Tratamento de luz infravermelha não térmica de lesão de isquemia/reperfusão e subsequente análise da diferenciação de macrófagos

Resumo

Descrevemos a redução da lesão de reperfusão por irradiação de 670 nm em um modelo de camundongo de isquemia e reperfusão por colocação de torniquete. Essa irradiação de 670 nm reduziu a resposta inflamatória, diminuiu o número de macrófagos pró-inflamatórios e aumentou os macrófagos protetores.

Resumo

Danos teciduais e necrose por processos inflamatórios são consequência da lesão de isquemia e reperfusão (IRI). No músculo esquelético, a isquemia reduz a capacidade energética aeróbica das células musculares, levando a alterações bioquímicas adversas e inflamação. O objetivo deste estudo é mostrar que a exposição à luz infravermelha próxima (NIR) durante um período de isquemia reduz a IRI diminuindo a necrose e a inflamação, além de diminuir o M1 pró-inflamatório e aumentar os macrófagos M2 protetores. Camundongos C57 / Bl6 foram submetidos a isquemia unilateral de membros posteriores induzida por torniquete por 3 h, seguida de reperfusão por 15 ou 30 min. Os camundongos foram divididos aleatoriamente em 3 grupos. O grupo 1 foi submetido à IRI com 30 min de reperfusão. O grupo 2 foi submetido à IRI com reperfusão de 15 minutos. Cada grupo consistiu de camundongos tratados com 50% sem NIR e 50% com NIR com exposição de 50 mW / cm² por 5 min / 1 h após o fechamento do torniquete. O grupo 3 foi composto por animais simulados anestesiados por 3 h, omitindo o IRI.

A imagem de fluxo com doppler a laser foi realizada em todos os camundongos para confirmar isquemia e reperfusão. Os dados de fluxo foram expressos como a razão entre o membro isquêmico e o controle contralateral. Os camundongos foram eutanasiados após a reperfusão, e o quadríceps e o gastrocnêmio foram colhidos. Imunoprecipitação e western blot dos macrófagos-marcadores CD68 (M1) e CD206 (M2) foram realizados e normalizados para a expressão de CD14. A expressão dos marcadores inflamatórios CXCL1 e CXCL5 foi significativamente reduzida pelo NIR no grupo IRI. Uma diminuição significativa no CD68 e um aumento na expressão de CD206 foi observado nos animais que receberam IR e NIR. A necrose tecidual foi diminuída pelo NIR no grupo IRI, conforme visualizado pela coloração com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC). Os resultados demonstram que a exposição ao NIR reduziu o IRI e melhorou a sobrevivência do tecido. O NIR reduziu a inflamação, diminuiu o M1 pró-inflamatório e aumentou os macrófagos M2 protetores. A exposição ao NIR reduziu a inflamação e aumentou a regeneração, levando à proteção do tecido após a isquemia.

Introdução

A lesão de isquemia-reperfusão (IRI) é um desafio clínico observado após lesões vasculares e uso prolongado de torniquetes cirúrgicos. Estudos anteriores mostraram que 60-90 min é o limite superior para o tempo de isquemia quente, além do qual podem ocorrer danos irreversíveis ao tecido. Mais do que qualquer outro fator, as limitações do tempo de isquemia quente limitam o sucesso e o salvamento do reimplante de membros disvasculares ^1,2.

No músculo esquelético, a isquemia reduz a capacidade aeróbia das células, levando à inflamação aguda e alteraçõe....

Protocolo

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (Protocolo: AUA#1517). Todas as pesquisas envolvendo camundongos foram conduzidas em conformidade com a política do PHS.

1. Colocação do torniquete

NOTA: Um torniquete foi colocado para induzir isquemia e obter um campo cirúrgico livre de sangue.

1. Anestesiar um camundongo C57/Bl6 com isoflurano na câmara de indução a....

Resultados

As medidas de fluxo confirmaram isquemia e reperfusão
A colocação da luz NIR e o protocolo experimental estão representados na Figura 1. Um modelo de isquemia murina dos membros posteriores foi desenvolvido e empregado para avaliar o efeito da exposição ao NIR na RII do músculo esquelético. Como era esperado, a imagem de fluxo com laser Doppler (Figura 2A) verificou que o torniquete foi eficaz na indução de isquemia, juntamente com um retorno.......

Discussão

Este artigo descreve um dos primeiros estudos a enfocar a redução da lesão de reperfusão pelo tratamento com luz NIR, alterando a resposta inflamatória no membro posterior. A lesão de isquemia e reperfusão e o tratamento com luz NIR não são totalmente novos. Outros estudos enfocaram a reperfusão de isquemia por luz NIR. O tratamento com luz NIR tem sido usado com sucesso na redução do tamanho da infração miocárdica e na redução do dano renal após lesão de isquemia e reperfusão. Quirk et .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2,3,5-Trifeniltetrazólio	Sigma Aldrich	17779-10X10ML-F	Solução de 1%
4– 15% Criterio TGX Gel de Proteína Sem Manchas	BioRad	#5678084	Géis estendidos de tris-glicina
4x Tampão de Amostra Laemmli - 1610747	BioRad	16110747
fonte de luz de 670 nm	NIR Technologies		feito sob medida
de Ensaio de Proteína BCA	Thermo Fisher	23227
BioRad ChemiDoc	Sistema de imagem
Bio-Rad
β-mercaptoetanol	BioRad	1610710
CXCL1 ELISA	R& D Systems	DY453-05
CXCL5 ELISA	R& D Systems	DX000
Forane	Baxter	1001936040	inalante de isoflurano
cabra anti-coelho IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnologies	sc-2004	Diluição 1:10.000
Ice Accu bolsa
Doppler a laser Imager	Moor	MOORLDI2-HIR
anticorpo monoclonal CD14	Santa Cruz Biotechnologies	sc-515785	diluição 1:200
anticorpo monoclonal CD206	Santa Cruz Biotechnologies	sc-58986	diluição 1:200
anticorpo monoclonal CD68	Santa Cruz Biotechnologies	sc-20060	diluição 1:200
Pierce Protein free (TBS) bloqueando o tampão
tampão de bloqueio policlonal Anticorpo clorotirosina	Hycult	HP5002	1:1.000 diluição
Proteína A/G PLUS-Agarose	Santa Cruz Biotechnologies	sc-2003
Super Signal West Femto	ThermoFisher	34095	reagente de quimioluminescência aprimorado

Kit Bio-Rad de gelo