Método de alta produtividade, robusto e altamente flexível para esterilização superficial de sementes arabidopsis

Summary

É fornecido um protocolo de alta produtividade para a esterilização superficial de sementes arabidopsisthaliana (Arabidopsis), otimizando as etapas de manuseio líquido com um simples dispositivo de sucção construído com uma bomba de vácuo. Centenas de amostras de sementes podem ser esterilizadas em um dia.

Abstract

Arabidopsis é de longe a espécie modelo vegetal mais utilizada para estudos funcionais. A esterilização superficial das sementes arabidopsis é um passo fundamental necessário para este fim. Assim, é primordial estabelecer métodos de esterilização superficial de sementes arabidopsis de alto rendimento para lidar com dezenas a centenas de amostras (por exemplo, linhas transgênicas, ecotipos ou mutantes) ao mesmo tempo. Um método de esterilização de superfície de sementes baseado na eliminação eficiente de líquido em tubos com um dispositivo de sucção caseiro construído a partir de uma bomba de vácuo comum é apresentado neste estudo. Reduzindo drasticamente o tempo prático com este método manuseando várias centenas de amostras em um dia é possível com pouco esforço. As análises do curso-período da série indicaram ainda uma faixa de tempo altamente flexível de esterilização superficial, mantendo altas taxas de germinação. Este método poderia ser facilmente adaptado para esterilização superficial de outros tipos de pequenas sementes com simples personalização do dispositivo de sucção de acordo com o tamanho da semente, e a velocidade desejada para eliminar o líquido.

Introduction

Arabidopsis é uma espécie de planta diploide pertencente à família Brassicaceae. Seu ciclo de vida relativamente curto (dois meses por geração em condições de crescimento prolongado), tamanho de plantas pequenos e auto-polinização com a produção de centenas de sementes por planta fizeram dela a primeira espécie fundamental do modelo vegetal^1,2. Além disso, seu genoma foi totalmente sequenciado³, extensas ferramentas genéticas reversas (T-DNA saturado, transposon e populações quimicamente mutagenizadas) estão disponíveis^4,5,....

Protocol

1. Reagentes e preparação da mídia

1. Prepare 70% solução de etanol: Adicione 737 mL de 95% de etanol técnico a 263 mL de água destilada. Homogeneizar.
   NOTA: Prepare a solução de 70% de etanol em um banco de trabalho não estéril.
   ATENÇÃO: O etanol é altamente inflamável e pode causar séria irritação nos olhos. Mantenha-se longe de chamas e fontes de calor. Em caso de contato com os olhos, enxágue com água abundante.
2. Prepare 5% solução de alvejante: Adicione 5 mL de alvejante doméstico (contendo ~3,5% de hipoclorito de sódio, NaClO) a 95 mL de água destilada estéril. Adicione algumas gotas de detergente não iônico (por exemplo, Interpol 20) e mis....

Results

Para avaliar o tempo necessário para todo o procedimento de esterilização de sementes, foram calculadas as diferenças de tempo para o manuseio líquido de 96 amostras no protocolo atual e comparadas com os métodos tradicionais de pipetação. O resultado indica que o protocolo atual economiza tempo, cortando o tempo de manuseio líquido para um quarto disso com os protocolos tradicionais(Tabela 1). A tabela destaca ainda que o tempo de remoção de líquidos no protocolo atual economiza mais tempo do que o dos .......

Discussion

A esterilização de sementes é o passo fundamental para estudos funcionais em Arabidopsis. Embora seja frequentemente realizada para muitos propósitos diferentes, estudos limitados sobre esterilização de superfície de sementes de alta produtividade em Arabidopsis estão disponíveis.

Até agora, um dos métodos com maior rendimento é o uso de gás cloro gerado pela mistura de alvejante com HCl concentrado. Embora este método exija tempo prático limitado, ele usa um gás altamente tóxico para os seres.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit	de válvula de	Amazon	incluindo 2 válvulas e tubos de paredes finas. A válvula impede que os líquidos voltem para a ponta estéril
Arabidopsis Col-0 sementes do tipo selvagem	Nottingham Arabidopsis Stock Center	N1093	Sementes do tipo selvagem (sensíveis à canamicina)
Arabidopsis linha transgênica AdoIspS-79 sementes	NA	NA	Linha transgênica superexpressando um gene da isopreno sintase de Arundo donax transformado no fundo Col-0, resistente à canamicina (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583– 2599). Disponível a pedido dos autores
Microcentrífuga	Eppendorf	EP022628188	Microcentrífuga de bancada usada para girar as sementes
Murashige & Meio Skoog incluindo vitaminas	Duchefa	M0222	Meio padrão para cultura estéril de plantas
Controlador de pipeta	Marca	26300	Usado para operar a pipeta sorológica
Tubo de polietileno 1	Roth	9591.1	Tubo para conexão da bomba de vácuo ao frasco de decantação (diâmetro interno: 7 mm; diâmetro externo: 9 mm)
Tubo de polietileno 2	Roth	9587.1	Tubo para conexão da garrafa de decantação à válvula do aquário (diâmetro interno: 5 mm; diâmetro externo: 7 mm)
Tampa de rosca com conectores	Roth	PY86.1	Dispensador de 2 vias tampa de rosca GL45 em polipropileno para garrafa de decantação
Pipeta serológica	Marca	27823	Pipeta serológica de vidro graduado (reutilizável). Pipetas descartáveis podem ser usadas em vez
disso Shakeret al.	Qiagen	85300	TissueLyser II usado normalmente para homogeneização de tecidos. Sem a adição de grânulos aos tubos, funciona como agitador.
Etanol técnico	ITW Reagentes (Nova Chimica Srl)	212800	Etanol 96% v/v parcialmente desnaturado grau técnico
Tween 20	Merck Millipore	655205	Detergente não iônico atuando como surfactante
Conectores de tubulação universais	Roth	Y523.1	Pode ser usado para melhorar/simplificar as conexões de tubulação
Bomba de vácuo	Merck Millipore	WP6222050	Usado para Fazendo o dispositivo de sucção