Imunostaining flutuante livre de cérebros de rato

Resumo

Este protocolo descreve uma abordagem eficiente e reprodutível para estudos histológicos cerebrais do camundongo, incluindo perfusão, seção cerebral, imunostaining flutuante livre, montagem de tecido e imagem.

Resumo

A coloração imunohistoquímica do cérebro de camundongos é uma técnica de rotina comumente usada na neurociência para investigar mecanismos centrais subjacentes à regulação do metabolismo energético e outros processos neurobiológicos. No entanto, a qualidade, confiabilidade e reprodutibilidade dos resultados da histologia cerebral podem variar entre os laboratórios. Para cada experimento de coloração, é necessário otimizar os procedimentos-chave baseados em diferenças de espécies, tecidos, proteínas direcionadas e condições de trabalho dos reagentes. Este artigo demonstra um fluxo de trabalho confiável em detalhes, incluindo perfusão intra-aórtica, seção cerebral, imunostaining flutuante livre, montagem de tecido e imagem, que podem ser seguidos facilmente por pesquisadores neste campo.

Também são discutidos como modificar esses procedimentos para satisfazer as necessidades individuais dos pesquisadores. Para ilustrar a confiabilidade e eficiência deste protocolo, as redes perineuronas foram manchadas com wisteria florbunda agglutinina (WFA) e vasopressina arginina (AVP) com um anticorpo anti-AVP no cérebro do rato. Finalmente, os detalhes críticos de todo o procedimento foram abordados, e as vantagens deste protocolo em comparação com os de outros protocolos. Juntos, este artigo apresenta um protocolo otimizado para a imunostaining flutuante livre do tecido cerebral do rato. Seguir este protocolo torna esse processo mais fácil para cientistas juniores e seniores melhorarem a qualidade, confiabilidade e reprodutibilidade dos estudos de imunossuagem.

Introdução

A prevalência de obesidade e comorbidades associadas atingiu níveis epidêmicos, causando uma tremenda carga socioeconômica1,2. Vários modelos de camundongos foram desenvolvidos para entender melhor os processos biológicos responsáveis pela ^obesidade3,4. Como os mecanismos centrais são importantes para a regulação da homeostase energética nesses modelos animais, estudos neuroanatomômicos de cérebros de camundongos tornaram-se uma técnica necessária neste campo. No entanto, a qualidade, confiabilidade e reprodutibilidade das técnicas de histologia cerebr....

Protocolo

Foram utilizados camundongos C57BL/6J de ambos os sexos (8-16 semanas de idade) no presente estudo. O cuidado com todos os animais e todos os procedimentos foi aprovado pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Baylor College of Medicine.

1. Perfusão

NOTA: As etapas 1.1 - 1.6 são realizadas em um capô de fumaça.

1. Anestesia
   1. Despeje 5 mL de isoflurane (veja a Tabela de Materiais) em uma toalha de papel colocada na parte inferior de um dessecador. Introduza o mouse na barreira furada dentro do dessedático e espere até que os sinais de respiração t....

Resultados

O fluxograma deste protocolo é brevemente ilustrado na Figura 1. O procedimento de crioseção deste laboratório é demonstrado na Figura 2A, na qual 5 amostras cerebrais foram seccionadas simultaneamente. A montagem de seções cerebrais é mostrada na Figura 2B, e um slide totalmente montado com seções cerebrais é ilustrado na Figura 2C. Na Figura 3, foram observadas imagens re.......

Discussão

Este protocolo fornece um método estabelecido para estudos neuroanatomáticos do cérebro do camundongo, incluindo perfusão, secção tecidual, imunostaining flutuante livre, montagem de tecido e imagem. No entanto, alguns detalhes-chave essenciais para resultados consistentes e confiáveis devem ser otimizados.

A qualidade da perfusão é fundamental para o sucesso da coloração. Os resultados da coloração podem ser afetados se o sangue permanecer no cérebro, dado que os glóbulos sanguíneos (por exem.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Alexa Flour 594 burro anti-coelho IgG (H+L)	Invitrogen	A21207
30% de sacarose	VWR	470302	30 g de sacarose dissolvida em 100 mL de PBS
Formalina Tamponada Neutra	VWR	16004-128	10%, 25 ° C, pH 6,8-7,2
Seringa Sub-Q de 1 mL	BD	309597
Placa de Cultura de Células de 48 Poços	Corning	3548
Placa de Cultura de Células de 6 Poços	Corning	3516
Mídia de montagem antidesbotamento com DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Dessecador de plástico autoclavável	Thermo Scientific Nalgene	5315-0150
Anticorpo AVP	Phoenix Pharmaceuticals	H-065-07
Filtro de células	Corning	431752
Tampão crioprotetor	Preferência do usuário	Não aplicável	20% de glicerol, 30% de etilenoglicol e 50%
de PBS Isoflurano	Covetrus	11695-6777-2
Microscópio Leica DFC310FX	Leica	Não aplicável
Caixas de lâminas de microscópio (50 lugares)	VWR	Não aplicável
PBT	Preferência do utilizador	Não aplicável	2,5 ml de Triton X-100 dissolvido em 1000 ml de PBS
Perfusão dois sistemas de perfusão automatizados	Leica	39471005
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) 20x	VWR	VWRVE703-1L	25 ° C, pH 7,3-7,5, 1x composição: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 9,8 mM Tampão fosfato
Micrótomo deslizante Microm HM450	ThermoFisher	Microm HM450
Cloreto de sódio	RICCA Químico	7220-32	0,9%, 25 ° C, pH 7,4
Proteína de estreptavidina, DyLight 488	ThermoFisher	#21832
Triton X-100	Sigma-Aldrich	089k01921
anticorpo WFA	Sigma-Aldrich	L1516
Zeiss Axio Z1 Scanner	Zeiss	Não aplicável
Zen 3.1 software			scanner software