Plaquing é um método de rotina usado para quantificar vírus vivos em uma população. Embora o plaquing seja frequentemente ensinado em vários currículos de microbiologia com bactérias e bacteriófagos, o plaquamento de vírus mamíferos é mais complexo e demorado. Este protocolo descreve os procedimentos que funcionam de forma confiável para o trabalho regular com vírus herpes simplex.
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Artigo de método
Plaquing de Vírus Herpes Simplex
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Existem inúmeros protocolos publicados para plaquamento de vírus, incluindo referências dentro da literatura primária para metodologia. No entanto, plaquing vírus pode ser difícil de executar, exigindo foco em suas especificações e refinamento. É um método incrivelmente desafiador para novos alunos dominarem, principalmente porque requer uma atenção meticulosa aos detalhes mais minuciosos. Essa demonstração de plaquamento de vírus herpes simplex deve ajudar aqueles que têm lutado para visualizar o método, especialmente suas nuances, ao longo dos anos. Embora este manuscrito se baseie nos mesmos princípios da metodologia de plaquing padrão, ele difere na sua descrição detalhada de (1) a melhor forma de lidar com células hospedeiras para evitar interrupções durante o processo, (2) um meio viscoso mais útil do que surgiu para limitar a difusão de virions, e (3) um simples procedimento de fixação e coloração que produz resultados relisivelmente reprodutíveis. Além disso, o vídeo que acompanha ajuda a demonstrar as distinções mais finas no processo, que são frequentemente perdidas ao instruir outros sobre a realização de ensaios de placa.
Introdução
Os primórdios dos ensaios da placa do vírus remontam às primeiras descobertas de vírus na década de 18901. O vírus do mosaico do tabaco foi primeiro isolado e transmitido sobre as folhas de tabaco, onde as manchas individuais de infecção poderiam ser reconhecidas e quantificadas como originárias de uma única entidade de vírus vivo2, posteriormente identificada como virion2. Estudos seminais posteriores com bactérias e bacteriófagos aperfeiçoaram as técnicas usadas para aplacar esses vírus, incluindo bactérias na fase de crescimento de tronco médio, diluição serial de amostras de bacteriófago, e ág....
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Protocolo
Todos os procedimentos com as células Vero e herpesvírus vivos foram aprovados pelo Comitê de Biossegurança Institucional da Universidade de Towson. Um esquema generalizado desses procedimentos está representado na Figura 1.
1. Semeadura das células Vero
- Um dia antes de iniciar o ensaio da placa, trippsinize células Vero e resuspensá-las no Médio de Águias Modificadas (DMEM) de Dulbecco regular e suplemento conforme metodologia de cultura celular padrão19. Resuspenque as células experimentpsinizadas em 10 mL de DMEM por frasco T-75 das células Vero confluentes ....
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Resultados
A Tabela 1 mostra um experimento que tem resultados ótimos. Todas as diluições de 10 vezes seguem uma redução de aproximadamente 10 vezes na contagem de placas. Esses tipos de dados também podem ser vistos na Figura 2, um ensaio de placa real onde o número contável de placas caiu na faixa 10-4 para todas as três réplicas. O mesmo pode ser visto na Figura 3, a linha superior, onde o número contável de placas estava na diluição 10-.......
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Discussão
Embora os ensaios de placa sejam quase tão antigos quanto a própria cultura celular de mamíferos, parece que cada laboratório tem seu próprio conjunto de protocolos para executar este ensaio básico5,6,10,11,12,13,14,15,16,20
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Divulgações
Os autores não declaram conflito de interesses.
Agradecimentos
Agradecemos a inúmeros alunos de nossos laboratórios (PJD e BJM) que trabalharam conosco ao longo dos anos refinando esses métodos. Um agradecimento especial a Stan Person, sob cuja tutela esta metodologia foi desenvolvida pela primeira vez. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo fundo de apoio à pesquisa da Towson University Fisher College of Science and Math E nigms Bridges para a bolsa baccalaureate 5R25GM058264. Este conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placas de 12 poços | Corning | 3512 | |
| Placas de 6 poços | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| Antibiótico/antimicótico | Gibco | 15240096 | |
| Violeta cristal | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| PBS de Dulbecco (sem Mg++ ou Ca++) | Gibco | 14190144 | |
| Soro fetal de bezerro | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-alanil-L-glutamina (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
| Hemacitômetro | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| Metilcelulose | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| Agente quaternário (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| Vero células | ATCC | CCL-81 |
Referências
- Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. Introduction to Moden Virology. 6th end. , Wiley-Blackwell. (2007).
- Mahy, B., Collier, L. Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, Arnold. (1998).
- Anderson, B., et al.
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Reimpressões e permissões
