Artigo de método

Desenvolvimento de um laboratório móvel de fisiologia mitocondrial para medir a energia mitocondrial no campo

DOI:

10.3791/62956

⸱

27 de agosto de 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Kinesiology, Auburn University, 2Department of Biological Sciences, Auburn University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Auburn University

Neste artigo

Resumo

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Projetamos e construímos um laboratório móvel para medir as taxas respiratórias em mitocôndrias isoladas de animais silvestres capturados em locais de campo. Aqui, descrevemos o projeto e o equipamento de um laboratório mitocondrial móvel e os protocolos laboratoriais associados.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A energia mitocondrial é um tema central na bioquímica e fisiologia animal, com pesquisadores usando a respiração mitocondrial como uma métrica para investigar a capacidade metabólica. Para obter as medidas da respiração mitocondrial, amostras biológicas frescas devem ser usadas, e todo o procedimento laboratorial deve ser concluído dentro de aproximadamente 2 h. Além disso, vários equipamentos especializados são necessários para a realização desses ensaios laboratoriais. Isso cria um desafio para medir a respiração mitocondrial nos tecidos de animais selvagens que vivem longe dos laboratórios de fisiologia, já que os tecidos vivos não podem ser preservados por muito tempo após a coleta no campo. Além disso, o transporte de animais vivos a longas distâncias induz estresse, o que pode alterar a energia mitocondrial.

Este manuscrito apresenta o MitoMobile da Universidade de Auburn (AU), um laboratório móvel de fisiologia mitocondrial que pode ser levado a campo e usado no local para medir o metabolismo mitocondrial em tecidos coletados de animais selvagens. São apresentadas as características básicas do laboratório móvel e os métodos passo a passo para medir as taxas de respiração mitocondrial isolada. Além disso, os dados apresentados validam o sucesso de equipar o laboratório móvel de fisiologia mitocondrial e fazer medidas da respiração mitocondrial. A novidade do laboratório móvel está na capacidade de ir a campo e realizar medições mitocondriais nos tecidos dos animais capturados no local.

Introdução

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Até o momento, os estudos destinados a medir a energia mitocondrial têm sido limitados a animais de laboratório ou capturados perto de laboratórios de fisiologia estabelecidos, o que impediu os cientistas de realizar estudos bioenergéticos mitocondriais em tecidos coletados de animais durante atividades como migração, mergulho e hibernação 1,2,3,4,5,6 . Embora muitos pesquisadores tenham medido com sucesso as taxas metabólicas basais e de pico e o gasto energético diário de animais selvagens 7,8, a capacidade dos pesquisadores de medir o desempenho das mitocôndrias permaneceu limitada (ver 1,4,9). Isso se deve, em parte, à necessidade de tecido fresco para isolar as mitocôndrias e a uma instalação laboratorial para realizar os isolamentos dentro de cerca de 2 h após a obtenção do tecido fresco. Uma vez que as mitocôndrias tenham sido isoladas, as medidas de respiração mitocondrial também devem ser concluídas dentro de ~1 h.

Taxas de respiração mitocondrial isoladas são geralmente realizadas medindo a concentração de oxigênio em um recipiente selado conectado a um eletrodo de Clark. A teoria por trás deste método baseia-se na observação básica de que o oxigênio é o último aceptor de elétrons da respiração mitocondrial durante a fosforilação oxidativa. Portanto, à medida que a concentração de oxigênio cai durante um experimento, supõe-se que a produção de adenosina trifosfato (ATP) ocorra10. O oxigênio consumido é um proxy para o ATP produzido. Os pesquisadores podem criar condições experimentais específicas usando diferentes substratos e iniciar a respiração estimulada por difosfato de adenosina (ADP) (estado 3) adicionando quantidades predeterminadas de ADP à câmara. Após a fosforilação do ADP exógeno para ATP, a taxa de consumo de oxigênio diminui, e o estado 4 é atingido e pode ser medido. Além disso, a adição de inibidores específicos permite obter informações sobre respiração de vazamento e respiração desacoplado10. A razão entre o estado 3 e o estado 4 determina a razão de controle respiratório (RCR), que é o indicador do acoplamento mitocondrial global10,11. Valores mais baixos de RCR indicam disfunção mitocondrial global, enquanto valores mais altos de RCR sugerem maior extensão do acoplamento mitocondrial10.

