Summary
提供用于 拟南芥（Arabidopsis） 种子表面灭菌的高通量方案，通过带有真空泵的简单抽吸装置优化液体处理步骤。数百个种子样品可以在一天内进行表面灭菌。
Abstract
拟南芥是迄今为止最广泛用于功能研究的植物模型物种。拟南芥种子的表面灭菌是实现这一目标所需的基本步骤。因此，建立高通量拟南芥种子表面灭菌方法以同时处理数十至数百个样品（例如，转基因品系，生态型或突变体）至关重要。本研究提出了一种基于用普通真空泵构成的自制抽吸装置有效消除管中液体的种子表面灭菌方法。通过大大减少劳动密集型的动手时间，这种方法可以在一天内处理数百个样品，而几乎不费吹灰之力。系列时间过程分析进一步表明，通过保持高发芽率，表面灭菌的时间范围高度灵活。该方法可以很容易地适应于其他种类小种子的表面灭菌，只需根据种子大小和消除液体所需的速度对抽吸装置进行简单的定制。
Introduction
拟南芥是一种二倍体植物，属于芸苔科。其相对较短的生命周期（在长日生长条件下每代两个月），植物体积小，并且每株植物产生数百个种子的自花授粉使其成为第一个基本植物模型物种1，2。此外，其基因组被完全测序3，广泛的反向遗传学工具（饱和的T-DNA、转座子和化学诱变的群体）都可用4、5、6，并且有效的农杆菌介导的转化是建立起来的，以获得足够的转基因品系，用于进一步的下游工作7.因此，在过去的二十年中，使用拟南芥作为模型物种在分子水平上剖析植物生物学的各个方面方面取得了巨大进展，包括自然，遗传和表型变异8，9。
为了在功能上表征拟南芥感兴趣的基因，种子表面灭菌以消除真菌和细菌污染物是许多需要轴线培养的下游方案的先决条件步骤。遗传转化对于过表达10、敲低（RNA-I11）或敲除（基因组编辑12、13）的基因功能、亚细胞定位14、启动子活性15、16、蛋白-蛋白17和蛋白-DNA相互作用18，仅举出最常见的应用，都需要种子表面的灭菌步骤。因此，尽管相对简单，但种子表面灭菌在许多功能分析中起着重要作用。
到目前为止，已经开发了两大类基于气相或液相灭菌的种子表面灭菌方法19。虽然气相种子表面灭菌的通量为中到高，但使用有害试剂氯气作为表面杀菌剂阻碍了其广泛应用。相反，基于液相灭菌的方法依赖于较温和的化学品，如乙醇和漂白剂溶液进行表面灭菌，并且尽管它们的吞吐量本质上低于氯熏蒸，但它们的使用范围更广。通常，通常使用两种使用液体试剂的不同方法。一种广泛使用的方法是基于用乙醇和漂白剂以不同的浓度洗涤不同的时间20，21。另一种方法是基于漂白剂的应用只有21、22。这两种方法主要应用于小规模的种子表面灭菌。然而，在许多实验中，需要筛选许多源自一次转化的拟南芥转基因品系15、23或平行筛选由不同转化产生的许多转基因品系24、25。据我们所知，尚未发表基于液体的高通量种子表面灭菌方法，尽管鲜为人知，但这构成了功能基因组学方法的重要瓶颈。因此，开发安全、稳健和高通量的种子表面灭菌方法是同时成功实现许多基因功能表征的必要和关键步骤。
为此，在目前的研究中，提出了一种改进的拟南芥种子表面灭菌方法。这种方法安全、低成本、高稳健性和高通量，允许从种子表面灭菌开始到培养皿中种子播种结束的一小时内处理96条独立生产线。所展示的方法依赖于广泛使用的基本实验室仪器，如真空泵，消耗性玻璃器皿和塑料器皿。这种改进的方法为科学界提供了一种安全，简单且负担得起的方法来简化种子表面灭菌，其吞吐量足以满足拟南芥和其他非模型植物物种的现代功能基因组学方法。
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Protocol
1. 试剂和培养基制备
- 制备70%乙醇溶液：将737毫升95%工业乙醇加入263毫升蒸馏水中。彻底混合。
注意：在非无菌工作台上准备70%乙醇溶液。
注意：乙醇高度易燃，会对眼睛造成严重刺激。远离火焰和热源。如果接触眼睛，请用大量清水冲洗。 - 准备5%漂白剂溶液：将5毫升家用漂白剂（含有约3.5%次氯酸钠，NaClO）加入95毫升无菌蒸馏水中。加入几滴非离子洗涤剂（例如吐温20）并彻底混合。
注意：在层流罩内准备5%漂白剂溶液。
注意：次氯酸钠是漂白剂的活性成分，具有高度刺激性。它具有高度腐蚀性，可对胃肠道造成严重损害。如不慎接触，请立即用大量清水冲洗。如果摄入，请致电中毒控制中心或医生寻求治疗建议。 - 准备半强度的村子和Skoog（1/2 MS）中等26。
- 在800毫升蒸馏水中加入2.2克MS培养基粉末（包括维生素）和10克蔗糖。使用1 M KOH调节溶液的pH值，并使用蒸馏水将体积调高至1 L。将500毫升等分到1升瓶中，加入4克琼脂以制备固体培养基。高压灭菌解决方案。
