Descelularização para a Preparação de Matriz de Pele Acelular Humana Altamente Preservada para Medicina Regenerativa

Resumo

A pele humana descelularizada é adequada para a regeneração de tecidos. Uma questão importante da descelularização é a preservação da arquitetura nativa, juntamente com o conteúdo apropriado de proteínas estruturais, glicosaminoglicanos (GAGs) e fatores de crescimento. O método proposto permite uma descelularização rápida e eficaz, produzindo pele descelularizada com traços nativos bem preservados.

Resumo

A matriz extracelular (MEC) fornece estímulos biofísicos e bioquímicos para apoiar a auto-renovação, proliferação, sobrevivência e diferenciação das células circundantes devido ao seu conteúdo de diversas moléculas bioativas. Devido a essas características, a ECM tem sido recentemente considerada uma candidata promissora para a criação de scaffolds biológicos para impulsionar a regeneração tecidual. Estudos emergentes demonstraram que tecidos humanos descelularizados podem se assemelhar à ECM nativa em seus perfis estruturais e bioquímicos, preservando a arquitetura tridimensional (3D) e o conteúdo de moléculas biológicas fundamentais. Assim, a MEC descelularizada pode ser empregada para promover a remodelação tecidual, reparo e reconstrução funcional de muitos órgãos. A seleção do procedimento de descelularização adequado é crucial para obter tecidos acelulares que retenham as características do microambiente ideal para as células.

O protocolo descrito aqui fornece uma descrição detalhada passo a passo do método de descelularização para obter uma ECM biológica livre de células reprodutível e eficaz. Fragmentos de pele de pacientes submetidos à cirurgia plástica foram reduzidos e descelularizados usando uma combinação de dodecilsulfato de sódio (SDS), Triton X-100 e antibióticos. Para promover o transporte regular e homogêneo da solução através das amostras, elas foram fechadas em embutidos para garantir a proteção contra insultos mecânicos. Após o procedimento de descelularização, a cor branca como a neve dos fragmentos de pele indicou descelularização completa e bem-sucedida. Além disso, as amostras descelularizadas mostraram uma arquitetura intacta e bem preservada. Os resultados sugerem que o método de descelularização proposto foi eficaz, rápido e reprodutível e protegeu as amostras de danos arquitetônicos.

Introdução

A MEC serve como um andaime para as células, sustentando-as por meio de uma intrincada arquitetura mantida por diferentes componentes, e é um dos principais fatores responsáveis pelas propriedades mecânicas do coração e da função do tecido cardíaco ^1,2. Evidências crescentes sugerem que a MEC desempenha um papel ativo na remodelação tecidual, tornando obsoleta a suposição convencional de que a MEC é um componente passivo 3,4,5,6. O papel da ECM é fornecer pistas biofísicas e bioquímicas para as células residentes. Está bem estabelecido que esses sinais podem influenciar muitos comportamentos celulares fundamentais, impactando sua função contrátil, proliferação, migração e potencial de diferenciação ^7,8,9. Assim, a MEC está sendo cada vez mais empregada na engenharia de tecidos e na medicina regenerativa como ferramenta de suporte terapêutico 9,10,11,12,13.

A MEC consiste em várias proteínas, como colágeno, elastina, fibronectina, proteoglicano e laminina, juntamente com fatores de crescimento ligados à MEC, todos envolvidos em mecanismos de regeneração, como recrutamento, migração e diferenciação celular, bem como alinhamento e proliferação celular¹⁴. As propriedades mecânicas dos tecidos também têm grande relevância na fisiopatologia dos órgãos. De fato, mudanças nas propriedades mecânicas são frequentemente associadas ao aparecimento e à evolução de várias doenças. A razão reside no fato de que, quando a MEC é modificada, os sinais vindos do ambiente induzem alterações na expressão gênica e proteica, levando ao comprometimento funcional^15,16.

As terapias regenerativas para reparo de órgãos estão atualmente focadas em replicar o sofisticado microambiente do tecido nativo para curar o órgão onde o corpo falha. Apesar do ritmo acelerado de muitas abordagens de engenharia de tecidos, os tecidos ainda não podem ser reproduzidos com precisão em sua totalidade e complexidade por procedimentos artificiais. Os materiais sintéticos têm sido amplamente empregados até agora, pois podem ser ajustados adequadamente para simular as propriedades mecânicas e bioquímicas do microambiente celular. No entanto, eles têm limites, como a incapacidade de mimetizar as inúmeras interações dentro do tecido nativo, o custo das tecnologias para produzi-los e o fato de serem menos naturais e biocompatíveis do que o tecido nativo 17,18,19. Além disso, sua composição, principalmente em termos de proteínas e fatores solúveis, difere muito da natural, que é extremamente difícil de replicar²⁰.