Como dito anteriormente, a coleta de material biológico, o isolamento mitocondrial e a medição das taxas respiratórias devem ser concluídos em até 2 h após a obtenção do tecido. Para realizar essa tarefa sem transportar animais a grandes distâncias para laboratórios estabelecidos, um laboratório móvel de fisiologia mitocondrial foi construído para ser levado a locais de campo onde esses dados possam ser coletados. Um veículo recreativo Jayco Redhawk de 2018 foi convertido em um laboratório móvel de fisiologia molecular e nomeado MitoMobile da Universidade de Auburn (AU) (Figura 1A). Um veículo recreativo foi selecionado por causa da geladeira embutida, freezer, tanque de armazenamento de água e encanamento, eletricidade alimentada por baterias de 12 volts, gerador a gás, tanque de propano e sistema de autonivelamento. Além disso, o veículo recreativo fornece a capacidade de permanecer em locais remotos durante a noite para coleta de dados. A frente do veículo não foi alterada e fornece os quartos de condução e dormir (Figura 1B). Foram retirados os equipamentos de higiene pessoal (cama, TV e armário) instalados anteriormente na parte traseira do veículo e no fogão.

Estantes de aço inoxidável feitas sob medida e uma bancada de quartzo personalizada apoiada em estrutura de alumínio 80/20 foram instaladas no lugar das comodidades do quarto e do fogão (Figura 1C). As bancadas do laboratório oferecem espaço adequado para a coleta de dados (Figura 1D). O consumo de energia de cada equipamento (centrífuga refrigerada, câmaras de respiração mitocondrial, leitores de placas, computadores, homogeneizadores, balanças, ultrafreezer portátil e outros materiais gerais de laboratório) foi levado em consideração. Para suportar as grandes demandas de tensão e corrente da centrífuga, o sistema elétrico foi atualizado para o de equipamentos de nível aeronáutico. Um compartimento externo na parte traseira do veículo foi convertido em um compartimento de armazenamento de nitrogênio líquido, que atende às diretrizes do Departamento de Transporte dos Estados Unidos para armazenamento e transporte de nitrogênio líquido. Esta unidade de armazenamento foi construída com aço inoxidável e tem ventilação adequada para evitar que qualquer gás nitrogênio em expansão vaze para o habitáculo do veículo.

Para confirmar que o laboratório móvel pode ser usado em estudos bioenergéticos mitocondriais, as mitocôndrias foram isoladas e as taxas de respiração mitocondrial do músculo esquelético dos membros posteriores de camundongos domésticos selvagens (Mus musculus) foram medidas. Como Mus musculus é um organismo modelo, as taxas respiratórias mitocondriais dessa espécie estão bem estabelecidas12,13,14. Embora estudos anteriores tenham documentado o isolamento mitocondrial por centrifugação diferencial15,16,17, uma breve visão geral dos métodos utilizados nos métodos laboratoriais de fisiologia mitocondrial móvel é descrita a seguir.

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Protocolo

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As seções a seguir descrevem os métodos laboratoriais mitocondriais. Todos os procedimentos de manuseio e coleta de tecidos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Auburn (#2019-3582).

1. Descrição dos buffers utilizados para a coleta de dados

NOTA: Esses buffers podem ser preparados em um laboratório estacionário e movidos para o laboratório móvel antes da viagem de campo (a menos que indicado de outra forma abaixo).

