Artigo de método

Imunofluorescência total do ovário, compensação e microscopia multifotínica para análise quantitativa 3D da reserva ovariana em desenvolvimento em mouse

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DOI:

10.3791/62972

3 de setembro de 2021

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para imagens de ovários inteiros para análises quantitativas e qualitativas utilizando imunosscopia de montagem integral, microscopia multifotínica e visualização e análise 3D. Este protocolo acomoda um processamento de alto rendimento, confiável e repetível que é aplicável para toxicologia, diagnóstico clínico e ensaios genômicos da função ovariana.

Resumo

A fertilidade feminina e a vida útil reprodutiva dependem da qualidade e quantidade da reserva de oócito ovariano. Estima-se que 80% das células germinativas femininas que entram em prophase meiotic I são eliminadas durante o Atrito de Oócito Fetal (FOA) e a primeira semana de vida pós-natal. Três mecanismos principais regulam o número de oócitos que sobrevivem durante o desenvolvimento e estabelecem a reserva ovariana em fêmeas que entram na puberdade. Na primeira onda de perda de oócitos, 30-50% dos oócitos são eliminados durante o FOA inicial, um fenômeno que é atribuído à alta expressão de elemento nuclear intercalado de comprimento -1 (LINE-1). A segunda onda de perda de oócito é a eliminação de oócitos com defeitos meioticos por um ponto de verificação de qualidade meiotic. A terceira onda de perda de oócito ocorre perinatalmente durante a formação de folículos primordiais quando alguns oócitos não conseguem formar folículos. Ainda não está claro o que regula cada uma dessas três ondas de perda de oócito e como elas moldam a reserva ovariana em camundongos ou humanos.

A imunofluorescência e a visualização 3D abriram um novo caminho para a imagem e análise do desenvolvimento de oócitos no contexto de todo o ovário, em vez de em seções 2D menos informativas. Este artigo fornece um protocolo abrangente para imunostaining de ovários inteiros e limpeza óptica, produzindo preparações para imagens usando microscopia multifotídea e modelagem 3D usando software comercialmente disponível. Ele mostra como este método pode ser usado para mostrar a dinâmica do atrito de oócito durante o desenvolvimento ovariano em camundongos C57BL/6J e quantificar a perda de oócito durante as três ondas de eliminação de oócitos. Este protocolo pode ser aplicado aos ovários pós-natal e pós-natal precoces para visualização e quantificação de oócitos, bem como outras abordagens quantitativas. É importante ressaltar que o protocolo foi estrategicamente desenvolvido para acomodar o processamento de alto rendimento, confiável e repetível que pode atender às necessidades em toxicologia, diagnóstico clínico e ensaios genômicos da função ovariana.

Introdução

A maioria das fêmeas de mamíferos nasce com um número finito de oócitos presos por meioticamente armazenados dentro de folículos primordiais, constituindo a reserva ovariana (OR)1,2. O BO determina a vida reprodutiva geral feminina e a saúde3. O OR normalmente diminui de tamanho com o envelhecimento e pode ser prematuramente esgotado após a exposição a certos agentes genotoxicos (radiação/quimioterapia) e estresses ambientais (desnutrição), levando à infertilidade 4,5,6. A infertilidade feminin....

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Protocolo

Todos os camundongos utilizados foram da cepa genética C57BL/6J (ver a Tabela de Materiais). Esta cepa foi totalmente sequenciada e é padrão para muitos estudos sobre estrutura ovariana e função. Os camundongos foram alojados de acordo com as diretrizes do NIH, e os procedimentos realizados foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Laboratório Jackson. Os reagentes e composições utilizados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais e na Tabela 1, respectivamente.

1. Preparação de reagentes

  1. Fixação: Prepare 4% de paraformaldeído (PFA) em 1....

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Resultados

A imunostenção e a imagem de todo o ovário permitem a visualização e quantificação de oócitos ou expressão proteica em ovários em diferentes estágios de desenvolvimento usando a mesma técnica e marcadores (Figura 3). Este protocolo foi desenvolvido para um projeto em larga escala no qual era necessária a análise dos ovários em múltiplos estágios e a partir de múltiplas cepas de camundongos. Aqui, apresentamos dados coletados para a cepa C57BL6/J, uma cepa padrão para análise genética. A técn.......