A abordagem de ponta na medicina regenerativa para reduzir a lacuna entre os pacientes necessitados e os transplantes de órgãos é produzir andaimes feitos de matriz extracelular descelularizada (d-ECM) e repovoá-los com os tipos de células apropriados para regenerar os órgãos danificados. A descelularização é o processo no qual a MEC é isolada de suas células nativas e material genético para produzir um arcabouço natural e biomimético, capaz de evitar a resposta imune e a rejeição uma vez implantado nos pacientes 21,22,23. A ECM assim obtida pode então ser repovoada para produzir tecido funcional. O principal problema ao desenvolver um d-ECM é o método. Para qualquer técnica de descelularização, o objetivo principal continua sendo a preservação da composição, rigidez e estrutura 3D nativas do ECM, e todas as estratégias têm vantagens e desvantagens. Como a eliminação do conteúdo celular e do DNA do tecido requer o uso de agentes químicos ou físicos, ou a combinação de ambos, cada procedimento de descelularização causa, em diferentes graus, a ruptura da MEC. Portanto, é crucial minimizar os danos à ECM 24,25,26.

A utilização da ECM nativa como plataforma para a reconstituição da ECM nativa in vitro é altamente desejável. Para tanto, vários protocolos de descelularização têm sido aplicados a uma ampla gama de tecidos 27,28,29,30. De fato, desde os estágios iniciais da pesquisa de descelularização e desenvolvimento da MEC, vários tecidos, como artérias, válvulas aórticas e nervos periféricos de animais e humanos, foram descelularizados, e alguns d-ECMs ainda estão disponíveis comercialmente e são usados para substituição de tecidos ou cicatrização de feridas 31,32,33. Recentemente, a pele humana também emergiu como uma candidata adequada para a produção de scaffolds descelularizados para reparo cardíaco devido à sua composição e propriedades mecânicas, capazes de aumentar o potencial regenerativo das células progenitoras cardíacas (CPCs) e se adaptar à contratilidade cardíaca³⁴. Este trabalho descreve um protocolo simples e rápido para produzir scaffolds descelularizados a partir de pele humana adulta, permitindo o desenvolvimento de um d-ECM com arquitetura bem preservada.

Protocolo

As amostras de tecido humano foram coletadas de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque e observando as diretrizes do Hospital Universitário "Federico II". Todos os pacientes envolvidos neste estudo forneceram o termo de consentimento livre e esclarecido.

1. Preparação das soluções

1. Preparação de 1200 mL de solução descelularizante a 1%
   1. Preparar 600 ml de solução Triton X-100 a 2% medindo 588 ml de água bidestilada num cilindro graduado e transferindo-a para um copo de 1 L. Com uma pipeta serológica, adicione 12 ml de Triton X-100 e uma barra de agitação ao copo. Colocar o copo num agitador magnético e misturar a solução até que o Triton X-100 esteja completamente dissolvido.
   2. Pare a agitação. Remova a barra de agitação usando um recuperador de barra de agitação. Armazene em temperatura ambiente.
   3. Preparar 600 ml de solução SDS a 2% medindo 550 ml de água bidestilada num cilindro graduado e transferindo-a para um copo de 1 L.
   4. Pesar 12 g de pó de FDS num recipiente de pesagem de plástico e transferi-lo para o copo que contém a água bidestilada no passo 1.1.3.
      NOTA: A etapa 1.1.4 deve ser executada sob um capuz químico e o usuário deve usar equipamento de proteção individual.
   5. Adicione uma barra de agitação, coloque o copo em um agitador magnético e misture a solução até que a SDS esteja completamente dissolvida.
   6. Pare o processo de agitação. Remova a barra de agitação usando um recuperador de barra de agitação.
   7. Transferir a solução para um cilindro graduado e ajustar o volume para 600 ml adicionando água bidestilada
   8. Despeje a solução Triton X-100 a 2% preparada na etapa 1.1.1 em um cilindro de 2 L.
   9. Despeje a solução SDS a 2% preparada nas etapas 1.1.3-1.1.7 no mesmo cilindro de 2 L para obter um volume total de 1200 mL.
   10. Cobrir com parafilme e misturar delicadamente por inversão para obter uma solução homogénea.
   11. Transfira a solução misturada para um frasco de 2 L usando um funil para evitar a formação de espuma. Conservar a solução a +4 °C.
2. Preparação de 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS)
   1. Prepare 500 mL de 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) dissolvendo 0,1 g de fosfato de potássio monobásico, 0,1 g de cloreto de potássio, 4,0 g de cloreto de sódio e 0,575 g de fosfato de sódio dibásico em água dupla destilada estéril. Verifique o valor do pH (7.4).
   2. Conservar a +4 °C até à utilização.
3. Preparação da solução antibiótica
   1. Pesar 625 μg de anfotericina B num recipiente de pesagem de plástico.
   2. Pipete 8 mL de uma mistura de penicilina e estreptomicina (caneta / estreptococos) em um tubo de 15 mL.
   3. Adicione a anfotericina B pesada à mistura caneta / estreptococos e ajuste o volume para 10 mL adicionando a mistura de penicilina e estreptomicina (caneta / estreptococos). Tampe o tubo e dissolva a anfotericina B agitando vigorosamente.

