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Artigo de método

Detecção de expressão receptora acoplada à proteína G em neurônios aferentes do mouse vagal usando multiplex in situ hibridização

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DOI:

10.3791/62945

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20 de setembro de 2021

 , 
1Center for Hypothalamic Research and Department of Internal Medicine, UTSouthwestern Medical Center at Dallas

Neste artigo

Resumo

Multiplex in situ hibridização (ISH) foi empregado para visualizar simultaneamente as transcrições de dois receptores acoplados à proteína G e um fator de transcrição em todo o complexo gônico vagal do camundongo adulto. Este protocolo poderia ser usado para gerar mapas precisos dos perfis transcritivos de neurônios aferentes vagal.

Resumo

Este estudo descreve um protocolo para o multiplex in situ hibridização (ISH) do gânglio jugular-nodose do mouse, com ênfase especial na detecção da expressão de receptores acoplados à proteína G (GPCRs). A gália jugular-nodose com formalina fixa foi processada com a tecnologia RNAscope para detectar simultaneamente a expressão de dois GPCRs representativos (receptores de colecistocina e grelina) em combinação com um gene marcador de nodose (homeobox emparelhado 2b, Phox2b) ou neurônios afferent (proteína de dedo de zinco 12, Prdm12). Os gânglios rotulados foram imagens usando microscopia confocal para determinar os padrões de distribuição e expressão das transcrições acima mencionadas. Resumidamente, os neurônios aferentes phox2b foram encontrados para expressar abundantemente o receptor de colecistocina (Cck1r), mas não o receptor de grelina (Ghsr). Um pequeno subconjunto de neurônios aferentes Prdm12 também foi encontrado para expressar Ghsr e/ou Cck1r. Potenciais ressalvas técnicas no projeto, processamento e interpretação do MULTIPLEX ISH são discutidas. A abordagem descrita neste artigo pode ajudar os cientistas a gerar mapas precisos dos perfis transcritivos de neurônios aferentes vagal.

Introdução

Os corpos celulares de afferents vagais estão contidos na jugular, petrosal e nodose ganglia1,2,3. Seus axônios viajam juntos através de vários ramos do nervo vago para os territórios craniocervical, torácico e abdominal4,5,6,7. A partir de seus finais viscerais, os aferentes vagais podem responder a uma ampla gama de estímulos fisiológicos e nocivos8,9,10. No entanto, a distribuição de moléculas de sinalização e receptores envolvidos no sensor de detecção vagal permanece pouco caracterizada. Isso ocorre em parte porque os gânglios vagais, apesar de seu pequeno tamanho, expressam um amplo espectro de receptores, incluindo um grande número de GPCRs8,11,12,13. Além disso, os neurônios aferentes vagal são inerentemente heterogêneos e apresentam perfis moleculares distintos14. Para complicar a questão, a jugular, petrosal e nodose gânglios estão presos no rato, formando assim uma única massa gangliônica. Por último, em um subconjunto de animais, o gânglio de nodose é ligado ao simpático gânglio cervical superior15.

No passado, os pesquisadores recorreram à imunohistoquímica para estudar a maquiagem neuroquímica dos neurônios aferentesvagal 16,17,18. Embora a imunohistoquímica usando anticorpos validados seja útil, os resultados de estudos imunohistoquímicos devem ser interpretados com cautela. Por exemplo, inúmeros esforços para identificar anticorpos específicos contra GPCRs falharam19,20,21,22,23,24,25, levando os investigadores a concluir que a maioria dos anticorpos contra GPCRs não são confiáveis. Para contornar essas questões, o PCR quantitativo (qPCR) tem sido amplamente utilizado para avaliar a expressão genética na massa gangliônica do rodente vagal26,27,28,29. No entanto, examinar a expressão genética usando qPCR ocorre ao custo de uma perda de informações espaciais. Em particular, não se pode prever quantas células ou quais tipos de células expressam um determinado gene de interesse (por exemplo, nodose vs. células jugulares). As questões recorrentes também incluem a contaminação com tecidos adjacentes e a inclusão de comprimentos variáveis do nervo vago, gânglio cervical superior e jugular durante a dissecação15. Como resultado das dificuldades acima, a controvérsia envolve a expressão e distribuição de vários GPCRs em neurônios aferentes vagal. Um exemplo particularmente intrigante diz respeito ao receptor de grelina (Ghsr). Considerando que alguns estudos encontraram expressão generalizada deste receptor em neurônios aferentes vagal30,31,32, outros descobriram que Ghsr mRNA é quase indetectável no gânglio nodose11,14. O mapeamento detalhado do MRNA ghsr na massa gânnica vagal é, portanto, justificado.

