Este trabalho descreve a preparação do extrato celular de Escherichia coli (E. coli) seguido de reações de síntese proteica livre de células (CFPS) em menos de 24 horas. Explicação do protocolo de autoindução automática livre de células (CFAI) detalha melhorias feitas para reduzir a supervisão dos pesquisadores e aumentar as quantidades de extrato celular obtidos.
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Artigo de método
De células à síntese de proteínas livres de células dentro de 24 horas usando fluxo de trabalho de autoindução sem células
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Resumo
Resumo
A síntese de proteínas sem células (CFPS) cresceu como uma plataforma de biotecnologia que captura a transcrição e a máquina de tradução in vitro. Inúmeros desenvolvimentos tornaram a plataforma CFPS mais acessível aos novos usuários e expandiram a gama de aplicativos. Para sistemas cfps baseados em lysate, extratos celulares podem ser gerados a partir de uma variedade de organismos, aproveitando a bioquímica única desse hospedeiro para aumentar a síntese proteica. Nos últimos 20 anos, escherichia coli (E. coli) tornou-se um dos organismos mais utilizados para apoiar cfps devido à sua acessibilidade e versatilidade. Apesar de inúmeros avanços importantes, o fluxo de trabalho para a preparação do extrato de células E. coli tem permanecido um gargalo fundamental para que novos usuários implementem CFPS para suas aplicações. O fluxo de trabalho de preparação do extrato é demorado e requer conhecimento técnico para alcançar resultados reprodutíveis. Para superar essas barreiras, relatamos anteriormente o desenvolvimento de um fluxo de trabalho de autoindução livre de células 24 horas (CFAI) que reduz a entrada do usuário e a experiência técnica necessária. O fluxo de trabalho do CFAI minimiza a habilidade laboral e técnica necessária para gerar extratos celulares, ao mesmo tempo em que aumenta as quantidades totais de extratos celulares obtidos. Aqui descrevemos esse fluxo de trabalho de forma passo a passo para melhorar o acesso e apoiar a ampla implementação do CFPS baseado em E. coli .
Introdução
O uso de síntese de proteínas livres de células (CFPS) para aplicações de biotecnologia cresceu substancialmente nos últimos anos 1,2,3. Esse desenvolvimento pode ser atribuído, em parte, ao aumento dos esforços na compreensão dos processos que ocorrem no CFPS e ao papel de cada componente 4,5. Além disso, os custos reduzidos atribuídos a configurações otimizadas e fontes alternativas de energia tornaram a tecnologia livre de células mais fácil de implementar para novos usuários 6,7,....
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Protocolo
1. Crescimento da mídia
- Prepare 960 mL de mídia CFAI conforme descrito na Tabela 1 e ajuste o pH para 7.2 usando KOH.
- Transfira a mídia cultural para um frasco de 2,5 L e autoclave por 30 min a 121 °C.
- Prepare uma solução de açúcar de 40 mL conforme descrito na Tabela 1. Esterilize a solução em um recipiente de vidro autoclavado separado.
NOTA: A solução de açúcar pode ser armazenada em uma incubadora de 30 °C até que seja usada. - Deixe a mídia esfriar completamente a menos de 40 °C após a autoclavagem.
- Antes da inoculação dos meios de comunicação CFAI, adicione a solução de açúcar d....
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Resultados
Ao preparar a mídia CFAI, a glicose foi trocada por um aumento da lactose e glicerol como o principal substrato energético na mídia. Além disso, a capacidade de tampão da mídia CFAI também foi aumentada. Estes componentes específicos são dados na Tabela 1.
As células foram então cultivadas para um OD600 de 10 e o padrão 2.5 em mídia CFAI para mostrar consistência com a qualidade do extrato, apesar das diferentes quantidades de extrato. A mídia 2.5 OD600 C.......
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Discussão
A supervisão dos pesquisadores é tradicionalmente necessária para duas ações-chave durante o crescimento celular: a indução de T7 RNAP e a colheita de células em um OD600 específico. O CFAI evita ambos os requisitos para diminuir o tempo e o treinamento técnico do pesquisador necessários para preparar extratos celulares de alta qualidade. A autoindução do T7 RNAP é obtida substituindo a glicose por lactose como o açúcar primário na mídia, evitando a necessidade anterior de monitorar ativamente o crescimento e,.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm conflitos financeiros concorrentes de interesse.
