Summary
Ett protokoll med hög genomströmning för ytsterilisering av Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) frön tillhandahålls, vilket optimerar vätskehanteringsstegen med en enkel suganordning konstruerad med en vakuumpump. Hundratals fröprover kan ytsteriliseras på en dag.
Abstract
Arabidopsis är den överlägset växtmodellart som används mest för funktionella studier. Ytsteriliseringen av Arabidopsisfrön är ett grundläggande steg som krävs mot detta ändamål. Därför är det av största vikt att fastställa arabidopsislindsteriliseringsmetoder med hög genomströmning för att hantera tiotals till hundratals prover (t.ex. transgena linjer, ekotyper eller mutanter) på en gång. En steriliseringsmetod för fröytan baserad på effektiv eliminering av vätska i rör med en hemlagad suganordning konstruerad från en gemensam vakuumpump presenteras i denna studie. Genom att dramatiskt minska arbetsintensiv praktisk tid med denna metod är det möjligt att hantera flera hundra prover på en dag med liten ansträngning. Seriens tidskursanalyser visade vidare ett mycket flexibelt tidsintervall för ytsterilisering genom att upprätthålla höga spiringshastigheter. Denna metod kan enkelt anpassas för ytsterilisering av andra typer av små frön med enkel anpassning av suganordningen enligt fröstorleken och den hastighet som önskas för att eliminera vätskan.
Introduction
Arabidopsis är en diploid växtart som tillhör familjen Brassicaceae. Dess relativt korta livscykel (två månader per generation under långa växtförhållanden), liten växtstorlek och självbestämning med produktion av hundratals frön per växt har gjort det till den första grundläggande växtmodellarten1,2. Dessutom var dess genom heltsekvenserade 3, omfattande omvända genetikverktyg (mättat T-DNA, transposon och kemiskt mutageniserade populationer) finns tillgängliga4,5,6,och effektiv Agrobacterium-medieradomvandling är väletablerad för att erhålla tillräckliga transgena linjer för ytterligare nedströmsarbete7 . Således har stora framsteg gjorts under de senaste två decennierna med arabidopsis som modellart för att dissekera olika aspekter av växtbiologi på molekylär nivå, inklusive naturlig, genetisk och fenotypisk variation8,9.
För att funktionellt karakterisera gener av intresse för arabidopsis är sådd ytsterilisering för att eliminera svamp- och bakterieföroreningar det nödvändiga steget för många nedströmsprotokoll som kräver yxkulturer. Genetisk omvandling för överuttryck10, knock-down (RNA-I11) eller knock-out (genomredigering12,13) av genfunktion, subcellulärlokalisering 14, promotoraktivitet15,16, proteinprotein17 och protein-DNA-interaktion18, för att citera endast de vanligaste applikationerna, alla kräver en fröyta sterilisering steg. Således, trots sin relativa enkelhet, spelar fröytan sterilisering en grundläggande roll i många funktionella analyser.
Hittills har två huvudkategorier av steriliseringsmetoder för fröytor utvecklats baserat antingen på gas- eller vätskefassterilisering19. Medan genomströmningen av gasfasfröytan sterilisering är medelhög till hög, har användningen av den farliga reagensklorgasen som ytsteriliseringsmedel hindrat dess breda tillämpning. Metoder baserade på sterilisering i vätskefas förlitar sig tvärtom på mildare kemikalier som etanol och blekmedelslösningar för ytsterilisering, och de används mer i stor utsträckning trots att de har en i sig lägre genomströmning än klorrorkomigation. I allmänhet används ofta två olika metoder som använder flytande reagenser. En metod som till stor del används är baserad på tvättning med etanol och blekmedel vid olika koncentrationer under olikatidsperioder 20,21. En annan metod är baserad på applicering av blekmedel endast21,22. Båda metoderna tillämpas främst för småskalig sterilisering av fröytan. Men i många experiment är det nödvändigt att screena många Arabidopsis transgena linjer som härrör från en omvandling15,23 eller skärm parallellt många transgena linjer som genereras från olika omvandlingar24,25. Såvitt vi vet har ingen vätskebaserad metod för hög genomströmning frö yta sterilisering publicerats, vilket utgör, även om föga erkända, en viktig flaskhals för funktionella genomik metoder. Därför är utveckling av säkra, robusta och höggenomströmningsmetoder för sterilisering av fröytan ett nödvändigt och kritiskt steg mot framgången för den funktionella karakteriseringen av många gener samtidigt.
