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Artigo de método

Imagem Mitocondrial Ca2+ Absorção em Astrócitos e Neurônios usando Indicadores Ca2+ Codificados Geneticamente (GECIs)

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DOI:

10.3791/62917

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22 de janeiro de 2022

 ,  ,  , 
1Dalton Cardiovascular Research Center, University of Missouri-Columbia, 2Department of Biomedical, Biological and Chemical Engineering, University of Missouri-Columbia

Neste artigo

Resumo

Este proctocol tem como objetivo fornecer um método para imagens in vitro e in vivo mitocondrial Ca2+ em astrócitos e neurônios.

Resumo

Mitocondrial Ca2+ desempenha um papel crítico no controle do tampão citosolico Ca2+, metabolismo energético e transdução de sinal celular. A sobrecarga do Ca2+ mitocondrial contribui para várias condições patológicas, incluindo neurodegeneração e morte celular apoptótica em doenças neurológicas. Aqui apresentamos um tipo celular específico e mitocôndrias visando abordagem molecular para imagem mitocondrial Ca2+ em astrócitos e neurônios in vitro e in vivo. Construímos plasmídeos de DNA codificando mitocôndrias com alvo genético de indicadores Ca2+ codificados geneticamente (GECIs) GCaMP5G ou GCaMP6s (GCaMP5G/6s) com promotores específicos de astrócitos e neurônios gfaABC1D e CaMKII e sequência de alvo de mitocôndrias (mito-). Para imagens mitocondriais in vitro Ca2+, os plasmídeos foram transfectados em astrócitos e neurônios cultivados para expressar GCaMP5G/6s. Para imagens in vivo mitocondrial Ca2+, vetores virais associados a Adeno (AAVs) foram preparados e injetados nos cérebros do camundongo para expressar GCaMP5G/6s em mitocôndrias em astrócitos e neurônios. Nossa abordagem fornece um meio útil para a imagem mitocondrial Ca2+ dinâmica em astrócitos e neurônios para estudar a relação entre a sinalização citosolic e mitocondrial Ca2+, bem como interações astrócito-neurônio.

Introdução

Mitocôndrias são organelas subcelulares dinâmicas e são consideradas como potências celulares para produção de energia. Por outro lado, as mitocôndrias podem levar o Ca2+ à matriz em resposta aos aumentos locais ou citosóicos ca2+. A absorção mitocondrial Ca2+ afeta a função mitocondrial, incluindo processos metabólicos como reações no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e fosforilação oxidativa, e regula as proteínas sensíveis ca2+em condições fisiológicas1,2,3,4. A sobrecarga mitocondrial Ca2+ também é determinante para a morte celular, incluindo necrose e apoptose em vários distúrbios cerebrais5,6,7. Causa a abertura de poros de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTPs) e a liberação do cofator caspase, que iniciam a morte celular apoptótica. Por isso, é importante estudar melhor a dinâmica mitocondrial ca2+ e o manuseio em células vivas para entender melhor a fisiologia celular e a patologia.

Mitocôndrias mantêm a matriz Ca2+ homeostase através de um equilíbrio entre a absorção de Ca2+ e o efflux. A captação mitocondrial Ca2+ é mediada principalmente por semportadores mitocondriais Ca2+ (MCUs), enquanto o efflux Mitocondrial Ca2+ é mediado pelos trocadores Na+-Ca2+-Li+ (NCLXs) e pelos trocadores H+/Ca2+ (mHCXs)8. O equilíbrio pode ser perturbado através da estimulação de receptores acoplados de proteína G (GPCRs)9. Mitocondrial Ca2+ homeostasis também é afetada pelo tampão mitocondrial pela formação de complexos insolúveis xCa2+-xPO4x-xOH8.