A hibridização in situ (ISH) também tem sido utilizada para avaliar padrões de expressão genética na massa gânnica vagal7,11,12,33,34,35. Como as técnicas baseadas em RNA permanecem mais confiáveis e específicas do que as técnicas baseadas em anticorpos na maioria das circunstâncias36,37, estudos do ISH têm se mostrado valiosos para uma melhor compreensão da codificação neuroquímica de neurônios aferentes vagais. No entanto, as técnicas tradicionais do ISH em si não são sem ressalvas. O ISH radioativo é sensível, mas gera antecedentes e permanece pesado38. O ISH não radioativo é menos complicado, mas também menos sensível38. Em contraste, o método RNAscope ISH recentemente desenvolvido é altamente sensível e gera um mínimo de fundo39. O presente estudo aplicou o RNAscope fluorescente multiplex à detecção de GPCRs em neurônios aferentes do camundongo. Focamos no mapeamento da distribuição de Ghsr e comparamos sua distribuição com a do receptor de colecistocina (Cck1r), outro GPCR bem conhecido por ser expresso no gânglio34. Por fim, os dois fatores de transcrição, homeobox emparelhado 2b (Phox2b) e proteína de dedo de zinco de domínio pr 12 (Prdm12), foram usados como marcadores seletivos para neurônios aferentes de nodose e jugular,respectivamente 14. Sem visualizar Phox2b ou Prdm12, seria desafiador identificar as diferenças jugular vs. nodose com certeza. Potenciais armadilhas técnicas também são discutidas ao longo do artigo.

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Protocolo

NOTA: Os camundongos utilizados neste estudo eram machos do tipo selvagem em um fundo C57BL/6J puro. Um total de 4 camundongos foram usados para multiplex ISH. Todos os ratos tinham aproximadamente 8 semanas de idade na época do sacrifício. Um rato macho (aproximadamente um ano de idade) também foi usado para demonstrar fluorescência endógena associada ao envelhecimento. Os animais estavam alojados em gaiolas ventiladas dentro de uma instalação de barreira com acesso a ad libitum a alimentos e água. O Comitê de Cuidados e Uso Institucional de Animais do Centro Médico do Sudoeste da UT Southwestern analisou e aprovou os procedimentos descritos abaixo. Detalhes sobre reagentes e ferramentas podem ser encontrados na Tabela de Materiais.