För detta ändamål presenteras i den aktuella studien en förbättrad metod för ytsterilisering av Arabidopsisfrön. Denna metod är säker, låg kostnad, mycket robust och hög genomströmning, vilket möjliggör hantering av 96 oberoende linjer inom en timme från början av fröytan sterilisering till slutet av frösådd i Petri-rätter. Metoden som demonstreras bygger på allmänt tillgänglig, grundläggande laboratorieinstrumentering som en vakuumpump, förbrukningsglas och plastvaror. Denna förbättrade metod ger forskarsamhället ett säkert, enkelt och prisvärt tillvägagångssätt för att effektivisera sterilisering av fröytan med en genomströmning som är tillräcklig för moderna funktionella genomikmetoder i Arabidopsis och andra icke-modell växtarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reagenser och medieförberedelser
- Förbered 70% etanollösning: Tillsätt 737 ml 95% teknisk etanol till 263 ml destillerat vatten. Blanda ordentligt.
OBS: Förbered 70% etanollösning på en icke-steril arbetsbänk.
VARNING: Etanol är mycket brandfarligt och kan orsaka allvarlig irritation i ögonen. Håll dig borta från lågor och värmekällor. Vid kontakt med ögonen, skölj med rikligt med vatten. - Förbered 5% blekmedelslösning: Tillsätt 5 ml hushållsblekmedel (innehållande ~3,5% natriumhypoklorit, NaClO) till 95 ml sterilt destillerat vatten. Tillsätt några droppar icke-joniskt tvättmedel (t.ex. Interpolering 20) och blanda noggrant.
OBS: Förbered 5% blekmedelslösning inuti laminärhuven.
VARNING: Natriumhypoklorit, den aktiva komponenten i blekmedel, är mycket irriterande. Det är mycket frätande och kan orsaka allvarliga skador på mag-tarmkanalen. Vid kontakt, skölj omedelbart med rikligt med vatten. Vid förtäring, ring giftkontrollcentralen eller en läkare för behandlingsråd. - Förbered halvhållfasta Murashige och Skoog (1/2 MS) medium26.
- Tillsätt 2,2 g MS-medelpulver (inklusive vitaminer) och 10 g sackaros i 800 ml destillerat vatten. Justera lösningens pH-pH med 1 M KOH och få upp volymen till 1 L med destillerat vatten. Aliquot 500 ml i en 1 L flaska och tillsätt 4 g agar för att förbereda ett fast medium. Autoklavera lösningen.
- Efter autoklavering, kyl ner mediet till 50-53 °C i ett vattenbad och häll det i Petri-diskar under laminär flödeshuv. För att bereda det selektiva mediet tillsätt 1000 μL/L av 50 mg/ml kanamycinbuljonglösning (blanda 500 mg Kanamycinsulfatmonhydrat i 10 ml destillerat vatten, filtrera sterilisera och förvara vid -20 °C) till mediet (50-53 °C). Blanda väl genom att virvla och häll i Petri-rätter som nämnts tidigare.
2. Aspirator setup
Obs: Instrumentinställningen sammanfattas i figur 1.
- Anslut vakuumpumpens inlopp till ena änden av ett pe-rör av lämplig storlek. Anslut den andra änden av röret till utloppet på tvåvägslocket på dekantantationsflaskan. Linda slangens korsning tätt med en tätningsfilm(Materialbord)för att säkerställa lufttät anslutning.
- Anslut ett andra PE-rör till inloppet (hålet som sticker ut på insidan av flaskan) i skruvkapslar på dekantationsflaskan. Montera den andra sidan av röret till utloppet av en akvarieventil. Om det behövs, linda med en tätningsfilm längs korsningen för att eliminera luftläckage.