Alterações intracelulares e mitocondriais na concentração de Ca2+ ([Ca2+]) podem ser avaliadas por indicadores fluorescentes ou luminescentes Ca2+. A vinculação ca2+ aos indicadores causa modificações espectrais, permitindo o registro de celular gratuito [Ca2+] em tempo real em células ao vivo. Atualmente, dois tipos de sondas estão disponíveis para monitorar as alterações do Ca2+nas células: indicadores químicos orgânicos e indicadores ca2+ (GECIs) codificados geneticamente. Geralmente, diferentes variantes com diferentes afinidades ca2+ (baseadas em Kd),propriedades espectrais (comprimentos de onda de excitação e emissão), faixas dinâmicas e sensibilidades estão disponíveis para as questões biológicas sob investigação. Embora muitos indicadores orgânicos sintéticos Ca2+ tenham sido utilizados para imagens citosócidas Ca2+, apenas alguns podem ser carregados seletivamente na matriz mitocondrial para imagem mitocondrial Ca2+, sendo Rhod-2 o mais utilizado (para revisões ver10,11). No entanto, o Rhod-2 tem uma grande desvantagem de vazamento durante experimentos de longo curso; além disso, é particionada entre mitocôndrias, outras organelas e o citosol, dificultando as medições absolutas em diferentes subcomentamentos. Em contraste, usando promotores específicos do tipo celular e sequências de segmentação de compartimentos subcelulares, os GECIs podem ser expressos em diferentes tipos de células e compartimentos subcelulares para imagens Ca2+ específicas para células e compartimentos in vitro ou in vivo. Os indicadores GCaMP Ca2+ baseados em intensidade de comprimento único surgiram recentemente como principais GECIs12,13,14,15,16. Neste artigo, fornecemos um protocolo para a segmentação de mitocôndrias e expressão específica do tipo celular de GCaMP5G e GCaMP6s (GCaMP5G/6s) em astrócitos e neurônios, e a absorção mitocondrial ca2+ de imagem nesses tipos de células. Usando este protocolo, a expressão de GCaMP6G/6s em mitocôndrias individuais pode ser revelada, e a absorção do Ca2+ em resolução mitocondrial única pode ser alcançada em astrócitos e neurônios in vitro e in vivo.

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Protocolo

Os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade do Missouri-Columbia.

1. Construção de plasmídeos de DNA

NOTA: Para imagens in vitro e in vivo, plasmídeos de DNA codificam GCaMP5G/6s com promotores específicos de astrócitos e neurônios e sequências de alvo mitocondrial.

  1. Inserir matriz mitocondrial (MM)-targeting sequence (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG17 no clon sites de regência EcoRI e BamHI na espinha dorsal do vírus associado ao adeno (AAV) plasmídeo pZac2.1 para obter plasmídeos contendo gfaABC1D promotor astrocítico ou promotor neuronal caMKII18,19,20.
  2. Subclone GCaMP5G/6s nos locais de clonagem BamH I e Não 1 nos plasmídeos acima para obter novos plasmids pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5 G/6s e pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s que visam a expressão transgênica em mitocôndrias em astrócitos e neurônios20,21 (Figura 1A).
  3. Prepare os plasmídeos de DNA pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G e pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s para transfecção para estudo in vitro (Seção 2). Produzir vetores AAV com sorotipo 5 para astrócitos e sorotipo 9 para neurônios para o estudo in vivo 18 (Seção 3).

2. Imagem mitocondrial in vitro Ca2+ em astrócitos e neurônios

  1. Prepare os astrócitos primários do córtex de camundongos neonatais P1 e neurônios primários do córtex dos embriões E15-1618,22,23,24, e cultue-os em deslizamento de vidro de 12 mm de diâmetro em placas de 24 poços usando o DMEM (Modified Eagle Medium, meio de águia modificada) de Dulbecco contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e meio basal neuronal (NBM) contendo 2% de B27, respectivamente.
  2. Transfeito astrócitos maduros e neurônios com pZac-gfaABC1D-GCaMP6s e pZac-CaMKII-GCaMP5G plasmídeos usando reagente de transfecção à base de lipídio para expressar GCaMP6s nas mitocôndrias de astrócitos e GCaMP5G nas mitocôndrias dos neurônios18,20,21. Transfectar células em cada poço com 0,5 μg de DNA, e alterar o meio 6 h depois.
    NOTA: Os astrócitos e neurônios estão prontos para a imagem 1-2 dias após a transfecção.
  3. Realize imagens in vitro mitocondrial Ca2+ 1-2 dias após a transfecção.
    1. Transfira as tampas de vidro cultivadas com astrócitos ou neurônios para a câmara de perfusão PH-1 sob uma epifluorescência ou dois microscópios de fótons.
    2. Estimule a absorção mitocôndrial ac2+ com 100 μM ATP em ACSF, ou estimule mitocôndrias neuronais com 100 μM de glutamato/10 μM glycina20,25 (Figura 2 e Figura 3).
      NOTA: As alterações de solução do ACSF para o ACSF contendo GLinato/glinato/glico são controladas por um sistema de perfusão ALA-VM821. A velocidade da mudança da solução é controlada a 1-2 mL/min ajustando uma válvula.