  1. Preparar o tampão de isolamento mitocondrial do músculo esquelético com albumina de soro bovino (BSA), conforme demonstrado na Tabela 1.
    1. Dissolva produtos químicos em água deionizada (~ 90% do volume), exceto para o BSA livre de ácidos graxos. Coloque o tampão no frigorífico até à temperatura de 4 °C.
    2. Ajustar a solução a um pH de 7,5, mantendo a temperatura a 4 °C.
    3. Adicione o BSA livre de ácidos graxos e aumente o volume para 100%. Alicie a solução em tubos cônicos de 50 mL. Conservar esta solução a -20 °C até à utilização.
  2. Preparar o tampão de isolamento mitocondrial do músculo esquelético sem BSA como pode ser visto na Tabela 1.
    1. Dissolva os produtos químicos em água deionizada (~ 90% do volume). Coloque o tampão no frigorífico até à temperatura de 4 °C.
    2. Ajustar a solução a um pH de 7,5, mantendo a temperatura a 4 °C.
    3. Aumente o volume para 100%. Alicie a solução em tubos cônicos de 50 mL. Conservar esta solução a -20 °C até à utilização.
  3. Preparar o tampão de ressuspensão do músculo esquelético conforme demonstrado na Tabela 1.
    1. Dissolva os produtos químicos em água deionizada (~ 90% do volume). Coloque o tampão no frigorífico até à temperatura de 4 °C.
    2. Ajustar a solução a um pH de 7,4, mantendo a temperatura a 4 °C.
    3. Aumente o volume para 100%. Alicie a solução em tubos cônicos de 50 mL. Conservar esta solução a -20 °C até à utilização.
  4. Preparar o tampão respiratório do músculo esquelético conforme mostrado na Tabela 2.
    1. Dissolva os produtos químicos em água deionizada (~ 90% do volume), exceto para o BSA livre de ácidos graxos. Aqueça o tampão até que a temperatura seja de 37 °C.
    2. Ajustar a solução a um pH de 7,0, mantendo a temperatura a 37 °C.
    3. Adicione o BSA livre de ácidos graxos e aumente o volume para 100%. Alicie a solução em tubos cônicos de 50 mL. Conservar esta solução a -20 °C até à utilização.
  5. Preparar os substratos respiratórios conforme mostrado na Tabela 2.
    1. Certifique-se de que esses substratos sejam frescos no dia da coleta de dados em Tris-HCl 100 mM, pH 7,4. Conservar no gelo até ao uso.
      NOTA: Os valores fornecidos são para fazer uma solução suficientemente concentrada para substrato suficiente a ser absorvido pelas mitocôndrias. As concentrações finais dos substratos são 2 mM de piruvato, 2 mM de malato, 10 mM de glutamato e 5 mM de succinato.

2. Realização do isolamento mitocondrial (Figura 2)

NOTA: O isolamento mitocondrial e as medições da respiração mitocondrial são realizados na área da bancada do laboratório móvel, e todas as soluções devem ser mantidas a 4 °C, salvo indicação em contrário.

