Descelularização para a Preparação de Matriz de Pele Acelular Humana Altamente Preservada para Medicina Regenerativa

Resumo

A pele humana descelularizada é adequada para a regeneração de tecidos. Uma questão importante da descelularização é a preservação da arquitetura nativa, juntamente com o conteúdo apropriado de proteínas estruturais, glicosaminoglicanos (GAGs) e fatores de crescimento. O método proposto permite uma descelularização rápida e eficaz, produzindo pele descelularizada com traços nativos bem preservados.

Resumo

A matriz extracelular (MEC) fornece estímulos biofísicos e bioquímicos para apoiar a auto-renovação, proliferação, sobrevivência e diferenciação das células circundantes devido ao seu conteúdo de diversas moléculas bioativas. Devido a essas características, a ECM tem sido recentemente considerada uma candidata promissora para a criação de scaffolds biológicos para impulsionar a regeneração tecidual. Estudos emergentes demonstraram que tecidos humanos descelularizados podem se assemelhar à ECM nativa em seus perfis estruturais e bioquímicos, preservando a arquitetura tridimensional (3D) e o conteúdo de moléculas biológicas fundamentais. Assim, a MEC descelularizada pode ser empregada para promover a remodelação tecidual, reparo e reconstrução funcional de muitos órgãos. A seleção do procedimento de descelularização adequado é crucial para obter tecidos acelulares que retenham as características do microambiente ideal para as células.

O protocolo descrito aqui fornece uma descrição detalhada passo a passo do método de descelularização para obter uma ECM biológica livre de células reprodutível e eficaz. Fragmentos de pele de pacientes submetidos à cirurgia plástica foram reduzidos e descelularizados usando uma combinação de dodecilsulfato de sódio (SDS), Triton X-100 e antibióticos. Para promover o transporte regular e homogêneo da solução através das amostras, elas foram fechadas em embutidos para garantir a proteção contra insultos mecânicos. Após o procedimento de descelularização, a cor branca como a neve dos fragmentos de pele indicou descelularização completa e bem-sucedida. Além disso, as amostras descelularizadas mostraram uma arquitetura intacta e bem preservada. Os resultados sugerem que o método de descelularização proposto foi eficaz, rápido e reprodutível e protegeu as amostras de danos arquitetônicos.

Introdução

A MEC serve como um andaime para as células, sustentando-as por meio de uma intrincada arquitetura mantida por diferentes componentes, e é um dos principais fatores responsáveis pelas propriedades mecânicas do coração e da função do tecido cardíaco ^1,2. Evidências crescentes sugerem que a MEC desempenha um papel ativo na remodelação tecidual, tornando obsoleta a suposição convencional de que a MEC é um componente passivo 3,4,5,6. O papel da ECM é for....

Protocolo

As amostras de tecido humano foram coletadas de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque e observando as diretrizes do Hospital Universitário "Federico II". Todos os pacientes envolvidos neste estudo forneceram o termo de consentimento livre e esclarecido.

1. Preparação das soluções

1. Preparação de 1200 mL de solução descelularizante a 1%
   1. Preparar 600 ml de solução Triton X-100 a 2% medindo 588 ml de água bidestilada num cilindro graduado e transferindo-a para um copo de 1 L. Com uma pipeta serológica, adicione 12 ml de Triton X-100 e uma barra de agitação ao copo. Colocar o c....

Resultados

O objetivo do protocolo foi obter uma amostra de d-ECM de pele de tecido biológico, mantendo uma estrutura 3D bem organizada e um conteúdo bem preservado de moléculas biológicas (Figura 1). Este método baseia-se principalmente na agitação constante das amostras em uma solução contendo a combinação de dois detergentes, Triton X-100 e SDS, preservando assim as características biológicas e estruturais típicas do tecido nativo e reduzindo o tempo de exposição du.......

Discussão

Embora o protocolo descrito acima tenha sido otimizado e aprimorado em comparação com os protocolos publicados anteriormente, ele apresenta algumas etapas críticas que precisam de atenção e precisão. A formação de espuma deve ser evitada durante a preparação da solução descelularizante para evitar a diluição incorreta dos detergentes. Isso pode ser resolvido despejando suavemente as soluções e fazendo-as fluir ao longo do lado interno do cilindro. Além disso, deve-se ter cuidado ao remov.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,9% NaCl isotônico Solução fisiológica	Sigma-Aldrich	S8776	0,9% em água
Copo de 1 L	VWR	511-0318	Limpe e autoclave antes do uso
Pipeta sorológica de 10 mL	Falcon	357551	Estéril,  placas de poliestireno
de 100 mm	Falcon	351029	Placa de cultura de células estéreis tratada
com 15 mL de tubos estéreis	Falcon	352097	Tubos estéreis para centrífugas, polipropileno
cilindro graduado de 1 L	VWR	612-1524	Limpar e autoclave antes de usar
Frasco de 2 L	VWR	215-1596	Limpar e autoclave antes de usar
Pipeta serológica de 25 mL	Falcon	357525	Estéril,  poliestireno
2 L cilindro graduado	VWR	612-3072	Limpar e autoclave antes de utilizar
Copo de 500 ml	VWR	511-0317	Limpar e autoclave antes de utilizar
Anfotericina B	Sigma-Aldrich	Y0000005	Placa
de dissecação	VWR	100498-398	Fabricada em polietileno de alta densidade.
Bisturi de dissecação	VWR	233-5526	de embutir estéreis e descartáveis
	Diapath	070191	Dimensões externas: 40x26x7 mm (LxPxA)
Pinça fina	VWR	232-1317	Limpar e autoclave antes de utilizar
Funil	VWR	221-1861	Limpar e autoclave antes de utilizar
Barcos de pesagem hexagonais tamanho M	Sigma-Aldrich	Z708585	Hexagonal, poliestireno, 51 mm de diâmetro interno inferior, 64 mm de diâmetro interno superior
Barcos de pesagem hexagonais tamanho S	Sigma-Aldrich	Z708577	Hexagonal, poliestireno, 25 mm Diâmetro interno inferior, 38 mm Diâmetro interno superior
Tesoura cirúrgica grande	VWR	233-1211	Limpar e autoclave antes de usar
Pinça longa	VWR	232-0096	Limpar e autoclave antes de usar
Penicilina e estreptomicina	Sigma-Aldrich	P4333-100ml	Estabilizado, com 10.000 unidades de penicilina e 10 mg de estreptomicina/mL, 0,1 μ m filtrado. Armazene a -20 graus C.  A solução  deve ser aliquotado em volumes de trabalho menores para evitar ciclos repetidos de congelamento/descongelamento Solução.
Pipetadeira	Eppendorf	613-2795	Eppendorf Easypet® 3
Tabuleiro de plástico	VWR	BELAH162620000	Tabuleiro de plástico de polipropileno à prova de corrosão
Cloreto de potássio	Sigma-Aldrich	P9333	Fosfato
potássio em pó Monobásico	Sigma-Aldrich	P5665
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S7653
Dodecil Sulfato de Sódio	em Pó Sigma-Aldrich	62862	Fosfato
Sódio em Pó Dibásico	Sigma-Aldrich	94046
Espátula	VWR	RSGA038.210	Limpar e autoclave antes de usar
Colher	VWR	231-1314	Limpar e autoclave antes de usar
Barra de agitação	VWR	442-0362	Limpar e autoclave antes de usar
Agitador VWR		89026-262	Moldado em PTFE puro, aprovado pela FDA,
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Líquido

de pó de em pó de em Pó