- Strax före användning, montera en steril 200 μL pipettspets till akvariefiltrets inlopp under den laminära flödeshuven.
Bild 1: Schematisk ritning av suganordningen för avlägsnande av steriliseringsvätskor med hög genomströmning. För tydlighetens skull dras inte de enskilda delarna till skala. BokstavenA) anger vakuumpumpen,b) reservoarflaskan för att samla upp vätskor (etanol, blekmedel eller sterilt vatten),c) ventilen för att undvika återflöde av vätskorna,( D) den sterila 200 μL pipettspetsen och (E) 1,5 mL mikrocentrifugerör som innehåller frön och steriliseringsvätska. Pilar anger luftflödets riktning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
3. Sterilisering av frön med hög genomströmningsvätska
OBS: Det övergripande förfarandet och den minimala tid som krävs för ytsterilisering av Arabidopsis thaliana (L.) Heynh wild-type (Col-0) (Arabidopsis) frön med 96 oberoende prover sammanfattas i figur 2.
- Etikett med en permanent markör två partier av 48 x 1,5 ml mikrocentrifugerör med progressiva tal.
- Tillsätt 100-200 Arabidopsisfrön till var och en av de 96 sterila 1,5 ml mikrocentrifugerören (ungefär 1-2 mm ovanför botten av rörets koniska ände).
- Aliquot cirka 1000 μL 70% etanol i varje rör med en 10 ml steril serologisk pipett inuti laminär flödeshuv (frösats ett, 48 rör) och stäng försiktigt locken.
OBS: Dispensering av lösningarna behöver inte vara extremt exakt, så länge den dispenserade volymen är flera gånger högre än volymen av frön. Alternativt kan du utföra detta steg utanför laminärhuven (icke-sterilt tillstånd). - Skaka rören med en svängningsfrekvens på 8,0 Hz i minst 3 minuter i en shaker.
- Ta bort adaptrarna från skakapparaten och överför dem till korgen på en bänkskiva microcentrifuge.
- Snurra snabbt ner fröna med hjälp av pulsfunktionen (som finns i de flesta bänkcentrifuger) för att nå 1880 x g (~ 15 s).
OBS: Längre tid eller högre centrifugeringskrafter påverkar frösprutningen negativt. - Överför de 48 rören från adaptrarna till ett rack och öppna alla rör under den laminära flödeshuven. Undvik föroreningar genom att inte vidröra den del av locken som är insatt i rören. Om locken är för nära varandra, dela upp rören i två rack för enklare hantering.
- Montera en steril 200 μL gul spets på akvarieventilinloppet på den hemlagade aspiratorn under den laminära flödeshuven och slå på pumpen.
- Sätt in den gula spetsen strax ovanför frönas nivå för att undvika att röra fröna när du suger vätskan. Alternativt kan du snabbt placera spetsen längst ner på röret; Om ett frö blockerar vätskans sug, eliminera den gula spetsen och sätt in en ny.
- Aliquot i varje rör cirka 1000 μL 5% blekmedel med en 10 ml steril serologisk pipett inuti laminär flödeshuv.
- Stäng alla lock ordentligt och sätt tillbaka alla rör i skakadaptern. Skaka rören med en svängningsfrekvens på 8,0 Hz i minst 3 minuter i skakapparaten.
- Snurra snabbt ner fröna med hjälp av pulsfunktionen hos bänkcentrifugen under den tid som krävs för att nå 1880 x g (~ 15 s).
- Montera en ny steril 200 μL gul spets på akvarieventilen som är ansluten till vakuumpumpen under den laminära flödeshuven och slå på pumpen.
- Sätt in den gula spetsen ovanför frönas nivå för att undvika att röra fröna när du suger blekmedelslösningen.
- Aliquot i varje rör cirka 1000 μL steriliserad H2O med en 10 ml steril serologisk pipett i laminär flödeshuv.
OBS: Kombinera de två satserna av frön för att minimera driftstiden. - Montera en ny steril 200 μL gul spets på akvarieventilen som är ansluten till vakuumpumpen under laminärflödeshuv och slå på pumpen.
