Determinação da respiração mitocondrial e glicolise em amostras de tecido retinal ex vivo

Resumo

Descrito aqui é um protocolo detalhado para a realização de ensaios de estresse mitocondrial e ensaio de taxa glicólítica em amostras de tecido de retina ex vivo usando um bioanalzer comercial.

Resumo

A respiração mitocondrial é um caminho crítico gerador de energia em todas as células, especialmente fotorreceptores de retina que possuem um metabolismo altamente ativo. Além disso, fotorreceptores também exibem alta glicólise aeróbica como células cancerosas. Medições precisas dessas atividades metabólicas podem fornecer informações valiosas sobre a homeostase celular em condições fisiológicas e em estados de doenças. Ensaios baseados em microplacos de alto rendimento foram desenvolvidos para medir a respiração mitocondrial e várias atividades metabólicas em células vivas. No entanto, a grande maioria delas são desenvolvidas para células cultivadas e não foram otimizadas para amostras de tecido intacto e para aplicação ex vivo. Descrito aqui é um protocolo passo-a-passo detalhado, utilizando a tecnologia de fluorescência baseada em microplaca, para medir diretamente a taxa de consumo de oxigênio (OCR) como um indicador de respiração mitocondrial, bem como taxa de acidificação extracelular (ECAR) como um indicador de glicolise, em tecido de retina ex vivo intacto. Este método tem sido usado para avaliar com sucesso as atividades metabólicas na retina do camundongo adulto e demonstrar sua aplicação na investigação de mecanismos celulares de envelhecimento e doença.

Introdução

Mitocôndrias são organelas essenciais que regulam o metabolismo celular, sinalização, homeostase e apoptose coordenando múltiplos processos fisiológicos ^cruciais1. Mitocôndrias servem como a potência na célula para gerar triphosfato de adenosina (ATP) através da fosforilação oxidativa (OXPHOS) e fornecem energia que suporta quase todos os eventos celulares. A maioria do oxigênio celular é metabolizada em mitocôndrias, onde serve como o aceitador final de elétrons na cadeia de transporte de elétrons (ETC) durante a respiração aeróbica. Baixas quantidades de ATP também podem ser produzidas a partir da glicolise no citosol, onde a glicose é conver....

Protocolo

Todos os protocolos de camundongos foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais do Instituto Nacional de Olhos (NEI ASP nº 650). Os camundongos foram alojados em condições claras e escuras 12h e atendidos seguindo as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, do Instituto de Recursos Animais Laboratoriais e da Política de Serviços Públicos de Saúde sobre Cuidados Humanos e Uso de Animais de Laboratório.

1. Cartucho de sensor hidratante e preparação do meio de ensaio

1. No dia anterior ao experimento, adicione 1 mL do meio de calibração a cada poço da placa de utilidade. Coloque a tampa Hydro-Booster ....

Resultados

Os dados aqui relatados são ensaios representativos de estresse mitocondrial mostrando traços OCR (Figura 1) e ensaio de taxa glicolítico mostrando traços OCR e traço ECAR (Figura 2), que foram realizados usando discos de perfuração de retina de 1 mm recém-dissecados a partir de 4 meses de camundongos nrl-L-EGFP transgênicos ^de 4 meses de idade( fundo C57B/L6). Esses camundongos expressam GFP especificamente em fotorreceptores de.......

Discussão

Fornecido aqui estão instruções detalhadas para a realização de ensaios baseados em microplaca de atividade de respiração mitocondrial e glicolise usando discos de perfuração de retina ex vivo, recém-dissecados. O protocolo foi otimizado para: 1) garantir o uso de um meio de ensaio adequado para tecido de retina ex vivo; 2) empregar o tamanho adequado dos discos de perfuração de retina para obter leituras de OCR e ECAR que se enquadram no alcance ideal de detecção da máquina; 3) revestimento de inserçõe.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1X PBS	Thermo Fisher	14190-144
2-Desoxiglicose (2-DG), solução estoque 500 mM	Sigma	D6134	Dissolva em meio Seahorse XF DMEM, prepare com antecedência
agulha de calibre 30	BD Precision Glide	305106
Antimicina A, solução estoque 10 mM	Sigma	A8674	Dissolva em DMSO, prepare com antecedência
Bam15, estoque 10 mM solução	TimTec	ST056388	Dissolva em DMSO, prepare com antecedência
Perfurador de biópsia, 1 mm	Integra Miltex	33-31AA
Cell-Tak	Corning Life Sciences	CB40240
			asfixia por CO2
Pinça de dissecação-Dumont #5	Fine Science Tools	11251-10	Ponta reta
Dissecção fórceps-Dumont #7	Fine Science Tools	11274-20	Ponta curva
Microscópio
DMSO	Sigma	D2438
Pinça Graefe	Fine Science Tools	11051-10	Ponta curvada e serrilhada
Microtesoura Fine	Science Tools	15004-08 Solução de	de ponta curva
, 1 M	Sigma-Aldrich	S8263	Solução aquosa, prepare com antecedência
Rotenona, solução estoque de 10 mM	Sigma	R8875	Dissolva em DMSO, prepare com antecedência Meio de
calibração de cavalos-marinhos	Agilent	100840-000
Seahorse XF 1,0 M glicose	Agilent	103577-100
Seahorse XF 100 mM piruvato	Agilent	103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamina	Agilent	103579-100
Seahorse XF DMEM medium	Agilent	103575-100	pH 7,4, com 5 mM HEPES
Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak	Agilent	103518-100	Contendo Cartucho Sensor e Microplaca de Captura de Ilhotas
Seahorse XFe24, Analisador de Fluxo Extra Celular	Solução de
, 0,1 M	Sigma-Aldrich	S5761	Solução aquosa, prepare com antecedência
Pincel de cílios superfino	Ted Pella	113

câmara dede dissecção NaOH bicarbonato de sódio Agilent