Agradecimentos
Os autores gostariam de reconhecer a Dra. Os autores também gostariam de agradecer a Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington e Jillian Kasman por discussões úteis. Os autores também reconhecem o apoio financeiro do Bill and Linda Frost Fund, Center for Applications in Biotechnology Applied Research Endowment Grant, Cal Poly Research, Scholarly e national science foundation (NSF-1708919).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de microfuga de 1,5 mL | Phenix | MPC-425Q | |
| 1L Tubo de centrífuga | Beckman Coulter | A99028 | |
| Avanti J-E Centrífuga | Beckman Coulter | 369001 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C3144-25MG | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT5F | |
| D-Glucose | Fisher | D16-3 | |
| D-Lactose | Alfa Aesar | J66376 | |
| DTT | ThermoFisher | 15508013 | |
| Ácido Folínico | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| Glicerol | Fisher | BP229-1 | |
| Glicina | Sigma-Aldrich | G7126-100G | |
| HEPES | ThermoFisher | 11344041 | |
| Rotor IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| JLA-8.1000 Beckman | Coulter | 366754 | |
| K(Glu) | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| K(OAc) | Sigma-Aldrich | P1190-1KG | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
| L-Alanina | Sigma-Aldrich | A7627-100G | |
| L-Arginina | Sigma-Aldrich | A8094-25G | |
| L-Asparagina | Sigma-Aldrich | A0884-25G | |
| Ácido L-aspártico | Sigma-Aldrich | A7219-100G | |
| L-cisteína | Sigma-Aldrich | C7352-25G | |
| Ácido L-glutâmico | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| L-Glutamina | Sigma-Aldrich | G3126-250G | |
| L-histadina | Sigma-Aldrich | H8000-25G | |
| L-Isoleucina | Sigma-Aldrich | I2752-25G | |
| L-Leucina | Sigma-Aldrich | L8000-25G | |
| L-Lisina | Sigma-Aldrich | L5501-25G | |
| L-Metionina | Sigma-Aldrich | M9625-25G | |
| L-fenilalanina | Sigma-Aldrich | P2126-100G | |
| L-prolina | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-serina | Sigma-Aldrich | S4500-100G | |
| L-treonina | Sigma-Aldrich | T8625-25G | |
| L-triptofano | Sigma-Aldrich | T0254-25G | |
| L-tirosina | Sigma-Aldrich | T3754-100G | |
| Caldo Luria | ThermoFisher | 12795027 | |
| L-valina | Sigma-Aldrich | V0500-25G | |
| Mg(Glu)2 | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| Microfuge 20 | Beckman Coulter | B30134 | |
| Água de Grau Molecular | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| NaCl | Alfa Aesar | A12313 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N8535-15VL | |
| New Brunswick Innova 42/42R Incubadora | Eppendorf | M1335-0000 | |
| NH4(Glu) | Sigma-Aldrich | 09689-250G | |
| NTPs | ThermoFisher | R0481 | |
| Ácido Oxálico | Sigma-Aldrich | P0963-100G | |
| PEP | Sigma-Aldrich | 860077-250MG | |
| Fosfato de Potássio Dibásico | Acros, Orgânicos | A0382124 | |
| Fosfato de Potássio Monobásico | Acros, Orgânicos | A0379904 | |
| Kit de Preparação de Plasmídeo PureLink HiPure | ThermoFisher | K210007 | |
| Putrescina | Sigma-Aldrich | D13208-25G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-5G | |
| Tris(OAc) | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| Triptona | Fisher Biorreagentes | 73049-73-7 | |
| Tunair 2.5L Frasco de agitação perplexo | Sigma-Aldrich | Z710822 | |
| Processador | ultrassônicoQSonica | Q125-230V / 50HZ | |
| Extrato de Levedura | Fisher Bioreagentes | 1/2 / 8013 |
Referências
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics.....
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow
Posted by JoVE Editors on 5/23/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University
to:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University