- 高压灭菌后，在水浴中将培养基冷却至50-53°C，然后将其倒入层流罩下的培养皿中。为了制备选择性培养基，向培养基（50-53°C）中加入1000μL / L的50mg / mL卡那霉素储备溶液（将500mg硫酸卡那霉素一水合物混合在10mL蒸馏水中，过滤灭菌并储存在-20°C）。通过旋转混合均匀，并如前所述倒入培养皿中。
2. 吸气器设置
注：仪器设置总结在 图1中。
- 将真空泵入口连接到合适尺寸的聚乙烯（PE）管的一端。将管的另一端连接到倾析瓶双向盖的出口。用密封膜（材料表）紧紧包裹管道的连接处，以确保气密连接。
- 将第二根PE管连接到倾析瓶上螺旋盖的入口（突出到瓶子内部的孔）。将管子的另一侧安装到水族箱阀门的出口处。如有必要，请沿连接处用密封膜包裹，以消除漏气。
- 在使用前，将无菌的200 μL移液器吸头安装到层流罩下方的水族箱过滤器入口处。
图1：用于高通量去除灭菌液的抽吸装置的示意图。为清楚起见，单个零件不会按比例绘制。字母（A）表示真空泵，（B）储存瓶中收集液体（乙醇、漂白剂或无菌水），（C）阀门表示避免液体回流，（D）无菌200μL移液器吸头，以及（E）1.5毫升微量离心管中含有种子和灭菌液。箭头指示气流的方向。请点击此处查看此图的放大版本。
3. 种子高通量液面杀菌
注：图2总结了拟南芥（L.）Heynh野生型（Col-0）（拟南芥）种子与96个独立样品进行表面灭菌所需的整个过程和最短时间。
- 用永久标记标记两批48 x 1.5 mL微量离心管，并带有渐进编号。
- 将100-200粒拟南芥种子加入96个无菌1.5mL微量离心管（大约在管锥形端底部上方1-2毫米处）。
- 使用层流罩内的10 mL无菌血清学移液管（第一批种子，48管）将约1000μL70%乙醇等分到每管中，并小心地关闭盖子。
注意：分配溶液不需要非常准确，只要分配的体积比种子体积高几倍。或者，在层流罩（非无菌状态）外执行此步骤。 - 在振荡器中以8.0 Hz的振荡频率摇动管至少3分钟。
- 从摇摇杯中取出适配器，然后将其转移到台式微量离心机的篮筐中。
- 使用脉冲功能（存在于大多数台式离心机中）快速旋转种子，达到1880 x g（~15 s）。
注意：较长的时间或更高的离心力会对种子发芽产生负面影响。 - 将 48 根管从适配器转移到一个机架上，然后打开层流罩下的所有管子。通过不触摸盖子中适合管子的部分来避免污染。如果盖子彼此离得太近，请将管子分成两个架子，以便于处理。
- 将无菌的200μL黄色尖端安装到层流罩下自制吸气器的水族箱阀门入口处，然后打开泵。
- 将黄色尖端插入种子水平上方，以避免在吸吮液体时接触种子。或者，快速将尖端定位在管的底部;如果种子阻挡了液体的吸力，请消除黄色尖端并插入新的尖端。
- 使用层流罩内的10 mL无菌血清学移液管将等分试样到每管约1000μL5%漂白剂中。
- 紧紧关闭所有盖子，然后将所有管子放回摇摇床适配器中。在振荡器中以8.0 Hz的振荡频率摇动管至少3分钟。
- 使用台式离心机的脉冲功能快速旋转种子，所需时间达到1880 x g（~15 s）。
- 将新的无菌200 μL黄色尖端安装到连接到层流罩下的真空泵的水族箱阀上，然后打开泵。
- 将黄色尖端插入种子水平上方，以避免在吸入漂白剂溶液时接触种子。
- 在层流罩中使用10 mL无菌血清学移液器将1000μL灭菌的H2O等分试样到每管中。
注意：将两批种子混合在一起，以最大限度地缩短操作时间。 - 将新的无菌200 μL黄色尖端安装到连接到层流罩下的真空泵的水族箱阀上，然后打开泵。
- 将黄色尖端插入种子水平的正上方，以避免在吸吮H2O时接触种子。
- 使用10 mL无菌血清学移液管将等分试样到每管约500μL灭菌的H2O中，并关闭层流罩中的所有盖子。种子已经准备好播种了。如果需要，将管子保持在室温下几个小时或4°C过夜。
- 用适量的水填充用于收集液体的储液瓶并高压灭菌。之后，将液体丢弃到正常的水槽中。
注意：高压灭菌液体以杀死储液罐内的所有种子。
图2：使用96个独立样品对拟南芥种子进行表面灭菌所需的程序和最小时间概述。 在所提出的实验中，96个独立的样品被处理成两个大小相等的批次。两个批次的整个过程是相同的，并且它们是并行处理的，但与第一批相比，第二批处理的延迟为一步。 请点击此处查看此图的放大版本。
4. 拟南芥在1/2 MS板上的电镀和评分
- 通过用1000μL移液器轻轻移液，将种子和300-400μL无菌H2O转移到培养皿中。
- 转移10管后，将约1.5-2.0 mL熔化的1/2 MS培养基（不含抗生素）倒入每块板中。