  1. Estacione o laboratório móvel em terreno plano. Ligue o gerador e nivele o veículo. Estenda o slide e configure o equipamento.
  2. Descongele as quantidades desejadas de buffers.
    NOTA: Geralmente, são necessários 30 mL de tampão de isolamento de músculo esquelético e 10 mL de tampão de isolamento de músculo esquelético sem BSA por músculo.
  3. Configurar e calibrar as câmaras de respiração mitocondrial para a temperatura desejada dos experimentos e pressão barométrica atual de acordo com as instruções do fabricante. Consulte a Tabela de Materiais para câmaras específicas usadas em experimentos.
  4. Eutanásia do animal via decapitação.
    NOTA: O presente estudo utilizou a decapitação para a eutanásia. Alguns gases, como o dióxido de carbono e o isoflurano, afetam a função mitocondrial18,19,20; Esses efeitos devem ser considerados na seleção do melhor método de eutanásia para cada estudo. O método a ser realizado para cada estudo será determinado pela pergunta científica que está sendo feita.
  5. Excise o músculo esquelético, corte rapidamente a gordura e o tecido conjuntivo, pese e coloque o músculo em tampão de isolamento do músculo esquelético com BSA (pelo menos 1/10 p/v) (por exemplo, 1 g de músculo esquelético para 10 mL de tampão).
  6. Pique o músculo esquelético com uma tesoura no gelo.
  7. Transfira o tecido picado para um tubo de centrífuga de 50 mL usando uma ponta de pipeta cortada de 5 mL. Homogeneizar com uma lâmina (ver Tabela de Materiais) a 50% de potência por 5 s. Adicionar protease (5 mg/g de músculo molhado) e digerir por 7 min, misturando a solução a cada 30 s. Termine a reação adicionando um volume igual de buffer de isolamento com BSA.
  8. Centrifugar o homogeneizado a 500 × g durante 10 min. Transfira o sobrenadante através de pano de queijo de camada dupla usando uma ponta de pipeta cortada de 5 mL para um tubo de centrífuga limpo de 50 mL. Centrifugar o sobrenadante a 3.500 × g por 10 min para precipitar uma pastilha mitocondrial marrom.
  9. Despeje o sobrenadante restante. Adicione o mesmo volume de tampão de isolamento com BSA ao tubo da centrífuga. Ressuspenda o pellet mitocondrial com um raspador flexível (policial) trabalhando suavemente o pellet mitocondrial fora das paredes do tubo de centrífuga. Centrifugar a 3.500 × g por 10 min.
  10. Despeje o sobrenadante restante. Adicione o mesmo volume de tampão de isolamento sem BSA ao tubo da centrífuga. Ressuspenda a pelota mitocondrial trabalhando suavemente a pelota mitocondrial fora das paredes do tubo de centrífuga com um policial limpo. Centrifugar a 3.500 × g por 10 min.
  11. Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet mitocondrial em tampão de ressuspensão, trabalhando suavemente o pellet mitocondrial fora das paredes do tubo de centrífuga com um policial limpo.
    NOTA: O volume do tampão de ressuspensão dependerá do tamanho da pelota mitocondrial.
  12. Transfira as mitocôndrias ressuspensas para um homogeneizador Dounce com ponta de pipeta cortada de 1 mL. Usando o homogeneizador Dounce, homogeneize cuidadosamente a suspensão com 4-5 passadas.
  13. Colocar a suspensão mitocondrial em um tubo de microcentrífuga marcado de 2 mL usando outra ponta de pipeta cortada de 1 mL.

3. Medidas da respiração mitocondrial (Figura 3)

  1. Substratos do complexo I
    1. Adicionar 945 μL de tampão respiratório à câmara. Certifique-se de que o agitador está girando e que a temperatura do tampão é mantida em 37 °C. Inicie o registro da coleta de dados.
    2. Depois que a concentração de oxigênio estiver estabilizada, adicione 20 μL da mitocôndria e coloque a tampa na câmara. No software, denotam que mitocôndrias foram adicionadas à câmara.
    3. Adicionar 10 μL de glutamato 1 M, 10 μL de malato 200 mM e 10 μL de piruvato 200 mM à câmara com seringas individuais e aguardar até que o sinal se estabilize. No software, denote que foram adicionados substratos.
      NOTA: Esses substratos são normalmente usados para medir a respiração impulsionada por carboidratos. Para outras combinações de substratos a utilizar para medir a respiração orientada pela gordura, ver21.
    4. Adicionar 5 μL de ADP com uma seringa separada e observar o rápido consumo de oxigênio (estado 3). No software, denote que ADP foi adicionado.
      NOTA: Após a fosforilação do ADP adicionado, a taxa de consumo de oxigênio se estabilizará para o estado 4.
    5. Após 4 min da coleta de dados do estado 4, encerrar a gravação. Salve o arquivo de dados.
  2. Substratos do complexo II
    1. Adicionar 963 μL do tampão respiratório à câmara. Certifique-se de que o agitador está girando e que a temperatura do tampão é mantida em 37 °C. Inicie o registro da coleta de dados.
    2. Depois que a concentração de oxigênio estiver estabilizada, adicione 20 μL de mitocôndrias e coloque a tampa na câmara. No software, denotam que mitocôndrias foram adicionadas à solução.
    3. Adicionar 2 μL de 4 μg/μL de rotenona seguido de 10 μL de succinato 500 mM à câmara utilizando seringas separadas e aguardar até que o sinal se estabilize. No software, denote que foram adicionados substratos.
    4. Adicionar 5 μL de ADP usando uma seringa separada e observar o rápido consumo de oxigênio (estado 3). No software, denote que ADP foi adicionado.
      NOTA: Após a fosforilação do ADP adicionado, a taxa de consumo de oxigênio se estabilizará para o estado 4.
    5. Após 4 min da coleta de dados do estado 4, encerrar a gravação. Salve o arquivo de dados.