2. Dia 1 - inicie o procedimento de descelularização.

1. Despeje 400 mL da solução descelularizante em um béquer de 500 mL.
2. Adicione 2,0 mL da solução antibiótica.

3. Preparação de amostras cutâneas

1. Lave a amostra de pele humana do abdômen de pacientes submetidos à abdominoplastia em uma bandeja de plástico, dobrando-a e virando-a de cabeça para baixo em uma solução fisiológica isotônica de NaCl a 0,9% para remover o excesso de sangue e outros fluidos biológicos.
2. Remova o cabelo usando uma pinça fina e a gordura usando uma tesoura cirúrgica grande.
3. Colocar a amostra de pele na placa dissecadora e dissecá-la com bisturi, tendo como referência as graduações na placa dissecadora para obter fragmentos de 3 cm x 2,5 cm (comprimento por largura), evitando cicatrizes e áreas sujas ou queimadas do tecido.
4. Coloque cada fragmento em um de embutimento, feche-o e certifique-se de que todos os estejam devidamente travados para evitar vazamento da amostra durante o procedimento de descelularização.
5. Colocar um máximo de quatro de embutir com amostras num copo com a solução descelularizante. Adicione uma barra de agitação. Cubra com papel alumínio, escrevendo na parte superior todas as informações para identificar a amostra e a hora de início do procedimento.
6. Colocar o copo sobre o agitador magnético e iniciar a agitação a uma velocidade de rotação de 150 rpm. Pare a agitação. Remova a folha de alumínio que cobre o béquer e retire os de embutir com uma pinça longa.
   NOTA: Depois de parar a agitação, verifique a clareza da solução. Modifique a duração da agitação (menos ou mais de 8 horas) com base no grau de turvação devido à liberação de detritos celulares.
7. Coloque cada em um prato de 100 mm. Substitua a solução descelularizante repetindo as etapas 3.5-3.6 durante a noite.

4. Dia 2 - verifique o estado das amostras de pele.

1. Pare o processo de agitação. Remova a folha de alumínio que cobre o béquer e retire os de embutir com uma pinça longa.
2. Coloque cada em um prato de 100 mm e abra-o. Verifique a cor da amostra.
   NOTA: As amostras podem mostrar uma mudança de cor do bege nativo para o branco como a neve.
3. Remova os pelos residuais e separe a epiderme da derme. Substitua a solução descelularizante repetindo as etapas 3.5-3.6.
4. Pare a agitação após 8 h. Repita as etapas 4.1 a 4.2 até que a amostra pareça branca como a neve. Pare o procedimento de descelularização.
   NOTA: O tempo de exposição à ação dos detergentes pode ser estendido, se necessário.
5. Meça 400 mL de 1x PBS em um cilindro de 500 mL, despeje em um béquer de 500 mL e adicione 2 mL da mistura de Pen Strep/Anfotericina B. Adicione uma barra de agitação.
6. Colocar um máximo de quatro contendo as amostras em cada copo com a solução 1x PBS/antibióticos. Cubra com papel alumínio e escreva todas as informações na parte superior como na etapa 3.5.
7. Colocar o copo num agitador magnético e iniciar a agitação a uma velocidade de rotação de 150 rpm durante a noite, à temperatura ambiente.

5. Dia 3 - uma lavagem final das amostras

1. Pare a agitação. Substitua a solução 1x PBS por 400 mL de água bidestilada Adicione uma barra de agitação. Cubra com papel alumínio e escreva todas as informações no topo como na etapa 3.5.
2. Colocar o copo num agitador magnético e iniciar a agitação a uma velocidade de rotação de 150 rpm durante 30 min.
3. Pare o processo de agitação. Remova a folha de alumínio que cobre o béquer e retire os de embutir com uma pinça longa.
4. Coloque cada de incorporação contendo a amostra de pele descelularizada em um prato de 100 mm. Abra os e seque suavemente as amostras de pele, esfregando-as em lenços umedecidos.
5. Colocar cada amostra de pele descelularizada num recipiente de pesagem previamente marcado com as informações sobre a amostra. Cubra o barco com papel alumínio e escreva todas as informações na parte superior para identificar a amostra. Conservar a - 80 °C.

