Multiplex in situ hibridização (ISH) foi empregado para visualizar simultaneamente as transcrições de dois receptores acoplados à proteína G e um fator de transcrição em todo o complexo gônico vagal do camundongo adulto. Este protocolo poderia ser usado para gerar mapas precisos dos perfis transcritivos de neurônios aferentes vagal.
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Artigo de método
Detecção de expressão receptora acoplada à proteína G em neurônios aferentes do mouse vagal usando multiplex in situ hibridização
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este estudo descreve um protocolo para o multiplex in situ hibridização (ISH) do gânglio jugular-nodose do mouse, com ênfase especial na detecção da expressão de receptores acoplados à proteína G (GPCRs). A gália jugular-nodose com formalina fixa foi processada com a tecnologia RNAscope para detectar simultaneamente a expressão de dois GPCRs representativos (receptores de colecistocina e grelina) em combinação com um gene marcador de nodose (homeobox emparelhado 2b, Phox2b) ou neurônios afferent (proteína de dedo de zinco 12, Prdm12). Os gânglios rotulados foram imagens usando microscopia confocal para determinar os padrões de distribuição e expressão das transcrições acima mencionadas. Resumidamente, os neurônios aferentes phox2b foram encontrados para expressar abundantemente o receptor de colecistocina (Cck1r), mas não o receptor de grelina (Ghsr). Um pequeno subconjunto de neurônios aferentes Prdm12 também foi encontrado para expressar Ghsr e/ou Cck1r. Potenciais ressalvas técnicas no projeto, processamento e interpretação do MULTIPLEX ISH são discutidas. A abordagem descrita neste artigo pode ajudar os cientistas a gerar mapas precisos dos perfis transcritivos de neurônios aferentes vagal.
Introdução
Os corpos celulares de afferents vagais estão contidos na jugular, petrosal e nodose ganglia1,2,3. Seus axônios viajam juntos através de vários ramos do nervo vago para os territórios craniocervical, torácico e abdominal4,5,6,7. A partir de seus finais viscerais, os aferentes vagais podem responder a uma ampla gama de estímulos fisiológicos e nocivos8,9,....
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Protocolo
NOTA: Os camundongos utilizados neste estudo eram machos do tipo selvagem em um fundo C57BL/6J puro. Um total de 4 camundongos foram usados para multiplex ISH. Todos os ratos tinham aproximadamente 8 semanas de idade na época do sacrifício. Um rato macho (aproximadamente um ano de idade) também foi usado para demonstrar fluorescência endógena associada ao envelhecimento. Os animais estavam alojados em gaiolas ventiladas dentro de uma instalação de barreira com acesso a ad libitum a alimentos e água. O Comitê de Cuidados e Uso Institucional de Animais do Centro Médico do Sudoeste da UT Southwestern analisou e aprovou os procedimentos descritos abaixo. Detalhes....
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Resultados
Embora o RNAScope possa ser aplicado a animais de qualquer idade, sexo ou origem genética, é aconselhável trabalhar com adultos jovens (<3 meses de idade). Isso ocorre porque artefatos fluorescentes (por exemplo, lipofuscina) são achados comuns em neurônios de animais mais velhos41. Os gânglios fixos formalina de camundongos mais velhos geralmente contêm fluorescência endógena surpreendentemente intensa que pode ser facilmente confundida com coloração genuína(Figura 1A
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Discussão
A técnica do ISH foi inventada no final da década de 196042. No entanto, não é até meados da década de 1980 que foi aplicado para a detecção de mRNAs nos sistemas nervosos central e periférico43,44. Considerando a heterogeneidade do sistema nervoso e questões recorrentes com anticorpos, a localização de uma transcrição específica no nível celular continua sendo uma ferramenta inestimável. No entanto, os métodos tradicionais do ISH têm perm.......
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Divulgações
Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Núcleo de Neuronatomia/Histologia/Injeção Cerebral financiado pela concessão do NIH #5P01DK119130-02. Os autores gostariam de reconhecer a assistência do UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (liderado pelo Dr. Phelps) e sua equipe (Abhijit Bugde e Marcel Mettlen), apoiado em parte pelo NIH Grant #1S10OD021684-01, um recurso compartilhado do Centro de Câncer Harold C. Simmons, apoiado em parte por uma subvenção de apoio ao Centro de Câncer NCI, P30 CA142543.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 10x | PBS Fisher Scientific | BP399-4 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763-80 | |
| ° C freezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
| Adobe Photoshop 2021 | Adobe software de foto e design | ||
| Forno de cozimento | Thermo Scientific | Modelo: 658 | |
| Microscópio confocal | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
| Vidro de cobertura | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
| Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
| Dumont #5 Fórceps | F.S.T. | 11252-20 | |
| Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | meio de montagem |
| HybEZ forno | de hibridização forno | ||
| Caneta hidrofóbica | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ImageJ-Fiji | NIH | ||
| Tesoura grande | Henry Schein | 100-7561 | |
| Micro tubos de centrífuga | VWR | 20170-333 | |
| Minibomba de fluxo variável | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Biomarcador fluorescente |
| Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Biomarcador fluorescente |
| Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Biomarcador fluorescente |
| ProLong Gold Meio de montagem antifade Mountant | para células marcadas com fluorescência | ||
| RNAscope Multiplex Kit de Reagentes Fluorescentes v2 | ACD / Bio-Techne | 323100 | kit multiplex |
| Sonda RNAscope Mouse Cck1r-C3 | ACD / Bio-Techne | 313751-C3 | |
| Sonda RNAscope Mouse DapB | ACD / Bio-Techne | 310043 | |
| Sonda RNAscope Mouse Ghsr | ACD / Bio-Techne | Sonda 426141 | |
| RNAscope Mouse Phox2b-C2 | ACD / Bio-Techne | 407861-C2 | |
| Sonda RNAscope Mouse Prdm12-C2 | ACD / Bio-Techne | 524371-C2 | |
| RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase solução de descontaminação |
| Tesoura de dissecação pequena | Millipore Sigma | Z265977 | |
| Superfrost Plus slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
| Manual do usuário | ACD | 323100 USM | |
| Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
| ZEN Imaging Software | Zeiss |
Referências
- Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
- Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets withi....
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Reimpressões e permissões
