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Artigo de método

Tratamento de luz infravermelha não térmica de lesão de isquemia/reperfusão e subsequente análise da diferenciação de macrófagos

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DOI:

10.3791/62908

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30 de dezembro de 2021

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1Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 2Department of Internal Medicine, Loyola University Medical Center, 3Department of Orthopedic Surgery, Medical College of Wisconsin, 4Department of Orthopedic Surgery, University of New Mexico

Neste artigo

Resumo

Descrevemos a redução da lesão de reperfusão por irradiação de 670 nm em um modelo de camundongo de isquemia e reperfusão por colocação de torniquete. Essa irradiação de 670 nm reduziu a resposta inflamatória, diminuiu o número de macrófagos pró-inflamatórios e aumentou os macrófagos protetores.

Resumo

Danos teciduais e necrose por processos inflamatórios são consequência da lesão de isquemia e reperfusão (IRI). No músculo esquelético, a isquemia reduz a capacidade energética aeróbica das células musculares, levando a alterações bioquímicas adversas e inflamação. O objetivo deste estudo é mostrar que a exposição à luz infravermelha próxima (NIR) durante um período de isquemia reduz a IRI diminuindo a necrose e a inflamação, além de diminuir o M1 pró-inflamatório e aumentar os macrófagos M2 protetores. Camundongos C57 / Bl6 foram submetidos a isquemia unilateral de membros posteriores induzida por torniquete por 3 h, seguida de reperfusão por 15 ou 30 min. Os camundongos foram divididos aleatoriamente em 3 grupos. O grupo 1 foi submetido à IRI com 30 min de reperfusão. O grupo 2 foi submetido à IRI com reperfusão de 15 minutos. Cada grupo consistiu de camundongos tratados com 50% sem NIR e 50% com NIR com exposição de 50 mW / cm2 por 5 min / 1 h após o fechamento do torniquete. O grupo 3 foi composto por animais simulados anestesiados por 3 h, omitindo o IRI.

A imagem de fluxo com doppler a laser foi realizada em todos os camundongos para confirmar isquemia e reperfusão. Os dados de fluxo foram expressos como a razão entre o membro isquêmico e o controle contralateral. Os camundongos foram eutanasiados após a reperfusão, e o quadríceps e o gastrocnêmio foram colhidos. Imunoprecipitação e western blot dos macrófagos-marcadores CD68 (M1) e CD206 (M2) foram realizados e normalizados para a expressão de CD14. A expressão dos marcadores inflamatórios CXCL1 e CXCL5 foi significativamente reduzida pelo NIR no grupo IRI. Uma diminuição significativa no CD68 e um aumento na expressão de CD206 foi observado nos animais que receberam IR e NIR. A necrose tecidual foi diminuída pelo NIR no grupo IRI, conforme visualizado pela coloração com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC). Os resultados demonstram que a exposição ao NIR reduziu o IRI e melhorou a sobrevivência do tecido. O NIR reduziu a inflamação, diminuiu o M1 pró-inflamatório e aumentou os macrófagos M2 protetores. A exposição ao NIR reduziu a inflamação e aumentou a regeneração, levando à proteção do tecido após a isquemia.

Introdução

A lesão de isquemia-reperfusão (IRI) é um desafio clínico observado após lesões vasculares e uso prolongado de torniquetes cirúrgicos. Estudos anteriores mostraram que 60-90 min é o limite superior para o tempo de isquemia quente, além do qual podem ocorrer danos irreversíveis ao tecido. Mais do que qualquer outro fator, as limitações do tempo de isquemia quente limitam o sucesso e o salvamento do reimplante de membros disvasculares 1,2.

No músculo esquelético, a isquemia reduz a capacidade aeróbia das células, levando à inflamação aguda e alterações bioquímicas adversas. Esses efeitos são agravados pela reperfusão, que estimula o recrutamento de neutrófilos e a produção de radicais livres, danificando ainda mais o músculo esquelético. Isso pode ocorrer a partir da oclusão vascular, seja resultado de lesão ou uso intencional de torniquete para evitar hemorragia. Alguns dos principais mediadores nesse processo são a mieloperoxidase (MPO), uma enzima expressa por neutrófilos que é parte integrante da função respiratória de explosão e produção de radicais livres3, e quimiocinas como CXCL1 e CXCL5 que servem para recrutar neutrófilos para locais de inflamação aguda4.