- Sätt i den gula spetsen strax ovanför frönas nivå för att undvika att röra fröna när du suger H2O.
- Aliquot i varje rör cirka 500 μL steriliserad H2O med en 10 ml steril serologisk pipett och stäng alla lock i laminärflödeshuv. Fröna är redo att sås. Håll vid behov rören i rumstemperatur i högst några timmar eller vid 4 °C över natten.
- Fyll reservoarflaskan som används för att samla vätska med en tillräcklig mängd vatten och autoklavera den. Kassera sedan vätskan i en vanlig diskbänk.
OBS: Autoklav vätskan för att döda alla frön inuti behållaren.
Figur 2: Översikt över förfarandet och den minimala tid som krävs för ytsterilisering av arabidopsisfrön med 96 oberoende prover. I det presenterade experimentet hanteras 96 oberoende prover i två lika stora partier. Hela proceduren är densamma för båda batcharna, och de bearbetas parallellt, men batch två bearbetas med ett stegfördröjning jämfört med batch ett. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
4. Plätering och poängsättning av Arabidopsis på 1/2 MS-plattor
- Överför fröna och 300-400 μL steril H2O till en Petriskål genom skonsam pipettering med en pipett på 1000 μL.
- Efter överföring av 10 rör, häll i varje tallrik runt 1,5-2,0 ml smält 1/2 MS-medium utan antibiotika.
OBS: Smält i förväg och håll sedan det 1/2 MS smälta mediet i ett termostatbad inställt på 50-53 °C för att undvika stelning. Se till att temperaturen inte överstiger 58 °C för att undvika att frönas grobarhet minskar. - Virvla snabbt plattan för att fördela fröna inuti den. Tejpa plattorna på motsatta sidor.
- Linda plattorna i en plast- eller aluminiumfolie och placera dem sedan i ett kylskåp (4 °C) i 3 dagar i mörkret för att få enhetlig spiring.
- Överför plattorna till en tillväxtkammare som är inställd på 23 °C under långdagsförhållanden (16 h ljus/8 h mörk) med en ljusintensitet på 100-120 μmol·m-2·s-1 och 60% relativ luftfuktighet.
- Efter två dagar, poäng växterna genom närvaron av radicles. Upptäck radikel uppkomsten och grön cotyledon bildas (full öppning av de två cotyledons) för att utvärdera fröspiring.
5. Statistiska analyser
OBS: Här användes Tukeys parvisstest för statistiska analyser.
- Betrakta P-värdena under 0,01 som statistiskt signifikanta. Utför alla experiment minst med fem biologiska replikat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att bedöma den tid som krävs för hela steriliseringsförfarandet för utsäde beräknades tidsskillnaderna för vätskehantering 96 prover i det nuvarande protokollet och jämfördes med traditionella pipetteringsmetoder. Resultatet indikerar att det aktuella protokollet sparar tid, vilket minskar vätskehanteringstiden till en fjärdedel av det med de traditionella protokollen(tabell 1). Tabellen belyser vidare att vätskeborttagningstiden i det nuvarande protokollet sparar mer tid än de traditionella metoderna, med en övergripande åttafaldig minskning.