3. In vivo mitocondrial Ca2+ imagem em astrócitos e neurônios

  1. Preparações AAV.
    1. Prepare os seguintes vetores de vírus adeno associados à adenina (rAAV) usando os plasmídeos de DNA preparados na seção 1: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G e rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vetores.
      NOTA: Neste experimento, os vetores rAAV do sorotipo 5 foram preparados para expressar GCaMP5G em mitocôndrias em astrócitos e vetores rAAV do sorotipo 9 foram preparados para expressar GCaMP6s em mitocôndrias em neurônios.
  2. Injeção de AAV estereutribicic.
    1. Anestesiar o rato com 3% de isoflurano.
      NOTA: Mais tarde, durante a cirurgia, os níveis de isoflurane são reduzidos para 2%.
    2. Depois que o camundongo atinge um nível cirúrgico de anestesia, conforme determinado por pinça de cauda e dedo do pé, raspe o cabelo sobre o local da cirurgia, córtex motor ou somatosensorial, com um aparador de cabelo.
    3. Posicione o mouse no dispositivo estereotaxic do mouse e fixe a cabeça com barras de ouvido. Aplique pomada oftalmológica nos olhos para protegê-los durante a cirurgia. Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal do mouse a 37 °C durante toda a cirurgia.
      NOTA: Realizar cirurgia utilizando procedimentos assépticos. Todas as ferramentas cirúrgicas precisam ser esterilizadas por autoclaving ou por um esterilizador de contas quentes.
    4. Depois que o mouse é montado no dispositivo estereotaxico, esterilize o couro cabeludo com esfoliação alternada à base de iodo e 70% de etanol três vezes. Faça uma incisão no meio do couro cabeludo para expor o local da injeção.
    5. Corte a pele no eixo bregma-lamda e crie um orifício de rebarba de ~1 mm de diâmetro com uma broca de alta velocidade no local de injeção pretendido do motor ou córtex somatosensorial.
    6. Use uma seringa Hamilton de 33 G contendo vírus associado ao adeno (rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G vetores [1 x 1011 GC] ou rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vetores [1 x 1011 GC]) para injetar até 1 μL de vírus na área alvo.
      NOTA: Por exemplo, para o parto viral cortical, injete a solução do vírus em duas profundidades em várias etapas. Primeiro, insira a agulha a uma profundidade de 1 mm da dura e deixe 5 minutos para o cérebro se recuperar. Em seguida, mova a agulha até ~700 μm de profundidade e injete 500 nL da solução do vírus a uma velocidade de injeção de 10 nL/s usando uma seringa hamilton controlada por um controlador de bomba de microsinga. Depois que a injeção for concluída, espere 5 minutos para permitir que o vírus se difunda no cérebro. Em seguida, mova a agulha até o segundo local de injeção a uma profundidade de 300 μm. Aqui, injete mais 500 nL da solução do vírus. Espere 10 minutos para permitir que o vírus se difunda no cérebro.
    7. Feche o couro cabeludo e a pele usando um adesivo de tecido. Deixe os ratos se recuperarem na almofada de aquecimento. Mande ratos de volta para a instalação animal após a recuperação.
  3. Intstallação de janela cranial e imagem in vivo de dois fótons (2-P) de sinais mitocondriais Ca2+.
    NOTA: A implantação da janela craniana é feita 3 semanas após a injeção de AAV sobre o córtex motor ou somatosensorial26,27,28,29. O carprofeno (10 mg/kg) é injetado subcutâneamente para aliviar a dor potencial antes da cirurgia. Os procedimentos cirúrgicos da janela craniana são idênticos aos procedimentos cirúrgicos de injeção de AAV e são realizados em condições assépticas.
    1. Anestesiar o rato com 3% de isoflurano.
      NOTA: Esta é a dose inicial e reduza para 2% para a cirurgia mais tarde. Durante a imagem, uma injeção intraperitoneal (IP) de 130 mg de cetamina/10 mg de xilazína/kg de peso corporal dissolvido em ACSF é usada para anestesia.
    2. Posicione o mouse no dispositivo estereotaxic do mouse e fixe a cabeça com barras de ouvido. Aplique pomada oftálmica aos olhos. Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal do mouse a 37 °C durante toda a cirurgia.
      NOTA: Todas as ferramentas cirúrgicas precisam ser esterilizadas.
    3. Faça uma incisão de 5-8 mm de comprimento na linha média do couro cabeludo e remova uma aba de pele usando um par de tesouras.
    4. Após a exposição do crânio, realize craniotomia de 2,0-3,0 mm de diâmetro usando uma broca de alta velocidade sobre a área injetada pelo vírus (ou seja, córtex motor ou córtex somatosensorial, Figura 1B). Primeiro, faça quatro pequenos furos, e depois faça um círculo conectando os buracos. Em seguida, levante e remova o osso com uma tesoura afiada e retire. A dura-máter exposta pode ser removida ou mantida intacta para impantação da janela craniana.
    5. Coloque uma tampa de vidro de 3-5 mm de diâmetro carregando um silicone transparente sobre a craniotomia. Use um palito para empurrar a janela craniana suavemente para a superfície do cérebro. Em seguida, sele a borda com uma pequena quantidade de adesivo de silicone.
      NOTAs: Alternativamente, em vez de disco de silicone, 1,2% de baixo gel de ponta de fusão pode ser usado entre o vidro de cobertura e o tecido cerebral.
    6. Por fim, sele as bordas do deslizamento com cimento dental. Tome cuidado para aplicar o cimento ligeiramente na borda da janela craniana para uma ligação forte. Coloque uma placa de metal personalizada no crânio com cimento dental.
      NOTA: A placa metálica é usada para fixar a cabeça do mouse ao estágio do microscópio 2-P durante a sessão de imagem(Figura 1C).
    7. Adicione 0,5 mL de solução ACSF sobre o deslizamento de cobertura na janela craniana para imersão de água durante a imagem.
    8. Realize o time-lapse in vivo 2-P de imagem de mito-GCaMP5G em astrócitos e mito-GCaMP6s em neurônios com comprimento de onda de 910 nm através da janela craniana(Figura 1C)18,20,27.
      NOTA: Durante a imagem, os ratos estão na almofada de aquecimento para manter a temperatura fisiológica. Os ratos serão sacrificados imediatamente após a sessão de imagem ser concluída.
    9. Rotular astrócitos in vivo com sulforhodamina 101 (SR101) quando for necessário determinar a colocalização.
      1. Ao final da etapa 3.3.4, aplique 100 μL de 100 μM SR101 em ACSF na superfície cortical por 1-5 min.
      2. Enxágüe a superfície com ACSF para lavar o SR101 desvinculado. Utilizando imagens 2-P, a co-rotulagem de mito-GCaMP5G e SR101 em astrócitos pode ser observada 45-60 min depois(Figura 4A).