A artéria femoral não foi dissecada para mimetizar um torniquete aberto em caso de emergência. Essa abordagem também se baseia na reprodutibilidade da criação de isquemia e reperfusão, bem como em uma área livre de sangue consistente. Pesquisas anteriores demonstraram que a exposição à luz infravermelha não térmica (NIR) com comprimento de onda de 670 nm pode aumentar a colateralização vascular em um membro posterior isquêmico de camundongo com exposição NIR ao longo de dias, mitigando os efeitos do IRI5. Além disso, pesquisas anteriores demonstraram que a luz NIR pode induzir a polarização de macrófagos em fenótipos pró-inflamatórios (M1) ou pró-cicatrizadores (M2)6.

Qualquer tratamento que possa minimizar o dano tecidual e a morte celular após hipóxia e reperfusão seria benéfico para aumentar o sucesso do salvamento do membro após lesões vasculares. Portanto, o objetivo geral é melhorar o IRI introduzindo o tratamento com luz de 670 nm como uma opção viável para outras modalidades de tratamento. Este artigo baseia-se na hipótese de que a exposição à luz NIR durante um período de isquemia diminui a inflamação e a necrose tecidual, diminuindo a secreção de proteínas quimioatraentes e o influxo de células inflamatórias, induzindo os macrófagos a assumir um fenótipo M2.

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Protocolo

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (Protocolo: AUA#1517). Todas as pesquisas envolvendo camundongos foram conduzidas em conformidade com a política do PHS.

1. Colocação do torniquete

NOTA: Um torniquete foi colocado para induzir isquemia e obter um campo cirúrgico livre de sangue.

  1. Anestesiar um camundongo C57/Bl6 com isoflurano na câmara de indução a uma concentração de 3-5%.
  2. Remova o mouse da câmara de indução quando ele não responder aos beliscões dos dedos dos pés. Coloque o mouse em um cone nasal para anestesia contínua a 1,5-2% em uma almofada de aquecimento com um tapete antirreflexo abaixo de um gerador de imagens doppler a laser (LDI).
  3. Coloque o torniquete ao redor do membro posterior esquerdo (Figura 1).
    NOTA: Não feche o torniquete ainda. Meça primeiro o fluxo sanguíneo (consulte a seção 2).

2. Medição do fluxo sanguíneo por LDI

NOTA: O fluxo sanguíneo foi medido para confirmar a oclusão e reperfusão adequadas, conforme descrito anteriormente7.

  1. Coloque o mouse anestesiado abaixo do LDI (26 cm) em uma almofada de aquecimento com uma superfície não reflexiva em decúbito ventral com as pernas esticadas e as patas voltadas para cima.
  2. Capture imagens colocando o mouse dentro da área de captura do laser (16,1 cm x 16,1 cm).
    1. Ajuste o laser para uma velocidade de varredura de 4 ms/pixel. Capture imagens com o software proprietário pressionando o botão de gravação . Tire imagens antes, durante a oclusão e durante a reperfusão clicando no botão de gravação .
      NOTA: As imagens são imagens de mapas relacionadas ao fluxo; vermelho é bom fluxo sanguíneo; azul não é fluxo sanguíneo. Confirme na imagem que o membro posterior ocluído é azul. Da mesma forma, verifique a imagem para confirmar se o membro posterior previamente ocluído está vermelho na reperfusão. É imprescindível ter um tapete não refletivo para o LDI; caso contrário, o reflexo afetará as imagens.
  3. Analise as imagens com o software fornecido, definindo uma região de interesse. Estabeleça uma relação entre as pernas isquêmicas e de controle.

3. Protocolo de isquemia e reperfusão

  1. Feche o torniquete ao redor do membro posterior do camundongo anestesiado por 3 h.
    NOTA: Apertar o torniquete cria isquemia, interrompendo o fluxo sanguíneo.
  2. Abra o torniquete após 3 h de oclusão; Abra e perfunda o membro posterior por 15 ou 30 min.

4. Colheita de tecidos

  1. Aumente a anestesia para 5% de isoflurano para anestesiar profundamente os camundongos. Realize um pneumotórax abrindo a cavidade torácica com uma tesoura afiada para garantir a morte. Colha os músculos gastrocnêmio e quadríceps 8,9,10.
  2. Congelar o tecido recolhido em azoto líquido e conservá-lo a -80 °C para análise posterior.