注意：提前熔化，然后将1/2 MS熔化的介质保持在50-53°C的恒温浴中，以避免凝固。确保温度不超过58°C，以避免降低种子的发芽性。 - 快速旋转盘子，将种子分配到里面。用胶带将板材贴在相对的两侧。
- 将板包裹在塑料或铝箔中，然后将其置于冰箱（4°C）中，在黑暗中3天以获得均匀发芽。
- 将板转移到在长时间工作条件下（16小时光照/ 8小时黑暗）下设置在23°C的生长室中，光强度为100-120μmol·m-2·s-1，相对湿度为60%。
- 两天后，根据根状茎的存在对植物进行评分。检测胚芽的出现和绿色子叶的形成（两个子叶的完全开放）以评估种子萌发。
5. 统计分析
注意：在这里，Tukey的成对检验用于统计分析。
- 将低于 0.01 的 P 值视为具有统计显著性。至少用五个生物重复进行所有实验。
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Representative Results
为了评估整个种子灭菌过程所需的时间，计算了当前方案中96个样品的液体处理时间差，并与传统移液方法进行了比较。结果表明，当前协议节省了时间，将液体处理时间缩短到传统协议的四分之一（表1）。该表进一步强调，与传统方法相比，当前方案中的液体去除时间节省了更多时间，总体减少了八倍。
种子灭菌时间范围的选择
较长的灭菌步骤可最大限度地降低污染率，但会对种子发芽产生负面影响。为了确定具有最高发芽率且无污染的种子灭菌的最佳时间范围，测试了每个灭菌步骤的不同持续时间，评估了种子发芽率和绿色子叶出苗率。从第2天到第4天和第7天进行的发芽分析表明，从10分钟到40分钟70%乙醇灭菌的时间范围内没有显着差异。然而，从用70%乙醇处理40分钟后，发芽率下降（图3）。相应地，绿色子叶出现率降低（图4）。由于较短的灭菌时间可以提高通量，但会增加污染率，因此评估了在两批48个样品中对96个不同种子样品进行灭菌所需的最短时间。此外，考虑到在摇摇杯中进行摇动的首选设置，我们通过处理96个样品，每批48个样品，测试了种子灭菌所需的最短时间。一次处理48个样品所需的最短时间为3分钟，因此允许在第一组样品后立即处理第二组48个样品，而无需任何等待时间。因此，3分钟用于70%乙醇和3分钟用于5%漂白剂作为灭菌种子的最短时间（图3中的（a）点）。这些分析导致发芽率与最高发芽率相似，而没有污染和种子活力损失（图3）。
总之，保持最高百分比的种子萌发而不因充分消除微生物而产生的污染的合适时间范围是70%乙醇的3-30分钟和5%漂白剂的3-22.5分钟之间。
为了证明我们最初使用的种子被微生物污染，非无菌种子直接播种在MS板上。真菌在播种两天后出现在盘子上，并在发芽七天后散布在盘子上（补充图1）。
不同种子基因型交叉污染的评价
为了检查使用单个无菌移液器吸头处理不同的种子样品是否会导致交叉污染并评估这种交叉污染的量，在灭菌过程中交替使用两种不同基因型的种子（Col-0野生型，对卡那霉素敏感，和拟南芥转基因系AdoIspS-79，耐卡那霉素24）。在标准种子灭菌后，将它们播种在半强度MS固体板中，补充或补充50mg / L卡那霉素。实验被重复了五次。这些分析表明，大约96%的种子在含有卡那霉素的MS板中发芽，但在发芽的第 7天，在用Col-0基因型播种的任何板中都没有观察到绿色子叶（图5）。同时，在MS板中播种的Col-0种子显示出约94%的发芽率，并且所有子叶在发芽7天后都是绿色的。这些结果表明，尽管使用单个移液器吸头去除无菌溶液，但样品之间没有残留污染物。
图3：拟南芥种子播种2天、3天、4天和7天后的种子萌发百分比，用不同的字母表示不同的灭菌时间。 a：3分钟70%乙醇和3分钟5%漂白剂，b：10分钟70%乙醇和7.5分钟5%漂白剂，c：20分钟70%乙醇和15分钟5%漂白剂，d：30分钟70%乙醇和22.5分钟5%漂白剂，e：40分钟70%乙醇和30分钟5%漂白剂， f：50分钟70%乙醇和37.5分钟5%漂白剂，g：70分钟70%乙醇和52.5分钟5%漂白剂。根据Tukey的成对测试，两颗星表示显着差异（p <0.01）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：拟南芥种子播种7天后的绿色子叶百分比，不同灭菌时间用不同的字母表示。 a：3分钟70%乙醇和3分钟5%漂白剂，b：10分钟70%乙醇和7.5分钟5%漂白剂，c：20分钟70%乙醇和15分钟5%漂白剂，d：30分钟70%乙醇和22.5分钟5%漂白剂，e：40分钟70%乙醇和30分钟5%漂白剂， f：50分钟70%乙醇和37.5分钟5%漂白剂，g：70分钟70%乙醇和52.5分钟5%漂白剂。