1. Coleta de amostras

  1. No dia do sacrifício, administre uma overdose de hidrato de cloro (500 mg/kg, i.p.) aos camundongos. Perfume os camundongos profundamente anestesiados transcardialmente usando uma bomba peristáltica com 5 mL de soro fisco tamponado de fosfato de 1x (PBS), seguido por 50 mL de 10% de formalina à temperatura ambiente.
    NOTA: Isto é feito em um capô de fumaça para evitar a inalação de formalina.
  2. À medida que a gânglios nodose, petrosal e jugular são fundidos para formar uma única massa gangliônica no rato15, coletar cuidadosamente toda a massa gânnica vagal de cada lado (esquerda e direita) com a ajuda de um escopo dissecando e tesouras de mola fina e fórceps (ver a Tabela dos Materiais).
  3. Ao decapitar o rato com um par de tesouras grandes (veja a Tabela de Materiais),evite esmagar o tronco cerebral.
  4. Seguindo uma abordagem de dissecção descrita antes no rato40,remova os músculos esternonóides e omohioides laterais à traqueia com pequenos fórceps(Tabela de Materiais) para expor o osso occipital. Limpe toda a região do músculo, tecido adiposo e tecido conjuntivo até que a artéria carótida, o nervo vago, o nervo hipoglossal e o foien magnum sejam visíveis. Corte todo o nervo hipoglossal com uma pequena tesoura de mola(Tabela de Materiais).
  5. Procure o gânglio de nodose como uma massa translúcida perto do foramen magnum15. Utilizando uma tesoura pequena(Tabela de Materiais),quebre cuidadosamente o osso occipital para expor ainda mais o gânglio jugular. Procure por melanócitos negros na superfície da jugular como um marco visual.
  6. Corte os apegos nervosos entre a massa gangliônica vagal e extraia toda a massa gangliônica puxando suavemente a extremidade periférica do nervo vago enquanto simultaneamente corta o gânglio jugular em direção ao tronco cerebral com uma pequena tesoura de mola(Tabela de Materiais).
  7. Remova o tecido conjuntivo e a gordura grudando no nervo vago e na massa gangliônica o máximo possível.
  8. Como é fácil perder um gânglio durante a transferência de um tubo para o outro, mantenha ~0,5 cm do nervo vago para facilitar o manuseio e localização das amostras.
  9. Coloque gânglios com a ajuda de fórceps finos em tubos de microcentrifus de 1,5 mL e incubar a 4 °C em formalina por 24h e com 30% de sacarose por mais 24 h.
  10. Posicione o gânglio dentro de uma pequena gota (~4 mm Ø) do meio de temperatura de corte ideal (OCT) em um pedaço de papel alumínio. Em seguida, congele a amostra em um leito de gelo seco.
  11. Corte as amostras com um criostat a -20 °C em seções de 14 μm de espessura e colete em lâminas de microscópio de vidro como 3 séries 42 μm de distância.
    NOTA: Evite colocar seções próximas às bordas do slide. Para salvar os reagentes, mantenha as seções de tecido o mais apertadas possível, mas sem sobrepor.
  12. Armazene as amostras em um congelador de -80 °C até que seja necessário para ish por pelo menos 6 meses.
    NOTA: Consulte a Figura 1 para solucionar problemas para fluorescência endógena.

