Artigo de método

Análise Citométrica de Fluxo para Identificação das Células Imunes Inatas e Adaptativas do Pulmão murino

DOI:

10.3791/62985

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16 de novembro de 2021

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1Division of Hematology-Oncology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 3Harvard College

Neste artigo

Resumo

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Neste estudo, apresentamos um protocolo eficaz e reprodutível para isolar as populações imunes do sistema respiratório murino. Também fornecemos um método para a identificação de todas as células imunes inatas e adaptativas que residem nos pulmões de camundongos saudáveis, usando um painel de citometria de fluxo baseado em 9 cores.

Resumo

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O trato respiratório está em contato direto com o ambiente externo e requer um sistema imunológico precisamente regulado para fornecer proteção enquanto suprime reações indesejadas a antígenos ambientais. Os pulmões abrigam várias populações de células imunes inatas e adaptáveis que fornecem vigilância imunológica, mas também mediam respostas imunes protetoras. Essas células, que mantêm o sistema imunológico pulmonar saudável em equilíbrio, também participam de várias condições patológicas, como asma, infecções, doenças autoimunes e câncer. A expressão seletiva de proteínas superficiais e intracelulares fornece propriedades imunofenópicas únicas às células imunes do pulmão. Consequentemente, a citometria de fluxo tem um papel fundamental na identificação dessas populações celulares durante condições de estado estável e patológico. Este artigo apresenta um protocolo que descreve um método consistente e reprodutível para identificar as células imunes que residem nos pulmões de camundongos saudáveis em condições de estado estável. No entanto, este protocolo também pode ser usado para identificar alterações nessas populações celulares em vários modelos de doenças para ajudar a identificar alterações específicas da doença na paisagem imunológica pulmonar.

Introdução

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O trato respiratório murino contém um sistema imunológico único responsável por combater patógenos e manter a homeostase imunológica. O sistema imunológico pulmonar consiste em populações celulares com heterogeneidade significativa em seu fenótipo, função, origem e localização. Os macrófagos alveolares residentes (AMs), originados principalmente de monócitos fetais, residem no lúmen 1 alveolar, enquanto macrófagos intersticiais (IMs) derivados da medula óssea residem no pulmão parenchyma2. Os IMs podem ser ainda mais subclassificados pela expressão do CD206. Os IMs CD206+ povoam a área peribronquial e perivasc....

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Protocolo

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Todos os estudos e experimentos descritos neste protocolo foram conduzidos sob diretrizes de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Beth Israel Deaconess Medical Center. De seis a dez semanas de idade, os ratos C57BL/6 de ambos os sexos foram usados para desenvolver este protocolo.

1. Excisão cirúrgica e preparação tecidual

  1. Eutanize o mouse injetando 1 mL de tribromoetanol (preparado de acordo com o protocolo padrão; Tabela de Materiais).
    NOTA: A asfixia por CO2 deve ser evitada em estudos pulmonares, pois pode causar lesão pulmonar e alterar as características e pr....

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Resultados

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Estratégia gating
O primeiro passo da nossa estratégia de gating é a exclusão dos detritos e dobras (Figura 1A). A exclusão cuidadosa dos doublets é fundamental para evitar populações falso-positivas (Figura Suplementar S2). Em seguida, as células imunes são identificadas usando CD45+, um marcador para células hematopoiéticas (Figura 1B). A mancha morta pode ser adicionada para excluir células mortas. No entanto, e.......

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Discussão

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A identificação de células imunes pulmonares pode ser desafiadora devido aos múltiplos tipos de células imunes residentes no pulmão e suas características imunofenópicas únicas em comparação com suas contrapartes residentes em outros tecidos. Em várias condições patológicas, células com características fenotípicas distintas aparecem nos pulmões. Por exemplo, a lesão pulmonar induzida pela bleomicina resulta no recrutamento de macrófagos derivados de monócitos circulantes no espaço alveolar, onde podem permanecer por até .......

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Divulgações

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V.A.B. tem patentes sobre o caminho PD-1 licenciado por Bristol-Myers Squibb, Roche, Merck, EMD-Serono, Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, Novartis e Dako. Os autores não declaram outros interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH R01CA238263 e R01CA229784 (VAB).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Êmbolo de seringa de 10 mLEXELINT26265
18 G agulhasBD Precision Glide 305165
agulhas 21 GPrecision Glide Needle305195
tubos cônicos de 50 mLFalcon3520
70 μ filtro de células mThermoFisher22363548
placas de 96 poçosFalcon/corning3799
ACK Lysing BufferThermoFisherA10492-01
anti-mouse CD11bBiolegend101215Para obter detalhes, consulte a Tabela 2
anti-mouse CD11cBiolegend117339 / 117337Para obter detalhes, consulte a Tabela 2
anti-mouse CD45Biolegend103115Para obter detalhes, consulte a Tabela 2
anti-mouse CD64Biolegend139319Para obter detalhes, consulte a Tabela 2
anti-mouse CD68Biolegend137009Para obter detalhes, consulte a Tabela 2
anti-mouse GR-1Biolegend108433Para obter detalhes, consulte a Tabela 2
anti-mouse Siglec FBiolegend155503Para obter detalhes, consulte a Tabela 2
AVERTINSigma-Aldrich240486
B220Biolegend103228Para obter detalhes, consulte a Tabela 2
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma-Aldrich9048-46-8
CD103Biolegend121405 / 121419Para obter detalhes, consulte a Tabela 2
CD24Biolegend138503Para obter detalhes, consulte a Tabela 2
CD3Biolegend100205Para obter detalhes, consulte a Tabela 2
Centrífuga
Colgenase Tipo 1Worthington Biochemical CorpLS004196
CX3CR1Biolegend149005Para obter detalhes, consulte a Tabela 2
DNase IMillipore Sigma10104159001
Etanol
F4/80Biolegend123133Para obter detalhes, consulte a Tabela 2
FcBlock (CD16/32)Biolegend101301Para obter detalhes, consulte a Tabela 2
Soro Fetal BovinoR& D Systems
Pinça Serrilhada FinaRoboz Instrumento Cirúrgico Co
Foxp3 / Conjunto de Buffer de Coloração de Fator de TranscriçãoThermoFisher00-5523-00
Futura Bisturi de SegurançaMerit Medical SystemsSMS210
Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain KitThermoFisherL34973Para detalhes, consulte a Tabela 2
MERTKBiolegend151505Para obter detalhes, consulte a Tabela 2
MHC-IIBiolegend107621Para obter detalhes, consulte a Tabela 2
NK1.1Biolegend108705Para obter detalhes, consulte a Tabela 2
Agitador orbitalVWRModelo 200
Placa de PetriFalcon351029
Centrífuga refrigerada de bancadaSORVAL ST 16R
Tesoura curva pequenaRoboz Surgical Instrument Co
BD

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).
  2. Tan, S. Y., Krasnow, M. A.

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