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Resultados

O objetivo deste estudo foi fornecer uma metodologia para a imagem mitocondrial Ca2+ sinais utilizando GECIs em astrócitos e neurônios in vitro e in vivo. Os resultados das imagens in vitro e in vivo mitocondrial Ca2+ são apresentados aqui.

Sinalização mitocondrialin vitro Ca2+ em astrócitos e neurônios cultivados
A absorção mitocondrial Ca...

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Discussão

Neste artigo, fornecemos um método e protocolo para imagens mitocondrial Ca2+ sinais em astrócitos e neurônios. Implementamos estratégias específicas de segmentação de mitocôndrias e tipo celular para expressar GECI GCaMP5G/6s. Para atingir GCaMP5G/6s em mitocôndrias, incluímos uma sequência de metas de mitocôndrias nos plasmídeos. Para expressar GCaMP5G/6s em astrócitos e neurônios in vivo,inserimos um promotor específico de astrócito gfaABC1D e promotor específico de neurônios CaMKII nos plasmídeos....

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde de Distúrbios Neurológicos e AVC (NINDS) concede R01NS069726 e R01NS094539 à SD. Agradecemos a Erica DeMers pela gravação de áudio.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pomada de lágrimas artificiaisRugbyNDC-0536-6550-9183% petrolato branco
Cola de cianoacrilatoInstrumentos de Precisão3M Vetbond Adesivo
Dissecando estereomicroscópioNikonSMZ 2BCirurgia
Dumont fórceps com ponta finaFerramentas de Belas Ciências11255-20para remoção de
lamínulas de vidro dura, 0,13-0,17 mm de espessuraFisher Scientific12-542Apara cobertura da janela craniana
Micro broca de alta velocidadeFerramentas de ciências finas18000-17com broca de polimento ósseo
Seringa de injeçãoHamilton2,5 mlpara injeção viral
CetaminaVEDCONDC-50989-996-06100 mg/kg de peso corporal
Baixo ponto de fusão agaroseSigma-AldrichA9793reduzindo artefatos de movimento
Armação de metalFeito sob medidaver Fig 1para fixação do cérebro ao estágio do microscópio
Controlador de bomba de microseringaWorld Precision InstrumentsUMP3Controlador de velocidade de injeção
Dispositivo estereotáxico de mouseStoelting51725para segurar ratos
Câmara de perfusãoWarner Instruments64-0284
Sistema de perfusãoALA Scientific InstrumentsALA-VM8
Almofada de aquecimento auto-regulávelFine Science Tools21061para prevenir a hipotermia de camundongos
Sulforrodamina 101InvitrogenS-359corante fluorescente vermelho para rotular astrócitos
Tesoura cirúrgica, 12 cmFine Science Tools14002-12para dissecção
TrephineFine Science Tools18004-23para limpeza de material
XylazineVEDCONDC-50989-234-1110 mg / kg de peso corporal
Mundial

Referências

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