Fluorescência ao vivo, imagem inversa de frisação celular e macropinocitose

Resumo

Este protocolo demonstra imagens de dextrana em células vivas usando captação contínua e imagens inversas para otimizar a visualização de babados, maturação de macropinossomas e análise de dextrana e outras marcações celulares.

Resumo

A macropinocitose é um processo altamente conservado, mas ainda incompletamente compreendido, essencial para a absorção e ingestão de fluidos, nutrientes em fase fluida e outros materiais nas células. A extensão dramática dos babados da superfície celular, seu fechamento para formar macropinossomos e a maturação dos macropinossomos internalizados são eventos-chave nessa via que podem ser difíceis de capturar usando imagens confocais convencionais baseadas no rastreamento de um bolo de carga fluorescente. As dextranas fluorescentes são comumente usadas experimentalmente como marcadores de fase fluida para macropinossomos e para outras vias endocíticas. Um método que o laboratório adotou para otimizar a imagem da captação de dextrana envolve o uso de imagens ao vivo de células banhadas em altas concentrações de dextrano fluorescente no meio, com as células não marcadas aparecendo em relevo (como preto). Os babados celulares são destacados para visualizar o fechamento do babado, e os macropinossomos internalizados aparecem como vacúolos fluorescentes no interior da célula. Este método é ideal para visualizar características do macropinossomo e permite fácil segmentação e quantificação. Este artigo descreve a marcação dupla de vias com dextrans de tamanhos diferentes e a co-expressão de sondas lipídicas e proteínas de membrana fluorescentes para demarcar macropinossomos e outros endossomos. A detecção de dextrano internalizado em um nível ultraestrutural usando microscopia eletrônica e de luz correlativa (CLEM) também é demonstrada. Esses processos celulares podem ser visualizados usando várias modalidades de imagem ao vivo, inclusive em 3D. Juntas, essas abordagens otimizam a imagem de macropinossomos para muitos ambientes e sistemas experimentais diferentes.

Introdução

A maioria dos tipos de células de vertebrados compartilha a capacidade inata de absorção não seletiva de fluido com predecessores ao longo da evolução, remontando à ameba unicelular¹. Este processo altamente conservado de absorção em fase fluida pela macropinocitose (beber muito) é usado pela ameba principalmente para aquisição de nutrientes¹, enquanto em células de vertebrados, pode ser uma rota de fornecimento para a obtenção de nutrientes sob estresse, e é usado por células imunes para a amostragem e vigilância de ambientes de tecidos². A macropinocitose tem ca....

Protocolo

1. Preparação de células em pratos com fundo de vidro de 35 mm (Dia 0)

1. Manter e passar linhagens celulares em meio completo suplementado com 10% de soro fetal inativado por calor (para RAW264.7) ou regular e 1% de L-glutamina, a 37 ° C em incubadora umidificada de 5% de CO₂ .
2. Colocar o número adequado de células em placas para atingir 60% de confluência em 24 h, em placas com fundo de vidro de 35 mm.
   NOTA: A densidade celular recomendada está entre 2 mL de 0.15 x 10⁶ células/mL a 0.25 x 10⁶ células/mL para as células de câncer de mama RAW264.7, BV2 e MDA-MB 231 descritas aqui.<....

Resultados

A abordagem de imagem de células vivas não marcadas imersas em alta concentração de dextrano fluorescente tem várias vantagens sobre as técnicas convencionais de imagem para rastrear macropinocitose. Ao apresentar as imagens em relevo, os corpos celulares aparecem em preto e permitem uma melhor visualização da dramática superfície celular contra um fundo fluorescente brilhante, seguido pela internalização em fase fluida de macropinossomos preenchidos com dextrana TMR (70 kDa), conforme ilustrado na F.......

Discussão

Este artigo descreve variações nas formas mais tradicionais de usar a marcação com dextrana para rastrear macropinocitose, com base em imagens ao vivo de células banhadas continuamente em dextrana fluorescente (s) e visualizando a absorção no fundo preto de células não marcadas. O protocolo otimizado fornece os meios para distinguir entre diferentes vesículas intracelulares e permite um rastreamento espaço-temporal de múltiplas cargas e proteínas macropinocitóticas e endocíticas. O métod.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2% Tetróxido de Ósmio	ProSciTech	EMS19192
647-Transferrin	Sondas Moleculares, Invitrogen	Células T23366
BV2	Presente gentilmente dado a nós pelo Dr. Liviu Bodea (Queensland Brain Institute)	-
CpG (Classe B) B	Integrated DNA Technologies	Pedido
Dextran Alexa Fluor 488 a 10 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D22910
Dextran Alexa Fluor 647 a 10 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D22914
Dextran Oregon Green 488 a 70 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D1818
Dextran Tetrametilrodamina a 70 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D7173
Meio DMEM com piruvato de sódio e L-glutamina	Gibco Invitrogen	# 11995
Soro fetal de bezerro	Interpath Services Pty Ltd	SFBS-F
Solução aquosa de glutaraldeído, Grau EM 25%	ProSciTech	C002
Jeol 1011 microscópio eletrônico	JEOL-L-Glutamina
	Gibco Invitrogen	25030081
Lipofectamine 2000	Gibco Invitrogen	11668019
MatTek  Prato com fundo de vidro 35 mm, grade não revestida	MatTek Corporation	P35G-2-14-CGRD
Pratos com fundo de vidro MatTek 35 mm não revestidos	MatTek Corporation	P35G-1.5-14C
MDA-MB 231 células	ATCC	HTB-26
Opti-MEM meio de soro reduzido	Thermo Fisher Scientific	31985088
Plasmídeo mCherry-2XFYVE	Presente gentilmente dado a nós pelo Dr. Frederic Meunier (Universidade de Queensland)	-
Plasmídeo mCherry-PLCδ-PH	Presente gentilmente dado a nós pelo Dr. Frederic Meunier (Universidade de Queensland)	-
Raw264.7 células	ATCC	TIB-71
RPMI meio 1640, sem L-glutamina	Gibco Invitrogen	#21870
Ultrapure LPS	Jomar Life Research Pte Ltd	TLR-3PELPS
Acetato de Uranila	ProSciTech	C079
Zeiss invertido LSM880 microscópio confocal	Zeiss	-

Personalizado