2. Pré-tratamento e ISH

  1. Antes do dia dos experimentos, vidros de laboratório autoclave para serem usados para ISH, incluindo pratos de coloração e frascos de tampão de lavagem.
    NOTA: Enquanto trabalhar em condições sem RNase não é crítico, use luvas o tempo todo. Mantenha as garrafas de solução de descontaminação RNase(Tabela de Materiais) ao alcance no caso de suspeita de contaminação.
  2. No primeiro dia, leve os slides à temperatura ambiente em um banco especificamente dedicado ao ISH. Enxágüe os slides em 1x PBS e asse-os por 30 minutos a 60 °C em um forno de cozimento(Tabela de Materiais).
  3. Corrija os slides em 4% de formalina para 15 min a 4 °C.
  4. Leve os reagentes no kit multiplex(Tabela de Materiais)para temperatura ambiente.
  5. Desidratar os slides em 50%, 70% e 100% etanol por 5 min cada. Aplique solução H2O2 às amostras por 10 minutos e depois enxágue em água duplamente destilada (ddH2O).
  6. Trate as amostras com o reagente de recuperação alvo por 5 min, enxágue em ddH2O seguido de 100% etanol e ar-seca. Usando uma caneta hidrofóbica, crie uma barreira ao redor das amostras.
    NOTA: Não aplique a barreira hidrofóbica muito próxima das seções teciduais.
  7. Aplique protease por 30 min a 40 °C em forno de hibridização(Tabela de Materiais).
  8. Enquanto isso, pré-aquece as sondas a 40 °C e esfrie-as à temperatura ambiente antes de usar. Incubar os slides com a combinação desejada de sondas-alvo (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; ou Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) por 2h a 40 °C em um forno de hibridização.
  9. Incubar tecido de controle negativo com a sonda C1 (Dihydrodipicolinate reductase) por 2h a 40 °C em forno de hibridização.
  10. Enxágüe os slides no tampão de lavagem e armazene durante a noite em 5x citrato de sódio salino (SSC) à temperatura ambiente. Por conveniência, divida o experimento em dois dias. No dia seguinte, enxágue os slides com tampão de lavagem e incuba-os com reagentes de amplificação listados abaixo (veja o manual do usuário na Tabela de Materiais).
  11. Aplique AMP1 (30 min a 40 °C), AMP2 (30 min a 40 °C) e AMP 3 (15 min a 40 °C). Enxágüe no tampão de lavagem entre cada passo.
  12. Dissolva cada corante opala (Tabela de Materiais) em sulfóxido de dimetil e armazene as soluções a 4 °C até que seja necessário.
  13. Para o canal 1, incubar os slides com HRP-C1 (15 min a 40 °C) e Opal 520 (cor verde; diluição 1/1.500; 30 minutos a 40°C). Enxágüe no tampão de lavagem entre cada passo.
  14. Para o canal 2, incubar os slides com HRP-C2 (15 min a 40 °C) e Opal 570 (cor amarela; diluição 1/1.500; para 30 min a 40 °C). Enxágüe no tampão de lavagem entre cada passo.
  15. Para o canal 3, incubar os slides com HRP-C3 (15 min a 40 °C) e Opal 690 (cor vermelha distante; diluição 1/1.500; para 30 min a 40 °C). Enxágüe no tampão de lavagem entre cada passo.
  16. Lave os slides e exponha-os a 4′,6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI) por 30 s.
  17. Aplique imediatamente o meio de montagem em cada lâmina e coloque uma mancha de cobertura sobre a seção tecidual.
  18. Mantenha os tecidos horizontais em um suporte de deslizamento a 4 °C até a imagem.

3. Microscopia e análise de dados

NOTA: Os dados multiplex ISH podem ser visualizados com uma ampla gama de instrumentos com os filtros apropriados. No entanto, um método de imagem preferido é a microscopia confocal com objetivos de 20x e 63x (óleo); referem-se à discussão pelas razões. Consulte a Figura 2 para determinar a relação sinal-ruído ideal.

  1. Use um microscópio confocal equipado com linhas laser de 488, 561 e 633 nm. Use os seguintes parâmetros de aquisição (ver Tabela 1): Opal 690 (HeNe 633 nm, faixa de detecção 668-696 nm, potência 2.0, ganho 724); Opala 570 (laser DPSS 561 nm, faixa de detecção 579-627 nm,
  2. Para melhorar a qualidade das imagens, adquira com uma média de linha de 4 e um tamanho de pixel de pelo menos 1024 x 1024.
    NOTA: Os parâmetros acima são fornecidos apenas como exemplo, e modificações são recomendadas dependendo de um instrumento, ampliação (20x ou 63x), níveis de expressão e níveis endógenos de fluorescência para qualquer tecido.
  3. Uma vez satisfeito com os parâmetros de aquisição, colete imagens usando as mesmas configurações. Atribua cores falsas a cada canal para facilitar a visualização.
    NOTA: Por exemplo, vermelho (Phox2b ou Prdm12), ciano (Cck1r), amarelo (Ghsr) e cinza (DAPI).
  4. Realize a contagem de células usando as imagens digitais identificando o contorno de perfis RNAscope positivos com um núcleo levemente manchado com DAPI. Calcule a porcentagem de perfis rnascope-positivos expressando cada transcrição [Figura 3A-C].
  5. Para melhorar o rigor e a precisão das estimativas, conte pelo menos 2.000 perfis neuronais de pelo menos 4 animais diferentes. Faça a contagem de gânglios esquerdo e direito separadamente.
  6. Insira os dados em um gráfico de tortas com o número total de perfis contados.
  7. Use software de imagem para adquirir imagens e costurar imagens 20x. Use ImageJ-Fiji e outro software de foto e design para gerar as placas finais. Aplique ajustes de contraste e leveza uniformemente a todas as imagens.