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Resultados

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O presente manuscrito investigou a respiração mitocondrial de Mus musculus de origem selvagem (n = 7, macho = 5, fêmea = 2; idade = 1,30 ± 0,2 anos) em um laboratório móvel de fisiologia mitocondrial (Figura 1). Para mensurar a respiração mitocondrial do músculo esquelético, todo o membro pélvico, portanto aeróbio e anaeróbio, foi utilizado para isolamento mitocondrial (Figura 2). Exemplos de dados brutos de respiração mitocondrial são mostrados na

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Discussão

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O laboratório móvel de fisiologia mitocondrial permite aos pesquisadores isolar mitocôndrias e medir as taxas de respiração mitocondrial dentro de 2 h após a coleta de tecido em locais de campo remotos. Os resultados aqui apresentados sugerem que as medidas da respiração mitocondrial feitas no AU MitoMobile são comparáveis às medidas feitas em um laboratório de pesquisa da universidade. Especificamente, os valores do estado 3, estado 4 e RCR para Mus musculus de origem selvagem aqui apresentados são comparáveis ...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Os autores agradecem a Mark Nelms e John Tennant, do departamento de Engenharia Elétrica e de Computação da Faculdade de Engenharia Samuel Ginn da Universidade de Auburn, por ajudarem com o equipamento estrutural e elétrico do AU MitoMobile. Além disso, os autores reconhecem o financiamento para equipar o AU MitoMobile e a pesquisa de uma bolsa do Prêmio Presidencial da Universidade de Auburn para Pesquisa Interdisciplinar (PAIR).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de centrífuga de 1,7 mLVWR87003-294
Tubos de centrífuga de 2,0 mL VWR87003-298
Tubos de centrífuga de 50 mLVWR21009-681Tubo de centrífuga Nalgene Oak Ridge
ADPVWR97061-104
ATPVWR700009-070
BradfordVWR7065-020
Placa transparente de 96 poçosVWR82050-760Greiner Bio-One
Dounce homogeneizadorVWR22877-284Corning
EGTAVWREM-4100
PapelIncluído com Hansatech OxyGraph
Ácido graxo livre BSAVWR89423-672
GlicoseVWRBDH8005-500G
GlutamateVWRA12919
Hamilton SeringasVWR60373-985Gaslight 1700 Series Seringas
Hansatech OxyGraphHansatech Instruments LtdSem número de catálogo, mas pode ser encontrado em Produtos --> Unidades de Controle de Eletrodos
KH2PO4VWR97062-350
MalatoVWR97062-140
ManitolVWR97061-052
Membranaincluída com Hansatech OxyGraph
MgCl2VWR97063-152
MOPSVWR80503-004
PolicialVWR470104-462
PolytronThomas Scientific11090044
Cloreto de potássio (KCl)VWR97061-566
ProteaseVWR97062-366A tripsina é comumente usada; no entanto, outras proteases podem ser usadas.
Ácido pirúvicoVWR97061-448
Ditionito de sódioVWRAA33381-22
SuccinatoVWR89230-086
SacaroseVWRBDH0308-500G
Tris-BaseVWR97061-794
Tris-HClVWR97061-258
de filtro

Referências

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