根据Tukey的成对测试，两颗星表示显着差异（p <0.01）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：Col-0野生型和AdoIspS-79种子之间的交叉污染测定。 Col-0在半强度MS板中发芽（左），Col-0在补充50mg / L卡那霉素（中）的半强度MS板中萌发，在补充了50mg / L卡那霉素（右）的半强度MS板中发芽，Scalebar = 1 cm。图中显示了五个重复之一的代表性图像。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 程序 | 当前协议（最小值） | 传统移液（分钟） |
| 添加液体 1 | 12 | 24 |
| 去除液体 1 | 6 | 48 |
| 总 | 18 | 72 |
表1：96个种子样品灭菌期间液体处理所需最短时间的摘要。 该表列出了使用当前方案和使用传统移液的方案在种子表面灭菌的主要步骤中添加和除去液体所需的总时间（分钟）。
补充图1：拟南芥种子播种7天后的污染物检测。 该图像显示了非无菌种子（用水冲洗;左）和无菌种子（如正文所述，经表面灭菌;右）的污染程度。比例尺 = 1 厘米。 请单击此处下载此文件。
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Discussion
种子灭菌是拟南芥功能研究的基本步骤。虽然它经常用于许多不同的目的，但对拟南芥高通量种子表面灭菌的研究有限。
到目前为止，吞吐量最高的方法之一是使用漂白剂与浓缩HCl混合产生的氯气。虽然这种方法需要有限的动手时间，但它使用的气体对人类有剧毒27.此外，必须仔细控制要进行表面灭菌的种子数量和表面种子灭菌的持续时间。如果种子太多，氯气的剂量将不足以完全杀死种皮上存在的微生物，从而导致种子批次的广泛污染。另一方面，如果表面灭菌的持续时间太长，种子将被杀死。因此，尽管有一些优点，但熏蒸并不是拟南芥中种子表面灭菌的首选方法。
相比之下，有许多基于液体的拟南芥种子表面灭菌的方法有28、29、30种。然而，这些方法的主要局限性是它们可以专门用于少量样品，并且它们没有针对通量进行优化。据我们所知，关于拟南芥种子高通量表面灭菌的唯一研究是由Lindsey，B.E.等人描述的31。在这项研究中，作者提出了两种不同的方法。除了上面提到的一种氯气方法外，作者还提出了一种基于液体的表面灭菌方法，使用浓缩漂白剂溶液进行5-10分钟的灭菌。虽然该方法首次对不同浓度漂白剂的表面种子灭菌进行了系统研究，并分析了相应的输出，但方案仍有待改进。首先，这种方法使用了高浓度的漂白剂，这可能对操作人员和环境有害。其次，由于利用高浓度漂白剂，最佳的种子表面灭菌时间仅在5-10分钟之间，从而为方案的完成提供了狭窄的时间窗口。此外，为了消除漂白剂，许多洗涤步骤是必要的，这使得该协议既耗时又费力，并限制了表面灭菌步骤如此短时间范围内的通量。
为了克服所有这些限制并结合先前工作的最佳方面，这里描述的方法使用70%的技术乙醇进行，然后使用低百分比的漂白剂（5%）进行进一步的步骤，从而降低了毒性和劳动密集型洗涤步骤。此外，对种子发芽的系统分析为种子表面灭菌提供了3-30分钟的更宽时间范围，而不会影响发芽率。这样可以更灵活地组织工作流程，允许根据并行工作调节表面灭菌时间。更重要的是，劳动密集型移液程序被多次分配替换为使用血清学移液器添加液体，最重要的是，通过非常快速的抽吸方法，并由简单但高性能的自制抽吸装置辅助，不需要样品之间的吸头交换。鉴于储液瓶的存在，实验没有观察到品系之间的交叉污染，因为可能无意中用移液器吸头渴望的种子被倒入瓶中。专门选择用作无菌尖端和管道之间的适配器的阀门，以确保液体被吸入收集瓶而不会流回装有种子的管中。因此，该方法大大改进了种子表面的灭菌程序，易于处理且节省时间。
总之，该协议为科学界提供了一种安全，高度时间灵活，低劳动力和省时的拟南芥种子表面灭菌方法，该方法价格低廉且易于在任何实验室中设置。此外，该方法还可以应用于任何其他类型的小种子的表面灭菌，最终根据种子尺寸改变无菌尖端，适配器和管道。特别是，该方法未经修饰即可成功用于几种芸苔科物种（例如，Cardamine impatiens L.，Berteroa incana （L.） DC.，Capsella bursa-pastoris （L.） Medicus，Alliaria petiolata （M. Bieberstein） Cavara et Grande等），以及Nicotiana benthamiana Domin和Nicotiana tabacum。 L.种子。该方法还可以应用于更小的种子，如兰花的种子，只要可以精确测定离心的速度/时间和表面灭菌处理的长度32。
