Artigo de método

Otimização do Modelo de Oclusão de Veia da Retina em Camundongo para Limitar a Variabilidade

DOI:

10.3791/62980

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6 de agosto de 2021

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1Department of Pathology & Cell Biology; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 2Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 3Department of Neurology; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 4The Taub Institute for Research on Alzheimer’s Disease and the Aging Brain; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para oclusão da veia retiniana usando rosa bengala e um sistema de microscópio de imagem retiniana guiado a laser com recomendações para maximizar sua reprodutibilidade em cepas geneticamente modificadas.

Resumo

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Modelos de camundongos de oclusão da veia retiniana (RVO) são frequentemente usados em oftalmologia para estudar a lesão hipóxico-isquêmica na retina neural. Neste relatório, um método detalhado que aponta etapas críticas é fornecido com recomendações para otimização para alcançar taxas de oclusão consistentemente bem-sucedidas em diferentes cepas de camundongos geneticamente modificados. O modelo de camundongo RVO consiste principalmente na administração intravenosa de um corante fotossensibilizador seguido de fotocoagulação a laser usando um microscópio de imagem da retina ligado a um laser guiado oftálmico. Três variáveis foram identificadas como determinantes da consistência da oclusão. Ajustando o tempo de espera após a administração de rosa bengala e equilibrando a linha de base e a saída experimental do laser, a variabilidade entre os experimentos pode ser limitada e uma maior taxa de sucesso das oclusões alcançada. Este método pode ser usado para estudar doenças da retina que são caracterizadas por edema de retina e lesão hipóxico-isquêmica. Além disso, como esse modelo induz lesão vascular, ele também pode ser aplicado para estudar a neurovasculatura, a morte neuronal e a inflamação.

Introdução

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A oclusão da veia retiniana (RVO) é uma doença vascular comum da retina que afetou aproximadamente 28 milhões de pessoas em todo o mundo em 20151. RVO leva ao declínio da visão e perda em adultos em idade ativa e idosos, representando uma doença que ameaça a visão em curso estima-se que aumente ao longo da década próxima. Algumas das patologias distintas do RVO incluem lesão hipóxico-isquêmica, edema de retina, inflamação e perda neuronal2. Atualmente, a primeira linha de tratamento para este distúrbio é através da administração de inibidores do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Embora o tratamento anti-VEGF tenha ajudado a melhorar o edema da retina, muitos pacientes ainda enfrentam declínio da visão3. Para entender melhor a fisiopatologia desta doença e testar possíveis novas linhas de tratamento, há a necessidade de constituir um protocolo de modelo de camundongo RVO funcional e detalhado para diferentes cepas de camundongos.

Modelos de camundongos foram desenvolvidos implementando o mesmo dispositivo a laser usado em pacientes humanos, emparelhado com um sistema de imagem dimensionado para o tamanho correto para um mouse. Este modelo de RVO em camundongo foi relatado pela primeira vez em 2007 4 e posteriormente estabelecido por Ebneter e outros 4,5. Eventualmente, o modelo foi otimizado por Fuma et al. para replicar as principais manifestações clínicas do RVO, como o edema de retina6. Desde que o modelo foi relatado pela primeira vez, muitos estudos o empregaram usando a administração de um corante fotossensibilizador seguido de fotocoagulação das principais veias da retina com um laser. No entanto, a quantidade e o tipo de corante que é administrado, a potência do laser e o tempo de exposição variam significativamente entre os estudos que usaram esse método. Essas diferenças muitas vezes podem levar ao aumento da variabilidade no modelo, dificultando a replicação. Até o momento, não há estudos publicados com detalhes específicos sobre possíveis caminhos para sua otimização.

