Imunofluorescência total do ovário, compensação e microscopia multifotínica para análise quantitativa 3D da reserva ovariana em desenvolvimento em mouse

Ruby Boateng; Nathaniel Boechat; Philipp P. Henrich; Ewelina Bolcun-Filas

doi:10.3791/62972

Artigo de método

Imunofluorescência total do ovário, compensação e microscopia multifotínica para análise quantitativa 3D da reserva ovariana em desenvolvimento em mouse

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DOI:

10.3791/62972

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3 de setembro de 2021

Ruby Boateng¹ , Nathaniel Boechat¹ , Philipp P. Henrich¹ , Ewelina Bolcun-Filas¹

¹The Jackson Laboratory

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para imagens de ovários inteiros para análises quantitativas e qualitativas utilizando imunosscopia de montagem integral, microscopia multifotínica e visualização e análise 3D. Este protocolo acomoda um processamento de alto rendimento, confiável e repetível que é aplicável para toxicologia, diagnóstico clínico e ensaios genômicos da função ovariana.

Resumo

A fertilidade feminina e a vida útil reprodutiva dependem da qualidade e quantidade da reserva de oócito ovariano. Estima-se que 80% das células germinativas femininas que entram em prophase meiotic I são eliminadas durante o Atrito de Oócito Fetal (FOA) e a primeira semana de vida pós-natal. Três mecanismos principais regulam o número de oócitos que sobrevivem durante o desenvolvimento e estabelecem a reserva ovariana em fêmeas que entram na puberdade. Na primeira onda de perda de oócitos, 30-50% dos oócitos são eliminados durante o FOA inicial, um fenômeno que é atribuído à alta expressão de elemento nuclear intercalado de comprimento -1 (LINE-1). A segunda onda de perda de oócito é a eliminação de oócitos com defeitos meioticos por um ponto de verificação de qualidade meiotic. A terceira onda de perda de oócito ocorre perinatalmente durante a formação de folículos primordiais quando alguns oócitos não conseguem formar folículos. Ainda não está claro o que regula cada uma dessas três ondas de perda de oócito e como elas moldam a reserva ovariana em camundongos ou humanos.

A imunofluorescência e a visualização 3D abriram um novo caminho para a imagem e análise do desenvolvimento de oócitos no contexto de todo o ovário, em vez de em seções 2D menos informativas. Este artigo fornece um protocolo abrangente para imunostaining de ovários inteiros e limpeza óptica, produzindo preparações para imagens usando microscopia multifotídea e modelagem 3D usando software comercialmente disponível. Ele mostra como este método pode ser usado para mostrar a dinâmica do atrito de oócito durante o desenvolvimento ovariano em camundongos C57BL/6J e quantificar a perda de oócito durante as três ondas de eliminação de oócitos. Este protocolo pode ser aplicado aos ovários pós-natal e pós-natal precoces para visualização e quantificação de oócitos, bem como outras abordagens quantitativas. É importante ressaltar que o protocolo foi estrategicamente desenvolvido para acomodar o processamento de alto rendimento, confiável e repetível que pode atender às necessidades em toxicologia, diagnóstico clínico e ensaios genômicos da função ovariana.

Introdução

A maioria das fêmeas de mamíferos nasce com um número finito de oócitos presos por meioticamente armazenados dentro de folículos primordiais, constituindo a reserva ovariana (OR)^1,2. O BO determina a vida reprodutiva geral feminina e a saúde³. O OR normalmente diminui de tamanho com o envelhecimento e pode ser prematuramente esgotado após a exposição a certos agentes genotoxicos (radiação/quimioterapia) e estresses ambientais (desnutrição), levando à infertilidade ^4,5,6. A infertilidade feminin....