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Discussão

Este artigo apresenta um protocolo detalhado de imunostaining 3D e de imagem para ovários pré-natais e pós-natais para estudos de alta produtividade e comparativos para quantificação de células germinativas e localização de proteínas. Desenvolvemos este protocolo para analisar os números de oócitos em ovários (N=6-12) em seis pontos de tempo de desenvolvimento em 10-16 cepas diferentes, onde 2-4 placas de 24 poços são tipicamente processadas ao mesmo tempo. Este método pode ser adaptado para outros órgãos ou marcadores c.......

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01 HD093778 para E.B-F e T32 HD007065 a R.B). Agradecemos zachary Boucher por sua ajuda com experimento de radiação. Agradecemos a Mary Ann Handel pela leitura crítica do manuscrito. Agradecemos a contribuição de Sonia Erattupuzha e do Serviço núcleo de microscopia do Laboratório Jackson para assistência especializada com o trabalho de microscopia descrito nesta publicação e Jarek Trapszo, do Scientific Instrument Services do Laboratório Jackson, para projetar o slide adaptador impresso em 3D.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Incubadora de bancadaBenchmarkScientific H2200-H37 ° C incubadora
Albumina de soro bovino (BSA)VWR97061-416
C57BL / 6JO Laboratório Jackson 000664cepa endogâmica de camundongo
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD1435Material perigoso
D-SorbitolSigma-AldrichS6021
Dumont # 5 FórcepsFST91150-20
Barreiras reagentes FastWellsGraceBio664113Junta de silicone pegajosa e flexível (poço adesivo)
Tesoura FinaFST91460-11
GlicerolSigma-AldrichG2025
GlicinaThermoFisher ScientificBP381-500
Anticorpo secundário anti-coelho IgG (H+L) de cabra, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21246Diluição 1:1000
IgG de cabra anti-rato (H+L) Anticorpo secundário de adsorção cruzada, Alexa Fluor 555InvitrogenA-21434Diluição 1:1000
Soro de cabraSigma-AldrichG9023
Software IMARISOxford Instruments Versão 9.7.0Software de visualização e análise de imagem
Insight X3Spectra-PhysicsInSight  Laser ultrarrápido ajustável X3para imagem multifotônica
Software LASXLeicaversão 3.5.6Software de aquisição de imagem
Leica DIVE/4TUNE/FALCONLeica Leica Dmi8, pronto para 2P-M: # 158005406Microscópio multifotônico
MaiTai HPSpectra-PhysicsMai Tai DeepSee One Box Laser ultrarrápidopara imagem multifotônica
Controlador de bomba MasterflexSPW IndustrialModelo: 7553-50Bomba peristáltica para perfusão
Tesoura MayoFST14010-175" - ndash; 7" tesouras rombas/rombas para decapitação
Micro Óculos de Cobertura, Quadrado, No. 1.5 25x25mmVWR48366-249
Mini BioMixerBenchmark ScientificB3D1020agitador/nutador para 37 ° C incubadora
Nikon Ergonomic SMZ1270Leica  SMZ1270estereomicroscópio
Paraformaldeído 16% (solução aquosa de formaldeído)Microscopia Eletrônica Ciências15710Material perigoso
PBS Comprimidos, solução salina tamponada com fosfatoThermoFisher ScientificBP2944100Dissolver em água Milli-Q
Penicilina-estreptomicina, 200x, solução antibiótica duplaThermoFisher ScientificICN1670249
Álcool polivinílico (PVA)Sigma-AldrichP8136
Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hidroxipropilenodiamina)Sigma-Aldrich122262
Coelho anti-DDX4/MVHAbcamab27591Diluição 1:500
Coelho anti-LINE-1 ORF1pAbcamab216324Diluição 1:500
Rato anti-TRA98/GCNAAbcamab82527Diluição 1:500
Azida de sódioSigma-AldrichS2002Material perigoso
Borohidreto de sódioSigma-Aldrich452882Material perigoso
SacaroseThermoFisher ScientificS0389
Tekmar Orbital ShakerBimedisVXR-S10agitador para temperatura ambiente
TrietanolaminaSigma-Aldrich90279
Triton X-100Sigma-AldrichX100
UNOLOK Conjunto de infusãoMYCO Medical7001-23agulhas para perfusão
UreiaAmresco97061-920
X-Cite 120LEDExcelitasS/N XT640-W-0147lâmpada de fluorescência LED de baixa potência

Referências

  1. Pelosi, E., Forabosco, A., Schlessinger, D. Genetics of the ovarian reserve. Frontiers in Genetics. 6, 308(2015).
  2. Pepling, M. E. From primordial germ cell to primordial follicle: mammalian female germ cell development. Genesis. 44 (12), 622-632 (2006).
  3. ....

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