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Resultados

Embora o RNAScope possa ser aplicado a animais de qualquer idade, sexo ou origem genética, é aconselhável trabalhar com adultos jovens (<3 meses de idade). Isso ocorre porque artefatos fluorescentes (por exemplo, lipofuscina) são achados comuns em neurônios de animais mais velhos41. Os gânglios fixos formalina de camundongos mais velhos geralmente contêm fluorescência endógena surpreendentemente intensa que pode ser facilmente confundida com coloração genuína(Figura 1A

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Discussão

A técnica do ISH foi inventada no final da década de 196042. No entanto, não é até meados da década de 1980 que foi aplicado para a detecção de mRNAs nos sistemas nervosos central e periférico43,44. Considerando a heterogeneidade do sistema nervoso e questões recorrentes com anticorpos, a localização de uma transcrição específica no nível celular continua sendo uma ferramenta inestimável. No entanto, os métodos tradicionais do ISH têm perm...

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Divulgações

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Núcleo de Neuronatomia/Histologia/Injeção Cerebral financiado pela concessão do NIH #5P01DK119130-02. Os autores gostariam de reconhecer a assistência do UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (liderado pelo Dr. Phelps) e sua equipe (Abhijit Bugde e Marcel Mettlen), apoiado em parte pelo NIH Grant #1S10OD021684-01, um recurso compartilhado do Centro de Câncer Harold C. Simmons, apoiado em parte por uma subvenção de apoio ao Centro de Câncer NCI, P30 CA142543.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10xPBS Fisher ScientificBP399-4
20x SSCInvitrogenAM9763-80
° C freezerPHCBIMDF-DU901VHA-PA
Adobe Photoshop 2021Adobe software de foto e design
Forno de cozimentoThermo ScientificModelo: 658
Microscópio confocalZeissLSM880 Airyscan
Vidro de coberturaBrain Research Laboratories2460-1.5D
CryostatLeicaCM 3050 S
Dumont #5 FórcepsF.S.T.11252-20
EcomountBiocare MedicalEM 897Lmeio de montagem
HybEZ fornode hibridização forno
Caneta hidrofóbicaVector LaboratoriesH-4000
ImageJ-FijiNIH
Tesoura grandeHenry Schein100-7561
Micro tubos de centrífugaVWR20170-333
Minibomba de fluxo variávelFisher Scientific13-876-1
Opal 520Akoya biosciencesFP1 1487001KTBiomarcador fluorescente
Opal 570Akoya biosciencesFP1 1488001KTBiomarcador fluorescente
Opal 690Akoya biosciencesFP1 1497001KTBiomarcador fluorescente
ProLong Gold Meio de montagem antifade Mountantpara células marcadas com fluorescência
RNAscope Multiplex Kit de Reagentes Fluorescentes v2ACD / Bio-Techne323100kit multiplex
Sonda RNAscope Mouse Cck1r-C3ACD / Bio-Techne313751-C3
Sonda RNAscope Mouse DapBACD / Bio-Techne310043
Sonda RNAscope Mouse GhsrACD / Bio-TechneSonda 426141
RNAscope Mouse Phox2b-C2ACD / Bio-Techne407861-C2
Sonda RNAscope Mouse Prdm12-C2ACD / Bio-Techne524371-C2
RnaseZapSigmaR2020Rnase solução de descontaminação
Tesoura de dissecação pequenaMillipore SigmaZ265977
Superfrost Plus slidesFisherbrand1255015
Tissue Tek OCT mediumSakura4583
Manual do usuárioACD323100 USM
Vannas Spring ScissorsRobozRS 5620
ZEN Imaging SoftwareZeiss