Este relato apresenta uma metodologia detalhada do modelo de camundongo RVO na cepa C57BL/6J e uma cepa caspase-9 endotelial induzível por tamoxifeno (iEC Casp9KO) com fundo C57BL/6J e de relevância para a patologia RVO como cepa de referência para um camundongo geneticamente modificado. Estudo prévio havia demonstrado que a ativação não apoptótica da caspase-9 endotelial instiga edema retiniano e promove morte neuronal8. A experiência usando essa cepa ajudou a determinar e fornecer informações sobre possíveis modificações para adaptar o modelo de camundongo RVO, que pode ser aplicável a outras cepas geneticamente modificadas.

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Protocolo

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Este protocolo segue a declaração da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o uso de animais em pesquisas oftálmicas e de visão. Experimentos com roedores foram aprovados e monitorados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Columbia.

NOTA: Todos os experimentos usaram camundongos machos de dois meses de idade que pesavam aproximadamente 20 g.

1. Preparação e administração de tamoxifeno para ablação genética induzível de genes floxados

NOTA: O diâmetro dos vasos da retina pode ser afetado pelo peso do animal. Certifique-se de que todos os animais utilizados para uma experiência têm pesos semelhantes.

  1. Diluir o tamoxifeno em óleo de milho a uma concentração de 20 mg/mL.
    NOTA: O tamoxifeno é um tóxico e é sensível à luz. Proteja da luz, por exemplo, com papel alumínio.
  2. Vórtice a solução por alguns segundos.
  3. Deixar no forno a 55 °C durante 15 min.
    NOTA: Certifique-se de que o tamoxifeno se dissolveu completamente. Vórtices adicionais podem ser necessários.
  4. Conservar a solução a 4 °C durante um período máximo de 1 semana.
  5. Use uma seringa de 1 mL equipada com uma agulha de 26 G para injeção de tamoxifeno. Limpe a área de injeção com etanol a 70%.  Administrar 2 mg de tamoxifeno (100 μL de 20 mg/mL) por via intraperitoneal (IP) uma vez ao dia pelo tempo estabelecido de acordo com a linha de Cre induzível específica.
  6. Permita dois dias de descanso para os animais antes de iniciar os experimentos.

2. Preparação de reagentes para fotocoagulação a laser

  1. Rosa bengala
    NOTA: A rosa bengala é sensível à luz. Armazenar no escuro até o uso e preparar fresco para melhores resultados.
    1. Preparar a rosa bengala diluindo-a em 5 mg/ml em solução salina estéril e filtrá-la através de um filtro de seringa de 0,2 μm.
    2. Prepare uma seringa de 1 ml equipada com uma agulha de 26 G com rosa bengala.
  2. Cetamina/xilazina
    1. Diluir cetamina e xilazina em solução salina estéril de acordo com as seguintes concentrações: cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg).
  3. Carprofeno
    1. Diluir o carprofeno a 1 mg/ml em solução salina estéril.
    2. Prepare uma seringa de 1 ml equipada com uma agulha de 26 G com carprofeno.
  4. Solução salina estéril
    1. Prepare uma seringa de 5 ml equipada com uma agulha de 26 G com solução salina estéril.

3. Configuração do laser

  1. Manuseie suavemente o cabo de fibra óptica e conecte-o à caixa de controle a laser e ao adaptador a laser do microscópio de imagem da retina.
  2. Ligue a caixa da lâmpada do microscópio de imagem da retina.
  3. Ligue o computador e abra o programa de criação de imagens.
  4. Ajuste o balanço de branco usando um pedaço de papel branco e colocando-o na frente do olho do mouse e clicando em Ajustar no programa de imagem.
  5. Ligue a caixa de controle a laser girando a tecla e seguindo as instruções na tela da caixa de controle a laser.
    NOTA: O laser utilizado nesta experiência é de Classe 3B e pode causar danos oculares. Use óculos de proteção ao operar o laser.
  6. Verifique a potência do laser de linha de base.
    1. Use um medidor de energia a laser.
    2. Ajuste a tela da caixa de controle a laser para os seguintes parâmetros: 50 mW e 2.000 ms.
    3. Ligue o laser e coloque o medidor de energia na frente da ocular.
      NOTA: Certifique-se de que a luz do microscópio está apagada durante o teste da potência do laser de linha de base.
    4. Pressione o pedal do pedal do pedal para ativar o laser.
    5. Apontar para a leitura de potência do laser para ser 13-15 mW.
      NOTA: A leitura de energia do laser determinará a taxa de sucesso para oclusões da veia da retina. Se a leitura da potência do laser for muito baixa, ajustes podem ser feitos na potência e no tempo de exposição ao laser. Consulte a Tabela 1 para obter recomendações.
  7. Ajuste a potência experimental do laser configurando a tela da caixa de controle do laser para os seguintes parâmetros: 100 mW, 1.000 ms.
  8. Desligue o laser.
    NOTA: Por segurança e para evitar o superaquecimento, é melhor manter o laser desligado entre os ratos.

