consulte a Tabela 3 para proporções.
    1. Prepare a solução A e B de acordo com a Tabela 4. Cada solução pode ser preparada em lotes de 100 μL a 1 mL, aliquoted e armazenados a -80 °C até uso adicional.
      NOTA: A quantidade de DNA pode variar dependendo da proteína de interesse. Neste caso, o plasmídeo utilizado, pJL1-sfGFP, foi otimizado para realizar a 16 μg/mL, ou 597 μM.
  3. Deixe as reações correrem pelo menos 4h a 37 °C.

5. Quantificação da proteína repórter, super pasta proteína fluorescente verde (sfGFP)

  1. Utilizando uma placa de poliestireno preto de meia área de 96-bem, combine 2 μL de cada produto de reação de síntese proteica livre de células com 48 μL de 0,05 M hepes tampão no pH 7.2. Recomenda-se três a quatro réplicas de cada tubo de reação.
  2. Quantifique a intensidade de fluorescência do sfGFP com um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 528 nm.
  3. Para a conversão de unidades relativas de fluorescência para rendimento volumoso (μg/mL) de sfGFP, estabeleça uma curva padrão utilizando pJL1-sfGFP purificado.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Ao preparar a mídia CFAI, a glicose foi trocada por um aumento da lactose e glicerol como o principal substrato energético na mídia. Além disso, a capacidade de tampão da mídia CFAI também foi aumentada. Estes componentes específicos são dados na Tabela 1.

As células foram então cultivadas para um OD600 de 10 e o padrão 2.5 em mídia CFAI para mostrar consistência com a qualidade do extrato, apesar das diferentes quantidades de extrato. A mídia 2.5 OD600 C...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

A supervisão dos pesquisadores é tradicionalmente necessária para duas ações-chave durante o crescimento celular: a indução de T7 RNAP e a colheita de células em um OD600 específico. O CFAI evita ambos os requisitos para diminuir o tempo e o treinamento técnico do pesquisador necessários para preparar extratos celulares de alta qualidade. A autoindução do T7 RNAP é obtida substituindo a glicose por lactose como o açúcar primário na mídia, evitando a necessidade anterior de monitorar ativamente o crescimento e,...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores declaram que não têm conflitos financeiros concorrentes de interesse.

Agradecimentos

Os autores gostariam de reconhecer a Dra. Os autores também gostariam de agradecer a Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington e Jillian Kasman por discussões úteis. Os autores também reconhecem o apoio financeiro do Bill and Linda Frost Fund, Center for Applications in Biotechnology Applied Research Endowment Grant, Cal Poly Research, Scholarly e national science foundation (NSF-1708919).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de microfuga de 1,5 mLPhenixMPC-425Q
1L Tubo de centrífugaBeckman CoulterA99028
Avanti J-E CentrífugaBeckman Coulter369001
CoASigma-AldrichC3144-25MG
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode ReaderBiotekBTCYT5F
D-GlucoseFisherD16-3
D-LactoseAlfa AesarJ66376
DTTThermoFisher15508013
Ácido FolínicoSigma-AldrichF7878-100MG
GlicerolFisherBP229-1
GlicinaSigma-AldrichG7126-100G
HEPESThermoFisher11344041
Rotor IPTGSigma-AldrichI6758-1G
JLA-8.1000 BeckmanCoulter366754
K(Glu)Sigma-AldrichG1501-500G
K(OAc)Sigma-AldrichP1190-1KG
KOHSigma-AldrichP5958-500G
L-AlaninaSigma-AldrichA7627-100G
L-ArgininaSigma-AldrichA8094-25G
L-AsparaginaSigma-AldrichA0884-25G
Ácido L-aspárticoSigma-AldrichA7219-100G
L-cisteínaSigma-AldrichC7352-25G
Ácido L-glutâmicoSigma-AldrichG1501-500G
L-GlutaminaSigma-AldrichG3126-250G
L-histadinaSigma-AldrichH8000-25G
L-IsoleucinaSigma-AldrichI2752-25G
L-LeucinaSigma-AldrichL8000-25G
L-LisinaSigma-AldrichL5501-25G
L-MetioninaSigma-AldrichM9625-25G
L-fenilalaninaSigma-AldrichP2126-100G
L-prolinaSigma-AldrichP0380-100G
L-serinaSigma-AldrichS4500-100G
L-treoninaSigma-AldrichT8625-25G
L-triptofanoSigma-AldrichT0254-25G
L-tirosinaSigma-AldrichT3754-100G
Caldo LuriaThermoFisher12795027
L-valinaSigma-AldrichV0500-25G
Mg(Glu)2Sigma-Aldrich49605-250G
Mg(OAc)2Sigma-AldrichM5661-250G
Microfuge 20Beckman CoulterB30134
Água de Grau MolecularSigma-Aldrich7732-18-5
NaClAlfa AesarA12313
NADSigma-AldrichN8535-15VL
New Brunswick Innova 42/42R IncubadoraEppendorfM1335-0000
NH4(Glu)Sigma-Aldrich09689-250G
NTPsThermoFisherR0481
Ácido OxálicoSigma-AldrichP0963-100G
PEPSigma-Aldrich860077-250MG
Fosfato de Potássio DibásicoAcros, OrgânicosA0382124
Fosfato de Potássio MonobásicoAcros, OrgânicosA0379904
Kit de Preparação de Plasmídeo PureLink HiPureThermoFisherK210007
PutrescinaSigma-AldrichD13208-25G
SpermidineSigma-AldrichS0266-5G
Tris(OAc)Sigma-AldrichT6066-500G
tRNASigma-Aldrich10109541001
TriptonaFisher Biorreagentes73049-73-7
Tunair 2.5L Frasco de agitação perplexoSigma-AldrichZ710822
ProcessadorultrassônicoQSonicaQ125-230V / 50HZ
Extrato de LeveduraFisher Bioreagentes1/2 / 8013

Referências

  1. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).
  2. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).
  3. Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).
  4. Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).
  5. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
  6. Calhoun, K. A., Swartz, J. R. Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism. Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).
  7. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments. (144), e58882(2019).
  8. Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression. System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).
  9. Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167, 248-254 (2016).
  10. Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering. Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).
  11. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  12. Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
  13. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
  14. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663(2015).
  15. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
  16. Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
  17. Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
  18. Ahn, J. H., et al. Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).
  19. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
  20. Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
  21. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).
  22. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  23. Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization. FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).
  24. Zawada, J., Swartz, J. Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations. Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).
  25. Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline. Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).
  26. Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
  27. Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
  28. Martin, R. W., et al. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. , 1-9 (2018).
  29. Soye, B. J. D., et al. Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource. Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).
  30. Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. A cell-free protein synthesis system from insect cells. Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).
  31. Heide, C., et al. development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Errata


Formal Correction: Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow
Posted by JoVE Editors on 5/23/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

to:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

Etiquetas

Extratos de E coliExpress o Livre de C lulasEngenharia de Prote nasLise CelularM todo de Sonica oQuantifica o de Fluoresc nciaTamp o S30Educa o em Biotecnologia
De células à síntese de proteínas livres de células dentro de 24 horas usando fluxo de trabalho de autoindução sem células
Entre em contato
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.