Referências

  1. Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
  2. Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets within the vagal ganglia and the brainstem using reporter mice for Pirt, TRPV1, 5-HT3, and Tac1 expression. eNeuro. 7 (2), (2020).
  3. Atsumi, K., et al. Sensory neurons in the human jugular ganglion. Tissue and Cell. 64, 101344(2020).
  4. Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiological Reviews. 96 (3), 975-1024 (2016).
  5. Wang, F. B., Powley, T. L. Topographic inventories of vagal afferents in gastrointestinal muscle. Journal of Comparative Neurology. 421 (3), 302-324 (2000).
  6. Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anatomy and Embryology. 181 (2), 101-115 (1990).
  7. Gautron, L., et al. Melanocortin-4 receptor expression in a vago-vagal circuitry involved in postprandial functions. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 6-24 (2010).
  8. Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
  9. Chuaychoo, B., Hunter, D. D., Myers, A. C., Kollarik, M., Undem, B. J. Allergen-induced substance P synthesis in large-diameter sensory neurons innervating the lungs. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 116 (2), 325-331 (2005).
  10. Page, A. J., O'Donnell, T. A., Blackshaw, L. A. Opioid modulation of ferret vagal afferent mechanosensitivity. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology. 294 (4), 963-970 (2008).
  11. Egerod, K. L., et al. Profiling of G protein-coupled receptors in vagal afferents reveals novel gut-to-brain sensing mechanisms. Molecular Metabolism. 12, 62-75 (2018).
  12. Wang, J., et al. Distinct and common expression of receptors for inflammatory mediators in vagal nodose versus jugular capsaicin-sensitive/TRPV1-positive neurons detected by low input RNA sequencing. PLoS One. 12 (10), 0185985(2017).
  13. Bai, L., et al. Genetic identification of vagal sensory neurons that control feeding. Cell. 179 (5), 1129-1143 (2019).
  14. Kupari, J., Haring, M., Agirre, E., Castelo-Branco, G., Ernfors, P. An atlas of vagal sensory neurons and their molecular specialization. Cell Reports. 27 (8), 2508-2523 (2019).
  15. Bookout, A. L., Gautron, L. Characterization of a cell bridge variant connecting the nodose and superior cervical ganglia in the mouse: Prevalence, anatomical features, and practical implications. Journal of Comparative Neurology. 529 (1), 111-128 (2021).
  16. Gautron, L., Lee, C. E., Lee, S., Elmquist, J. K. Melanocortin-4 receptor expression in different classes of spinal and vagal primary afferent neurons in the mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (17), 3933-3948 (2012).
  17. Broberger, C., Holmberg, K., Kuhar, M. J., Hokfelt, T. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript in the rat vagus nerve: A putative mediator of cholecystokinin-induced satiety. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (23), 13506-13511 (1999).
  18. Yamamoto, Y., Henrich, M., Snipes, R. L., Kummer, W. Altered production of nitric oxide and reactive oxygen species in rat nodose ganglion neurons during acute hypoxia. Brain Research. 961 (1), 1-9 (2003).
  19. Grimsey, N. L., et al. Specific detection of CB1 receptors; cannabinoid CB1 receptor antibodies are not all created equal. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 78-86 (2008).
  20. Morozov, Y. M., et al. Antibodies to cannabinoid type 1 receptor co-react with stomatin-like protein 2 in mouse brain mitochondria. European Journal of Neuroscience. 38 (3), 2341-2348 (2013).
  21. Jelsing, J., Larsen, P. J., Vrang, N. Identification of cannabinoid type 1 receptor expressing cocaine amphetamine-regulated transcript neurons in the rat hypothalamus and brainstem using in situ hybridization and immunohistochemistry. Neuroscience. 154 (2), 641-652 (2008).
  22. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
  23. Hamdani, N., vander Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 403-407 (2009).
  24. Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 385-388 (2009).
  25. Goodman, S. L. The antibody horror show: an introductory guide for the perplexed. Nature Biotechnology. 45, 9-13 (2018).