4. Injeção de veia da cauda do rato de rosa bengala

  1. Despeje 300 mL de água em um copo de 500 mL.
  2. Aqueça o copo em um forno de micro-ondas por 1 min.
  3. Coloque gaze na água morna no copo.
  4. Coloque o mouse em uma contenção.
  5. Pressione a gaze na cauda do rato suavemente e procure as veias dilatadas. Desinfete o local de injeção usando um toalhete de álcool após a dilatação da água morna.
  6. Insira a agulha no local de injeção e puxe a seringa para garantir que está na veia. Em seguida, injete a veia da cauda do rato, administrando a quantidade correta de acordo com o peso do animal (37,5 mg/kg). Aplique pressão no local da injeção para evitar hematoma ou sangramento. Limpe o site.
  7. Solte o mouse da contenção e devolva-o à gaiola.
  8. Aguarde 8 minutos para que a rosa bengala circule antes da injeção de anestésicos.
    NOTA: Isso proporcionará um total de 10 minutos entre a injeção de rosa bengala e a irradiação a laser.

5. Oclusão das veias maiores

  1. Ligue a plataforma do mouse aquecida.
  2. Adicione uma gota de fenilefrina e tropicamida em cada olho.
  3. Injete 150 μL dos anestésicos, cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg) IP.
    NOTA: Durante este procedimento, o rato recebeu duas injeções IP. Assim, os lados foram alternados. A injeção de IP para a anestesia foi administrada no quadrante abdominal inferior direito, e a solução salina foi injetada no quadrante abdominal inferior esquerdo. Recomenda-se puxar a seringa antes da injeção para garantir que a agulha esteja no abdômen e não em nenhum órgão.
  4. Aperte o animal para determinar a profundidade da anestesia e espere até que ele não responda.
  5. Adicione uma gota de cloridrato de proparacaína por olho (analgésico).
  6. Adicione pomada de gel a ambos os olhos.
  7. Injete 150 μL de carprofeno por via subcutânea entre as orelhas.
  8. Acomodem o mouse na plataforma.
  9. Ajuste a plataforma até que a visão do fundo retiniano esteja clara e focada.
  10. Conte as veias da retina e tire uma imagem do fundo.
    NOTA: As veias da retina são mais escuras e mais largas do que as artérias. Veias e artérias se alternam; no entanto, às vezes pode haver uma artéria ramificada perto do nervo óptico e, portanto, duas artérias adjacentes.
  11. Ligue o laser e aponte para uma veia da retina a aproximadamente 375 μm do disco óptico.
  12. Irradiar o recipiente pressionando o pedal e movendo ligeiramente o feixe de laser até 100 μm. Repita este passo três vezes e mova o feixe de laser após cada pulso para que a irradiação não seja focada em um ponto.
  13. Repita a irradiação em outros vasos principais para alcançar 2-3 oclusões.

6. Estabelecimento do número de veias ocluídas no dia 0

  1. Desligue a lâmpada depois de irradiar os recipientes e aguarde 10 min.
    NOTA: A exposição à luz pode causar danos na retina e inflamação; desligue a lâmpada durante o tempo de espera para minimizar a exposição7.
  2. Ligue a lâmpada novamente e conte o número de veias ocluídas.
  3. Tire uma imagem do fundo.