Val av tidsintervall för frösterilisering
Längre steriliseringssteg minimerar föroreningshastigheten men kan påverka fröspiring negativt. För att bestämma det bästa tidsintervallet för frösterilisering med de högsta spiringshastigheterna utan förorening testades olika varaktigheter av varje steriliseringssteg, bedömning av både fröspiring och grön cotyledon uppkomst. De spiring analyser som utförts från dag 2 till dag 4 och på dag 7 anges inga signifikanta skillnader mellan tidsintervallet från 10 min till 40 min av 70% etanol sterilisering. Från 40 minuters behandling med 70 % etanol minskade dock spiringsgraden (figur 3). På motsvarande sätt minskade den gröna cotyledon-uppkomsten (figur 4). Eftersom kortare steriliseringstider kan öka genomströmningen men öka föroreningshastigheten bedömdes den minimala tid som krävs för att sterilisera 96 olika fröprover i två partier om 48 prover. Dessutom, med tanke på den föredragna inställningen med skakningar som utförs i en shaker, testade vi den minimala tid som behövs för frösterilisering genom att hantera 96 prover i två partier med 48 prover vardera. Den minimala tid som krävdes för att hantera 48 prover samtidigt var 3 min, vilket gjorde det möjligt att bearbeta den andra uppsättningen med 48 prover omedelbart efter den första uppsättningen utan väntetid. Således applicerades 3 min för 70% etanol och 3 min för 5% blekmedel som minsta tid för att sterilisera fröna (punkt a) i figur 3). Dessa analyser resulterade i spiringshastigheter som liknar de högsta utan förorening och förlust av frö vitalitet(figur 3).
Sammanfattningsvis är de lämpliga tidsintervallen för att bibehålla den högsta andelen frösprutning utan förorening som härrör från tillräcklig eliminering av mikroorganismer mellan 3-30 min för 70% etanol och mellan 3-22,5 min för 5% blekmedel.
För att visa att de frön vi använde ursprungligen var förorenade med mikroorganismer såddes de icke-sterila fröna direkt på MS-plattor. Svampar uppträdde på plattorna efter två dagars sådd och spreds över plattorna efter sju dagars spiring(Kompletterande figur 1).
Utvärdering av korskontaminering mellan olika genotyper av frön
För att kontrollera om användningen av en enda steril pipettspets för att bearbeta olika fröprover kan leda till korskontaminering och för att bedöma mängden sådan korskontaminering, alternerades två olika genotyper av frön (Col-0 wild-type, känsliga för kanamycin och Arabidopsis transgena linjen AdoIspS-79, resistenta mot kanamycin24)under steriliseringsförfarandet. Efter standard utsäde sterilisering, de såddes i halv styrka MS fasta plattor kompletteras utan eller med 50 mg/L kanamycin. Experimenten replikerades fem gånger. Dessa analyser visade att omkring 96% av fröna groddar i MS-plattor som innehåller kanamycin, men inga gröna cotyledons observerades den7: e dagen av spiring i några plattor som sås med Col-0 genotyp (figur 5). Parallellt visade Col-0 frön sådda i MS plattor cirka 94% spiring, och alla cotyledons var gröna efter 7-dagars spiring. Dessa resultat indikerar ingen överföring av kontaminering mellan proverna trots att man använder en enda pipettspets för att avlägsna den sterila lösningen.
Figur 3: Frösprutningsprocent efter 2-, 3-, 4- och 7-dagars Arabidopsis frösådd med olika steriliseringstider indikerade med olika bokstäver. a: 3 min 70% etanol och 3 min av 5% blekmedel, b: 10 min 70% etanol och 7,5 min 5% blekmedel, c: 20 min av 70% etanol och 15 min av 5% blekmedel, d: 30 min 70% etanol och 22,5 min blekmedel, e: 40 min av 70% etanol och 30% etanol och 30% blekmedel f: 50 min 70% etanol och 37,5 min 5% blekmedel, g: 70 min 70% etanol och 52,5 min 5% blekmedel. Två stjärnor indikerar signifikanta skillnader enligt Tukeys partest (s < 0,01). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Grön cotyledon procent efter 7-dagars Arabidopsis frö sådd med olika steriliseringstider anges med olika bokstäver. a: 3 min 70% etanol och 3 min av 5% blekmedel, b: 10 min 70% etanol och 7,5 min 5% blekmedel, c: 20 min av 70% etanol och 15 min av 5% blekmedel, d: 30 min 70% etanol och 22,5 min blekmedel, e: 40 min av 70% etanol och 30% etanol och 30% blekmedel f: 50 min 70% etanol och 37,5 min 5% blekmedel, g: 70 min 70% etanol och 52,5 min 5% blekmedel. Två stjärnor indikerar signifikanta skillnader enligt Tukeys partest (s < 0,01). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Korskontamineringsanalys mellan Col-0-frön av vildtyp och AdoIspS-79. Col-0 spiring i halv styrka MS plattor (vänster), Col-0 i halv styrka MS-platta kompletteras med 50 mg/L kanamycin (mitten) och AdoIspS-79 i halv styrka MS-platta kompletterad med 50 mg/L kanamycin (höger), skalor = 1 cm. En representativ bild av en av de fem replikaten visas i figuren. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Procedur | Aktuellt protokoll (min) | Traditionell pipettering (min) |
| Tillsats av vätska 1 | 12 | 24 |
| Ta bort vätska 1 | 6 | 48 |
| TOTAL | 18 | 72 |
Tabell 1: Sammanfattning av den minimala tid som krävs för vätskehantering under sterilisering av 96 fröprover. Tabellen visar den totala tid (min) som krävs för att tillsätta och avlägsna vätskan under de viktigaste stegen för sterilisering av fröytan med hjälp av det aktuella protokollet och ett protokoll där traditionell pipettering används.