Resultados

O objetivo do protocolo foi obter uma amostra de d-ECM de pele de tecido biológico, mantendo uma estrutura 3D bem organizada e um conteúdo bem preservado de moléculas biológicas (Figura 1). Este método baseia-se principalmente na agitação constante das amostras em uma solução contendo a combinação de dois detergentes, Triton X-100 e SDS, preservando assim as características biológicas e estruturais típicas do tecido nativo e reduzindo o tempo de exposição durante o processo de descelularizaç...

Discussão

Embora o protocolo descrito acima tenha sido otimizado e aprimorado em comparação com os protocolos publicados anteriormente, ele apresenta algumas etapas críticas que precisam de atenção e precisão. A formação de espuma deve ser evitada durante a preparação da solução descelularizante para evitar a diluição incorreta dos detergentes. Isso pode ser resolvido despejando suavemente as soluções e fazendo-as fluir ao longo do lado interno do cilindro. Além disso, deve-se ter cuidado ao remov...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,9% NaCl isotônico Solução fisiológica	Sigma-Aldrich	S8776	0,9% em água
Copo de 1 L	VWR	511-0318	Limpe e autoclave antes do uso
Pipeta sorológica de 10 mL	Falcon	357551	Estéril,  placas de poliestireno
de 100 mm	Falcon	351029	Placa de cultura de células estéreis tratada
com 15 mL de tubos estéreis	Falcon	352097	Tubos estéreis para centrífugas, polipropileno
cilindro graduado de 1 L	VWR	612-1524	Limpar e autoclave antes de usar
Frasco de 2 L	VWR	215-1596	Limpar e autoclave antes de usar
Pipeta serológica de 25 mL	Falcon	357525	Estéril,  poliestireno
2 L cilindro graduado	VWR	612-3072	Limpar e autoclave antes de utilizar
Copo de 500 ml	VWR	511-0317	Limpar e autoclave antes de utilizar
Anfotericina B	Sigma-Aldrich	Y0000005	Placa
de dissecação	VWR	100498-398	Fabricada em polietileno de alta densidade.
Bisturi de dissecação	VWR	233-5526	de embutir estéreis e descartáveis
	Diapath	070191	Dimensões externas: 40x26x7 mm (LxPxA)
Pinça fina	VWR	232-1317	Limpar e autoclave antes de utilizar
Funil	VWR	221-1861	Limpar e autoclave antes de utilizar
Barcos de pesagem hexagonais tamanho M	Sigma-Aldrich	Z708585	Hexagonal, poliestireno, 51 mm de diâmetro interno inferior, 64 mm de diâmetro interno superior
Barcos de pesagem hexagonais tamanho S	Sigma-Aldrich	Z708577	Hexagonal, poliestireno, 25 mm Diâmetro interno inferior, 38 mm Diâmetro interno superior
Tesoura cirúrgica grande	VWR	233-1211	Limpar e autoclave antes de usar
Pinça longa	VWR	232-0096	Limpar e autoclave antes de usar
Penicilina e estreptomicina	Sigma-Aldrich	P4333-100ml	Estabilizado, com 10.000 unidades de penicilina e 10 mg de estreptomicina/mL, 0,1 μ m filtrado. Armazene a -20 graus C.  A solução  deve ser aliquotado em volumes de trabalho menores para evitar ciclos repetidos de congelamento/descongelamento Solução.
Pipetadeira	Eppendorf	613-2795	Eppendorf Easypet® 3
Tabuleiro de plástico	VWR	BELAH162620000	Tabuleiro de plástico de polipropileno à prova de corrosão
Cloreto de potássio	Sigma-Aldrich	P9333	Fosfato
potássio em pó Monobásico	Sigma-Aldrich	P5665
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S7653
Dodecil Sulfato de Sódio	em Pó Sigma-Aldrich	62862	Fosfato
Sódio em Pó Dibásico	Sigma-Aldrich	94046
Espátula	VWR	RSGA038.210	Limpar e autoclave antes de usar
Colher	VWR	231-1314	Limpar e autoclave antes de usar
Barra de agitação	VWR	442-0362	Limpar e autoclave antes de usar
Agitador VWR		89026-262	Moldado em PTFE puro, aprovado pela FDA,
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Líquido