7. Cuidados posteriores

  1. Injete 1 mL de solução salina estéril IP.
    NOTA: Consulte os detalhes da injeção de IP na seção 5, etapa 3.
  2. Adicione colírios lubrificantes a ambos os olhos.
  3. Adicione pomada de gel a ambos os olhos.
  4. Observe o rato enquanto ele se recupera da anestesia e não o devolva à gaiola com os outros animais até que esteja totalmente recuperado. O carprofeno (5 mg/kg) pode ser administrado diariamente até 2 dias após o procedimento. Se aplicado a seres humanos, a dor não é um sintoma de RVO.
    NOTA: Não deixe os animais sozinhos até que eles se recuperem totalmente da anestesia.

8. Avaliação do edema de retina por tomografia de coerência óptica (OCT)

NOTA: Esta etapa pode ser feita no ponto de interesse do investigador. O pico de edema da retina para um rato C57BL/6J é de 1 dia após o procedimento de RVO. Esse ponto de tempo pode variar dependendo do plano de fundo do mouse.

  1. Ligue a caixa de luz do microscópio de imagem da retina, a máquina OCT e a plataforma aquecida do mouse.
  2. No dia seguinte à oclusão, siga os passos 5.2 a 5.7 para preparar o animal.
  3. Abra os programas de software de imagem e OCT.
  4. No programa OCT, ajuste o empurrão para 5.
  5. Tome OCT a 75 μm distal da queimadura ou 4 cliques.
  6. Tire imagens OCT em quatro quadrantes da retina.
  7. Analise as imagens da OCT usando o software de rastreamento.
  8. Compare a espessura da retina das medidas pré-irradiadas com 1 dia após o RVO ou no ponto de interesse do momento.
    NOTA: Ao analisar os dados, leve em consideração o número de veias irradiadas, pois isso pode influenciar o desenvolvimento de edema de retina. Os animais são então eutanasiados pela administração de anestésico seguido de cirurgia de perfusão sem sobrevida.

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Resultados

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O modelo de camundongo RVO visa alcançar com sucesso oclusões nas veias da retina, levando a lesão hipóxico-isquêmica, quebra da barreira hemato-retiniana, morte neuronal e edema de retina8. A Figura 1 mostra uma linha do tempo de etapas para garantir a reprodutibilidade, um esquema do desenho experimental e descreve as etapas que podem ser otimizadas dependendo das questões experimentais. As três etapas principais que podem ser modificadas são o tempo de espera após ...

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Discussão

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O modelo RVO de camundongo fornece um caminho para entender melhor a patologia do RVO e testar possíveis terapêuticas. Embora o modelo RVO do mouse seja amplamente utilizado no campo, há a necessidade de um protocolo detalhado atual do modelo que aborde sua variabilidade e descreva a otimização do modelo. Aqui, fornecemos um guia com exemplos da experiência sobre o que pode ser alterado para obter os resultados mais consistentes em uma coorte de animais experimentais e fornecer dados confiáveis.

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) DGE - 1644869 (para CCO), o National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (para AMP) e o National Institute on Aging (NIA) R21AG063012 (para CMT).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
CarprofenoRimadylNADA #141-199mantenha em 4 ° C
Óleo de MilhoSigma-AldrichC8267
Cabo de FibraThor LabsM14L02
GenTealAlcon00658 06401
Cloridrato de CetaminaHenry ScheinNDC: 11695-0702-1
LasercheckCoherent 1098293
PhenylephrineAkornNDCL174478-201-15
Phoneix Micron IV com Meridiano,  Módulos StreamPix e OCTPhoenix Technology Group
Cloridrato de ProparacaínaAkornNDC: 17478-263-12manter em 4 ° C
RefreshAllergan94170
Rose BengalSigma-Aldrich330000-5G
TamoxifenoSigma-AldrichT5648-5Gsensível à luz
TropicamidaAkornNDC: 174478-102-12
XylazineAkornNDCL 59399-110-20

Referências

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