Kompletterande figur 1: Kontamineringsdetektering efter 7-dagars Arabidopsis frösådd. Bilden visar graden av förorening av icke-sterila frön (sköljda med vatten; vänster) och sterila frön (utsätts för ytsterilisering enligt beskrivningen i huvudtexten; höger). Scalebar = 1 cm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sterilisering av frön är det grundläggande steget för funktionella studier i arabidopsis. Även om det ofta utförs för många olika ändamål, finns begränsade studier om hög genomströmning utsäde ytan sterilisering i Arabidopsis tillgängliga.
Hittills använder en av metoderna med högsta genomströmning klorgas som genereras genom att blanda blekmedel med koncentrerad HCl. Även om denna metod kräver begränsad praktisk tid, använder den en gas som är mycket giftig för människor27. Dessutom måste antalet frön som ska ytsteriliseras och varaktigheten av ytfrösterilisering kontrolleras noggrant. Om fröna är för många skulle dosen av klorgas inte vara tillräcklig för att helt döda mikroorganismerna som finns på fröskiktet, vilket resulterar i utbredd förorening av fröpartierna. Å andra sidan, om varaktigheten av ytsterilisering är för lång, kommer fröna att dödas. Således, trots vissa fördelar, är rökning inte favoritmetoden för fröytan sterilisering i Arabidopsis.
Däremot finns det ett antal vätskebaserade metoder för ytsterilisering av Arabidopsisfrön tillgängliga28,29,30. Den största begränsningen av dessa metoder är dock att de kan användas uteslutande för ett lågt antal prover, och de är inte optimerade för data flöde. Såvitt vi vet beskrevs den enda studien om ytsterilisering av arabidopsisfrön av Lindsey, B. E. et al.31. I denna studie föreslog författarna två olika metoder. Förutom ett tillvägagångssätt med klorgas som nämns ovan föreslog författarna en vätskebaserad ytsteriliseringsmetod med hjälp av en koncentrerad blekmedelslösning som appliceras för 5-10 min sterilisering. Även om denna metod gav den första systematiska studien för ytfrösterilisering med olika koncentrationer av blekmedel för olika tider och analyserade motsvarande utdata, kunde protokollet fortfarande förbättras. Först och främst använde denna metod högkoncentrerad blekmedel, vilket kan vara skadligt för operatören och miljön. För det andra, på grund av användningen av högkoncentrerad blekmedel, är den bästa fröytan steriliseringstidpunkten endast mellan 5-10 min, vilket ger ett smalt tidsfönster för slutförandet av protokollet. Dessutom, för att eliminera blekmedlet, var många tvättsteg nödvändiga, vilket gjorde protokollet både tids- och arbetsintensivt och begränsade genomströmningen på så kort tid i ytsteriliseringssteget.