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Disclosures
所有作者均声明无利益冲突。
Acknowledgments
这项研究由特伦托自治省通过E. Mach基金会生态基因组学小组的核心资金资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquarium valve | Amazon | B074CYC5SD | Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip |
| Arabidopsis Col-0 wild-type seeds | Nottingham Arabidopsis Stock Center | N1093 | Wild type seeds (sensitive to kanamycin) |
| Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds | NA | NA | Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599). Available on request from the authors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP022628188 | Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds |
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa | M0222 | Standard medium for plant sterile culture |
| Pipette controller | Brand | 26300 | Used to operate the serological pipette |
| Polyethylene tube 1 | Roth | 9591.1 | Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm) |
| Polyethylene tube 2 | Roth | 9587.1 | Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm) |
| Screw cap with connectors | Roth | PY86.1 | 2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle |
| Serological pipette | Brand | 27823 | Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead |
| Shakeret al. | Qiagen | 85300 | TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker. |
| Technical ethanol | ITW Reagents (Nova Chimica Srl) | 212800 | Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade |
| Tween 20 | Merck Millipore | 655205 | Non-ionic detergent acting as surfactant |
| Universal tubing connectors | Roth | Y523.1 | Can be used to improve/simplify tubing connections |
| Vacuum pump | Merck Millipore | WP6222050 | Used for making the suction device |
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