  26. Liu, C., et al. PPARgamma in vagal neurons regulates high-fat diet induced thermogenesis. Cell Metabolism. 19 (4), 722-730 (2014).
  27. Zeeni, N., et al. A positive change in energy balance modulates TrkB expression in the hypothalamus and nodose ganglia of rats. Brain Research. 1289, 49-55 (2009).
  28. Kentish, S. J., Frisby, C. L., Kennaway, D. J., Wittert, G. A., Page, A. J. Circadian variation in gastric vagal afferent mechanosensitivity. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19238-19242 (2013).
  29. Peiser, C., et al. Dopamine D2 receptor mRNA expression is increased in the jugular-nodose ganglia of rats with nitrogen dioxide-induced chronic bronchitis. Neuroscience Letters. 465 (2), 143-146 (2009).
  30. Date, Y., et al. The role of the gastric afferent vagal nerve in ghrelin-induced feeding and growth hormone secretion in rats. Gastroenterology. 123 (4), 1120-1128 (2002).
  31. Meleine, M., et al. Ghrelin inhibits autonomic response to gastric distension in rats by acting on vagal pathway. Scientific Reports. 10 (1), 9986(2020).
  32. Zhang, W., et al. Functional interaction between Ghrelin and GLP-1 regulates feeding through the vagal afferent system. Scientific Reports. 10 (1), 18415(2020).
  33. Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
  34. Broberger, C., Holmberg, K., Shi, T. J., Dockray, G., Hokfelt, T. Expression and regulation of cholecystokinin and cholecystokinin receptors in rat nodose and dorsal root ganglia. Brain Research. 903 (1-2), 128-140 (2001).
  35. Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Research. 1319, 60-69 (2010).
  36. Hankin, R. C. In situ hybridization: principles and applications. Laboratory Medicine. 23, 764-770 (1992).
  37. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
  38. Dagerlind, A., Friberg, K., Bean, A. J., Hokfelt, T. Sensitive mRNA detection using unfixed tissue: combined radioactive and non-radioactive in situ hybridization histochemistry. Histochemistry. 98 (1), 39-49 (1992).
  39. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostic. 14 (1), 22-29 (2012).
  40. Norgren, R., Smith, G. P. A method for selective section of vagal afferent or efferent axons in the rat. American Journal of Physiology. 267 (4), Pt 2 1136-1141 (1994).
  41. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 719-730 (1999).
  42. Pardue, M. L., Gall, J. G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 64 (2), 600-604 (1969).
  43. Villar, M. J., et al. Upregulation of nitric oxide synthase and galanin message-associated peptide in hypothalamic magnocellular neurons after hypophysectomy. Immunohistochemical and in situ hybridization studies. Brain Research. 650 (2), 219-228 (1994).
  44. McAllister, L. B., Scheller, R. H., Kandel, E. R., Axel, R. In situ hybridization to study the origin and fate of identified neurons. Science. 222 (4625), 800-808 (1983).
  45. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
  46. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  47. D'Autreaux, F., Coppola, E., Hirsch, M. R., Birchmeier, C., Brunet, J. F. Homeoprotein Phox2b commands a somatic-to-visceral switch in cranial sensory pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20018-20023 (2011).
  48. Staib-Lasarzik, I., et al. Anesthesia for euthanasia influences mRNA expression in healthy mice and after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (19), 1664-1671 (2014).
  49. Avau, B., et al. Ghrelin is involved in the paracrine communication between neurons and glial cells. Neurogastroenterology and Motility. 25 (9), 599-608 (2013).
  50. Settell, M. L., et al. Functional vagotopy in the cervical vagus nerve of the domestic pig: implications for the study of vagus nerve stimulation. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026022(2020).
  51. Nyborg, N. C. B., et al. Cholecystokinin-1 receptor agonist induced pathological findings in the exocrine pancreas of non-human primates. Toxicology and Applied Pharmacology. 399, 115035(2020).

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