För att övervinna alla dessa begränsningar och kombinera de bästa aspekterna av tidigare arbeten utfördes metoden som beskrivs här med 70% teknisk etanol följt av ytterligare ett steg med en låg andel blekmedel (5%) vilket minskade toxiciteten och de arbetsintensiva tvättstegen. Dessutom gav de systematiska analyserna av frösprutning ett bredare tidsintervall mellan 3-30 min för sterilisering av fröytan utan att påverka spiringshastigheten. Detta ger högre flexibilitet att organisera arbetsflödet, vilket gör det möjligt att reglera ytsteriliseringstiden enligt samtidigt arbete. Ännu viktigare var att den arbetsintensiva pipetteringproceduren ersattes av flera dispensering med en serologisk pipetter för tillsats av vätskorna och, viktigast av allt, av en mycket snabb aspirationsmetod assisterad av en enkel men utförd hemlagad suganordning som inte kräver spetsutbyte mellan prover. Med tanke på närvaron av en reservoarflaska observerades ingen korskontaminering mellan linjer experimentellt, eftersom frön som oavsiktligt kan aspirera med pipettspetsen dekanteras i flaskan. Ventilen som används som adapter mellan den sterila spetsen och slangen valdes specifikt för att garantera att vätskan aspireras in i uppsamlingsflaskan utan att flöda tillbaka till röret som innehåller frön. Således förbättrade denna metod dramatiskt steriliseringsproceduren för fröytan med enkel hantering och tidsbesparing.
Sammanfattningsvis ger detta protokoll det vetenskapliga samfundet ett säkert, mycket tid flexibelt, lågarbete och tidsbesparande tillvägagångssätt för ytsterilisering av Arabidopsisfrön, vilket är billigt och enkelt att ställa in i alla labb. Dessutom kan metoden också tillämpas på ytsterilisering av någon annan typ av små frön genom att så småningom ändra den sterila spetsen, adaptern och slangen enligt fröstorlekarna. I synnerhet användes denna metod framgångsrikt utan modifiering för flera Brassicaceae-arter (t.ex. Cardamine impatiens L., Berteroa incana (L.) DC., Capsella bursa-pastoris (L.) Medicus, Alliaria petiolata (M. Bieberstein) Cavara et Grande, etc.), liksom för Nicotiana benthamiana Domin och Nicotiana tabacumcum L. frön. Metoden kan också tillämpas på ännu mindre frön, som orkidéer, så länge som exakt bestämning av centrifugeringshastighet / tid för centrifugering och längden på ytsteriliseringsbehandling kan fastställas32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av den autonoma provinsen Trento genom kärnfinansiering av Ecogenomics-gruppen Fondazione E. Mach.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquarium valve | Amazon | B074CYC5SD | Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip |
| Arabidopsis Col-0 wild-type seeds | Nottingham Arabidopsis Stock Center | N1093 | Wild type seeds (sensitive to kanamycin) |
| Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds | NA | NA | Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599). Available on request from the authors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP022628188 | Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds |
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa | M0222 | Standard medium for plant sterile culture |
| Pipette controller | Brand | 26300 | Used to operate the serological pipette |
| Polyethylene tube 1 | Roth | 9591.1 | Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm) |
| Polyethylene tube 2 | Roth | 9587.1 | Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm) |
| Screw cap with connectors | Roth | PY86.1 | 2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle |
| Serological pipette | Brand | 27823 | Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead |
| Shakeret al. | Qiagen | 85300 | TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker. |
| Technical ethanol | ITW Reagents (Nova Chimica Srl) | 212800 | Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade |
| Tween 20 | Merck Millipore | 655205 | Non-ionic detergent acting as surfactant |
| Universal tubing connectors | Roth | Y523.1 | Can be used to improve/simplify tubing connections |
| Vacuum pump | Merck Millipore | WP6222050 | Used for making the suction device |
References
- Somerville, C., Koornneef, M. A fortunate choice: The history of Arabidopsis as a model plant. Nature Reviews Genetics. 3 (11), 883-889 (2002).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
- Initiative, T. A. G. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).
- Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell. 11 (12), 2283-2290 (1999).
- Speulman, E., et al. A two-component enhancer-inhibitor transposon mutagenesis system for functional analysis of the arabidopsis genome. Plant Cell. 11 (10), 1853-1866 (1999).
