Summary
פרוטוקול זה מציג בדיקת ספיגת חומצות אמינו עם תווית רדיו, אשר שימושית להערכת צריכת חומצות אמינו בתאים ראשוניים או בעצמות מבודדות.
Abstract
התפתחות העצם וההומאוסטזיס תלויה בהתמיינות ובפעילות של אוסטאובלסטים יוצרי עצם. התמיינות אוסטאובלסט מאופיינת ברצף על ידי התפשטות ואחריה סינתזת חלבונים ובסופו של דבר הפרשת מטריצת עצם. התפשטות וסינתזת חלבונים דורשות אספקה מתמדת של חומצות אמינו. למרות זאת, מעט מאוד ידוע על צריכת חומצות אמינו באוסטאובלסטים. כאן אנו מתארים פרוטוקול רגיש מאוד שנועד למדוד צריכת חומצות אמינו באמצעות חומצות אמינו מסומנות ברדיו. שיטה זו מותאמת לכימות שינויים בספיגת חומצות אמינו הקשורים להתרבות או התמיינות של אוסטאובלסט, טיפולים תרופתיים או גורמי גדילה, או מניפולציות גנטיות שונות. חשוב לציין שניתן להשתמש בשיטה זו לסירוגין כדי לכמת את צריכת חומצות האמינו בקווי תאים בתרבית או בתאים ראשוניים במבחנה או בפירי עצם מבודדים ex vivo. לבסוף, השיטה שלנו יכולה להיות מותאמת בקלות כדי למדוד את ההובלה של כל חומצות האמינו, כמו גם גלוקוז וחומרים מזינים אחרים radiolabeled.
Introduction
חומצות אמינו הן תרכובות אורגניות המכילות קבוצות פונקציונליות של חומצות אמינו (-NH2) וקרבוקסיל (-COOH) עם שרשרת צדדית משתנה הספציפית לכל חומצת אמינו. באופן כללי, חומצות אמינו ידועות כמרכיב הבסיסי של חלבון. לאחרונה הובהרו שימושים חדשים ותפקודים של חומצות אמינו. לדוגמה, חומצות אמינו בודדות יכולות לעבור מטבוליזם כדי ליצור מטבוליטים ביניים התורמים לביו-אנרגיה, מתפקדים כקופקטורים אנזימטיים, מווסתים מיני חמצן תגובתי או משמשים לסינתזה של חומצות אמינו אחרות 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . מחקרים רבים מראים כי חילוף חומרים של חומצות אמינו הוא קריטי עבור פלוריפוטנטיות, שגשוג והתמיינות של תאים בהקשרים שונים 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
אוסטאובלסטים הם תאים מפרישים המייצרים ומפרישים את מטריצת העצם החוץ-תאית העשירה בקולגן מסוג 1. כדי לשמור על שיעורים גבוהים של סינתזת חלבונים במהלך היווצרות העצם, אוסטאובלסטים דורשים אספקה מתמדת של חומצות אמינו. כדי לענות על דרישה זו, osteoblasts חייב לרכוש באופן פעיל חומצות אמינו. בהתאם לכך, מחקרים אחרונים חושפים את החשיבות של ספיגת חומצות אמינו וחילוף חומרים בפעילות אוסטאובלסטים וביצירת עצם 15,16,17,18,19,20.
אוסטאובלסטים רוכשים חומצות אמינו תאיות משלושה מקורות עיקריים: סביבה חוץ-תאית, פירוק חלבונים תוך-תאיים וביוסינתזה של חומצות אמינו דה-נובו. פרוטוקול זה יתמקד בהערכת ספיגת חומצות אמינו מסביבה חוץ-תאית. השיטות הנפוצות ביותר למדידת ספיגת חומצות אמינו מסתמכות על חומצות אמינו בעלות תווית רדיו (למשל, 3שעות או 14מעלות צלזיוס) או על איזוטופים כבדים המסומנים (למשל, 13מעלות צלזיוס). מבחני איזוטופומרים כבדים יכולים לנתח ספיגת חומצות אמינו וחילוף חומרים בצורה יסודית ובטוחה יותר, אך לוקח להם זמן רב יותר להשלים מספר ימים מכיוון שלוקח יום להכין ולהפיק דגימות ומספר ימים לנתח בספקטרומטר המסה בהתאם למספר הדגימות21,22. לשם השוואה, מבחני ספיגת חומצות אמינו מסומנים ברדיו אינם אינפורמטיביים לגבי חילוף החומרים במורד הזרם, אך הם זולים ומהירים יחסית, וניתן להשלים אותם תוך 2-3 שעות מתחילת הניסוי23,24. כאן אנו מתארים פרוטוקול בסיסי הניתן לשינוי בקלות, שנועד להעריך קליטת חומצות אמינו בתרבית או בקווי תאים במבחנה או בצירי עצם בודדים ex vivo. ניתן להרחיב את היישום של שני פרוטוקולים אלה לחומצות אמינו אחרות המסומנות ברדיו ולסוגי תאים ורקמות אחרים הקשורים לעצמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הליכי העכבר המתוארים כאן אושרו על ידי ועדות המחקר בבעלי חיים במרכז הרפואי של אוניברסיטת טקסס סאות'ווסטרן בדאלאס. פרוטוקול הקרינה אושר על ידי הוועדה המייעצת לבטיחות קרינה במרכז הרפואי של אוניברסיטת טקסס סאות'ווסטרן בדאלאס.
