Este protocolo descreve o procedimento de dissecção, condição cultural e imagem ao vivo de um sistema de explant antena-cérebro para o estudo do conjunto do circuito olfativo.
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Artigo de método
Um sistema de explant para estudos de imagem de lapso de tempo da montagem do circuito olfativo em Drosophila
Neste artigo
Resumo
Resumo
~Os neurônios são precisamente interconectados para formar circuitos essenciais para a função adequada do cérebro. O sistema olfativo Drosophila fornece um excelente modelo para investigar esse processo, uma vez que 50 tipos de neurônios receptores olfativos (ORNs) das antenas e palpas maxilares projetam seus axônios a 50 glomeruli identificáveis no lobo antena e formam conexões sinápticas com dendritos de 50 tipos de neurônios de projeção de segunda ordem (PNs). Estudos anteriores se concentraram principalmente na identificação de moléculas importantes que regulam o direcionamento preciso no circuito olfativo usando tecidos fixos. Aqui, um sistema de explant antennae-cérebro que recapitula os principais marcos de desenvolvimento da montagem do circuito olfativo na cultura é descrito. Através da dissecação da cutícula externa e limpeza de corpos de gordura opacos que cobrem o cérebro pupal em desenvolvimento, imagens de alta qualidade de neurônios únicos de cérebros vivos podem ser coletadas usando microscopia de dois fótons. Isso permite imagens de lapso de tempo de um único axônio ORN direcionado a partir de tecido vivo. Essa abordagem ajudará a revelar importantes contextos biológicos celulares e funções de genes importantes previamente identificados e identificar mecanismos que sustentam o processo dinâmico de montagem do circuito.
Introdução
Os neurônios são precisamente interligados para formar circuitos essenciais para a função adequada do cérebro. Por mais de 100 anos, os neurocientistas têm tentado entender como os neuritos se estendem em direção aos seus alvos intermediários e finais com extrema precisão. Como resultado, eles identificaram genes importantes que codificam pistas de orientação para o desenvolvimento de processos neuronais1. O sistema olfativo Drosophila fornece um excelente modelo para investigar esse processo desde os neurônios receptores olfativos (ORNs, os neurônios sensoriais primários) projetam-se para 50 glomeruli identificáveis com tamanho estere....
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Protocolo
1. Preparação de reagentes
NOTA: Todas as etapas deste protocolo são realizadas à temperatura ambiente (20-25 °C) a menos que explique o contrário.
- Para preparar a placa de cultura para imobilizar a explantização durante a imagem do lapso de tempo, coloque Sylgard de 0,5 cm de espessura (misture completamente dois componentes líquidos na proporção 10:1 antes do uso) na superfície inferior de uma placa de Petri de 60 mm x 15 mm e deixe curar por 48 h à temperatura ambiente (Figura 2A, referida como placa de Sylgard no texto a seguir).
- Para preparar micro pinos para imobilizar....
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Resultados
Os axônios ORN chegam ao lóbulo das antenas entre 18h e 36 h APF. Eles então navegam pelo lóbulo da antena, cruzam a linha média e inervam o glomeruli. Vídeo 1 é um vídeo representativo mostrando todo o processo para vários axônios individualmente identificáveis, tirados na frequência de cada 20 min por 24 h. Antes do registro usando o TurboReg, os axônios exibem alguns desvios laterais à medida que o cérebro se desenvolve (primeira metade do vídeo). Após o registro, a deriva é corrigida (segunda metade .......
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Discussão
A explanta drosophila antennae-cérebro mantém o alvo normal do circuito olfativo. Notamos que o desenvolvimento é 2 vezes mais lento em relação ao in vivo. Nota-se que o sistema de explant não retém palp maxilar, que hospeda seis tipos de ORNs. Para garantir que o desenvolvimento normal seja recapitulado ex vivo, o alongamento dos nervos antenas precisa ser evitado durante a dissecação da explant. Durante a cultura ex vivo , o crescimento das bactérias geralmente causa o desen.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos a N. Özel e R. Hiesinger por seus conselhos sobre a cultura explant; M. Wagner para ajuda técnica da microscopia de dois fótons; D.J. Luginbuhl para geração de moscas transgênicas; D. Friedmann para sugestões de análise de software fiji; Y. Ge para assistência no trabalho de mosca; C. McLaughlin e K.K.L. Wong para comentários sobre o manuscrito. L.L. é um investigador do Instituto Médico Howard Hughes. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde 1K99DC01883001 (para T.L.) e R01-DC005982 (para L.L.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 20-hidroxiecdisona | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti: Laser de safira | Coerente | Coerente MRU X1 | |
| Soro Bovino Fetal | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Insulina humana | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Imaging software | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Cilindro de oxigênio | Praxair | OX M-E | |
| Penicilina-Estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider' s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Elastômero de Silicone | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Microscopia de dois fótons | Bruker | ||
| objetiva de imersão em água (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
Referências
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727(2011).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review Neu....
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Reimpressões e permissões