- Jander, G., et al. Ethylmethanesulfonate saturation mutagenesis in Arabidopsis to determine frequency of herbicide resistance. Plant Physiology. 131 (1), 139-146 (2003).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. -S., Niu, Q. -W., Chua, N. -H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Togninalli, M., et al. AraPheno and the AraGWAS catalog 2020: A major database update including RNA-Seq and knock-out mutation data for Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Research. 48 (1), 1063-1068 (2020).
- Lan, Y., et al. AtMAD: Arabidopsis thaliana multi-omics association database. Nucleic Acids Research. 49 (1), 1445-1451 (2021).
- Xu, J., Trainotti, L., Li, M., Varotto, C. Overexpression of isoprene synthase affects ABA-and drought-related gene expression and enhances tolerance to abiotic stress. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-21 (2020).
- Czarnecki, O., et al. Simultaneous knock-down of six non-family genes using a single synthetic RNAi fragment in Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 12 (1), 1-11 (2016).
- Yan, L., et al. high-efficiency genome editing in arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system. Molecular Plant. 8 (12), 1820-1823 (2015).
- Liu, Y., Gao, Y., Gao, Y., Zhang, Q. Targeted deletion of floral development genes in Arabidopsis with CRISPR/Cas9 using the RNA endoribonuclease Csy4 processing system. Horticulture Research. 6 (1), (2019).
- Grefen, C., et al. Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor family members. Molecular Plant. 1 (2), 308-320 (2008).
- Gazzani, S., et al.
- Lee, S., Korban, S. S. Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase (AtPCS1) by cadmium during early stages of plant development. Planta. 215 (4), 689-693 (2002).
- Long, Y., et al. In vivo FRET-FLIM reveals cell-type-specific protein interactions in Arabidopsis roots. Nature. 548 (7665), 97-102 (2017).
- Freire-Rios, A., et al. Architecture of DNA elements mediating ARF transcription factor binding and auxin-responsive gene expression in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24557-24566 (2020).
- Rivero, L., et al. Handling arabidopsis plants: Growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in Molecular Biology. 1062, 3-25 (2014).
- Chen, J. H., et al. Drought and salt stress tolerance of an arabidopsis glutathione S-transferase U17 knock-out mutant are attributed to the combined effect of glutathione and abscisic acid. Plant Physiology. 158 (1), 340-351 (2012).
- Li, D. Z., et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (49), 19641-19646 (2011).
- Mathur, J., Koncz, C. Establishment and maintenance of cell suspension cultures. Arabidopsis Protocols. Methods in Molecular Biology. 82, Humana Press. 27-30 (1998).
- Li, M., Cappellin, L., Xu, J., Biasioli, F., Varotto, C. High-throughput screening for in planta characterization of VOC biosynthetic genes by PTR-ToF-MS. Journal of Plant Research. 133 (1), 123-131 (2020).
- Li, M., et al. In planta recapitulation of isoprene synthase evolution from ocimene synthases. Molecular Biology and Evolution. 34 (10), 2583-2599 (2017).
- Li, M., et al. Evolution of isoprene emission in Arecaceae (palms). Evolutionary Applications. 14, 902-914 (2020).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
- Bent, A. Arabidopsis thaliana floral dip transformation method. Methods in Molecular Biology. 343, Clifton, N.J. 87-104 (2006).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Tkacz, A., Cheema, J., Chandra, G., Grant, A., Poole, P. S. Stability and succession of the rhizosphere microbiota depends upon plant type and soil composition. ISME Journal. 9 (11), 2349-2359 (2015).
- Singh, N., Gaddam, S. R., Singh, D., Trivedi, P. K. Regulation of arsenic stress response by ethylene biosynthesis and signaling in Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 185, 104408 (2021).
- Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized method for high-throughput sterilization of Arabidopsis seeds. Journal of Visualized Experiments: JOVE. (128), e56587 (2017).
- Acemi, A., Özen, F. Optimization of in vitro asymbiotic seed germination protocol for Serapias vomeracea. The EuroBiotech Journal. 3 (3), 143-151 (2019).