5. Aplicação NIR

NOTA: O NIR é aplicado para diminuir a inflamação e reduzir a lesão de reperfusão.

  1. Aplique NIR de 670 nm a uma intensidade de 100 mW por 5 min uma vez por hora durante a oclusão.
  2. Mire no membro posterior com a fonte de luz de fibra óptica a uma distância de 2,5 cm entre o membro posterior e a luz. Não exponha a perna contralateral ao NIR (consulte a Figura 1 para a configuração).
  3. Acenda a luz NIR por 5 min por hora durante o período isquêmico.
  4. Instrumente o grupo simulado da mesma maneira. Não feche o torniquete nem aplique NIR no membro posterior.
    NOTA: A luz NIR possui um dissipador de calor. A temperatura não aumenta dentro de 5 minutos após a exposição à luz11.

6. Necrose TTC

NOTA: A necrose tecidual é avaliada para visualizar a redução da necrose no tecido muscular.

  1. Manchar os músculos frescos do quadríceps com TTC a 37 °C por 20-30 min em TTC a 1% em tampão fosfato 0,1 M ajustado para pH 7,4.
  2. Observe o tecido vivo vermelho e corado com base na presença de um precipitado de formazan.
    NOTA: A coloração vermelha é baseada na redução do TTC pelas enzimas desidrogenase no tecido saudável. O tecido necrótico não é corado10.
  3. Capture imagens de fatias coradas com TTC para análise e meça a região necrótica definindo uma região de interesse.

7. Análise ocidental para clorotirosina

  1. Submeter os camundongos ao protocolo de isquemia/reperfusão (seção 3).
  2. Colha tecidos (seção 4) e isole a proteína conforme descrito anteriormente12. Determinar a concentração de proteínas pelo ensaio de Bradford13.
  3. Use o lisado de proteína total para realizar eletroforese e borrar para 3-clorotirosina conforme descrito anteriormente12.
  4. Realize um western blot em lisados de gastrocnêmios.
    1. Adicione o tampão de amostra Laemmli contendo 5% de mercaptoetanol às amostras para obter uma concentração de 25 μg de proteína total em 40 μL.
    2. Execute as amostras em um gel estendido de trisglicina a 4-15% (consulte a Tabela de Materiais) a 50 mV por 5 min. Aumente a tensão para 100 mV por 1 h até que a frente do corante se esgote.
  5. Incube o gel em 1x tampão de transferência (25 mM Tris, 190 mM de glicina, 20% de metanol; ajuste o pH para 8,3 se necessário) por 10 min.
  6. Monte o sanduíche de transferência (esponja, filtro, gel, membrana de celulose, filtro, esponja). Coloque uma bolsa de gelo reutilizável no aparelho de transferência. Transfira por 30 min na câmara fria a 100 mA.
    NOTA: Certifique-se de que nenhuma bolha esteja presa no sanduíche de transferência, a mancha esteja no cátodo e o gel no ânodo.
  7. Enxágue o borrão e bloqueie-o em tampão de bloqueio (consulte a Tabela de Materiais) com 0,05% de interpolação por 30 min em temperatura ambiente. Lave o borrão com solução salina tamponada com Tris (TBS) contendo 5% de Tween três vezes por 5 min cada antes de adicionar o anticorpo primário.
  8. Incubar durante a noite com os anticorpos policlonais primários contra a 3-clorotirosina. Dilua os anticorpos no tampão de bloqueio com Tween a 0,05% (1:1.000).
  9. Use IgG anti-camundongo conjugada com peroxidase de rábano (HRP) e IgG anti-cabra HRP (diluição 1:10.000) como anticorpos secundários.
  10. Visualize bandas de identidade nas manchas usando o reagente de quimioluminescência aprimorada (ECL) e um sistema de imagem.
    1. Misture os componentes com base no protocolo do fabricante e incube-os com o blot por 3 min para ligar os reagentes ECL às bandas de interesse.
    2. Faça a imagem da mancha com um sistema de imagem (consulte a Tabela de Materiais). Use software de imagem como o ImageJ para medir a densidade e normalizar os valores de densidade das bandas de interesse para os das bandas de controle.

8. ELISA para CXCL1 e CXCL5

  1. Isole a proteína total dos músculos gastrocnêmios conforme descrito anteriormente12.
  2. Avalie o grau de inflamação por ELISA para CXCL1 e CXCL5 conforme descrito anteriormente14 e de acordo com as instruções do fabricante.

9. Imunoprecipitação seguida de análise ocidental

  1. Submeter os ratinhos ao protocolo de isquemia/reperfusão (secção 3).
  2. Colha os tecidos (seção 4) e isole a proteína conforme descrito anteriormente12. Determine a concentração de proteína pelo Ensaio de Bradford13.
  3. Para concentrar a fração de macrófagos do lisado proteico total, realizar uma imunoprecipitação para CD14 conforme descrito anteriormente15.
  4. Use o imunoprecipitado CD14 para realizar eletroforese e blot para CD206 e CD68 conforme descrito anteriormente12.
  5. Efectuar uma western blot nos lisados dos gastrocnêmios conforme descrito na secção 7.
  6. Incubar os imunoprecipitados durante a noite com os anticorpos policlonais primários contra CD206 ou CD68. Diluir os anticorpos 1:200 em TBS.
  7. Use IgG anti-camundongo de burro conjugado com HRP e IgG anti-cabra HRP (diluição de 1:10.000) como anticorpos secundários.
  8. Aplique o reagente ECL no blot após misturar os componentes com base no protocolo do fabricante e incube por 3 min para visualizar as bandas de interesse. Visualize a mancha usando um sistema de imagem.

10. Análise estatística

  1. Realizar análise estatística dos dados dentro e entre os grupos com análise de variância (ANOVA) para medidas repetidas seguida da modificação do teste t de Student de Bonferroni, p ≤ 0,05.
  2. Expresse os dados como média ± erro padrão da média (SEM) ou média ± desvio padrão (DP).

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Resultados

As medidas de fluxo confirmaram isquemia e reperfusão
A colocação da luz NIR e o protocolo experimental estão representados na Figura 1. Um modelo de isquemia murina dos membros posteriores foi desenvolvido e empregado para avaliar o efeito da exposição ao NIR na RII do músculo esquelético. Como era esperado, a imagem de fluxo com laser Doppler (Figura 2A) verificou que o torniquete foi eficaz na indução de isquemia, juntamente com um retorno...

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Discussão

Este artigo descreve um dos primeiros estudos a enfocar a redução da lesão de reperfusão pelo tratamento com luz NIR, alterando a resposta inflamatória no membro posterior. A lesão de isquemia e reperfusão e o tratamento com luz NIR não são totalmente novos. Outros estudos enfocaram a reperfusão de isquemia por luz NIR. O tratamento com luz NIR tem sido usado com sucesso na redução do tamanho da infração miocárdica e na redução do dano renal após lesão de isquemia e reperfusão. Quirk et ...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Departamento de Cirurgia Ortopédica pelo financiamento deste estudo. Também agradecemos a Brian Lindemer e Grant Broeckel por seu apoio técnico.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2,3,5-TrifeniltetrazólioSigma Aldrich17779-10X10ML-FSolução de 1%
4– 15% Criterio TGX Gel de Proteína Sem ManchasBioRad#5678084Géis estendidos de tris-glicina
4x Tampão de Amostra Laemmli - 1610747BioRad16110747
fonte de luz de 670 nmNIR Technologiesfeito sob medida
de Ensaio de Proteína BCAThermo Fisher23227
BioRad ChemiDocSistema de imagem
Bio-Rad
β-mercaptoetanolBioRad1610710
CXCL1 ELISAR& D SystemsDY453-05
CXCL5 ELISAR& D SystemsDX000
ForaneBaxter1001936040inalante de isoflurano
cabra anti-coelho IgG-HRPSanta Cruz Biotechnologiessc-2004Diluição 1:10.000
Ice Accu bolsa
Doppler a laser ImagerMoorMOORLDI2-HIR
anticorpo monoclonal CD14Santa Cruz Biotechnologiessc-515785diluição 1:200
anticorpo monoclonal CD206Santa Cruz Biotechnologiessc-58986diluição 1:200
anticorpo monoclonal CD68Santa Cruz Biotechnologiessc-20060diluição 1:200
Pierce Protein free (TBS) bloqueando o tampão
tampão de bloqueio policlonal Anticorpo clorotirosinaHycultHP50021:1.000 diluição
Proteína A/G PLUS-AgaroseSanta Cruz Biotechnologiessc-2003
Super Signal West FemtoThermoFisher34095reagente de quimioluminescência aprimorado
Kit Bio-Rad de gelo

Referências

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