1. ספיגת חומצות אמינו בתאים (פרוטוקול I)
- צלחת 5 x 104 תאי ST2 בכל באר של צלחת תרבית רקמה 12 בארות. תאי צלחת ב-α-MEM המכילים 10% FBS, 100 U/mL פניצילין ו-0.1 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין (Pen/Strep). צלחת בארות נוספות של תאים כדי לכמת את מספר התא לכל תנאי עבור הנורמליזציות בשלב 1.12. דגירה של תאים באינקובטור של תרבית תאים לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
- תרבית את התאים במשך 2-3 ימים עד למפגש.
- ביום הניסוי, הכינו את הפתרונות הבאים: 1x פוספט תמיסת מלח (PBS), pH 7.4 וחיץ קרבס רינגרס HEPES (KRH), pH 8.0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM D-גלוקוז). מחממים ל-37 מעלות צלזיוס.
- שאפו את המדיום ושטפו את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של 1x PBS, pH 7.4.
הערה: פרוטוקול זה מתאים גם לחלוקה מהירה של תאים שאינם מתמזגים. במקרה זה, חשוב לנרמל את הרדיואקטיביות למספר תאים מוחלט או לתוכן DNA. בנוסף, שקול להגדיל את גודל צלחת התרבית או בקבוק כדי להגדיל את מספר התא הכולל ואת ערכי cpm. זה חשוב כדי לקבוע אמפירית על בסיס אישי. - שאפו 1x PBS ושטפו את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל KRH.
- צור 4 μCi/mL L-[3,4-3 H]-מדיה עובדת של גלוטמין על ידי דילול 4 μL של [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-גלוטמין לכל 1 מ"ל של KRH.
הערה: לפני השימוש בחומרים רדיואקטיביים, אנא צור קשר עם המשרד לבטיחות קרינה במוסד הבית שלך כדי לקבל אישורים. כל ההליכים הקשורים לקרינה חייבים להתבצע מאחורי מגן הפרספקס. - דגירה של תאים עם 0.5 מ"ל של KRH המכילים 4 μCi/mL L-[3,4-3 H]-מדיה עובדת גלוטמין במשך 5 דקות.
- לאסוף את המדיום הרדיואקטיבי ולטפטף לתוך מיכל פסולת נוזלית. שטפו את התאים שלוש פעמים לזמן קצר עם KRH קר כקרח כדי לסיים את התגובה. לאסוף ולהשליך את כל השטיפות במיכל פסולת נוזלית רדיואקטיבית.
- הוסיפו 1 מ"ל של 1% SDS לכל באר וטריטוראט פי 10 כדי לליז ולהומוגניזציה של התאים. העבר את התא lysates ל 1.5 מ"ל צינורות. יש להשליך צלחות תרבית תאים, פיפטות סרולוגיות וקצות פיפטה במיכל הפסולת הרדיואקטיבית המוצקה.
- צנטריפוגה ב->10,000 x גרם למשך 10 דקות. מעבירים את הסופרנאטנטים לבקבוקוני ה-scintillation המכילים 8 מ"ל מתמיסת ה-Scintillation. מערבבים על ידי ניעור בקבוקוני הנצנוץ במרץ. יש להשליך צינורות וקצות פיפטה במיכל פסולת רדיואקטיבית מוצקה.
- קרא רדיואקטיביות בספירות לדקה (cpm) באמצעות מונה Scintillation. יש להשליך את בקבוקוני ה-Scintillation במיכל פסולת הבקבוקונים של Scintillation.
- טריפסיניזציה, החייאה וספירה של התאים מהלוחות הלא רדיואקטיביים הנותרים של התאים (ראו שלב 1.1) כדי להעריך את מספר התאים בתרביות הרדיואקטיביות המוזנחות. באמצעות המוציטומטר, לספור את מספר התאים לכל באר לא רדיואקטיבית עבור כל מצב ניסיוני. נרמל את ה-cpm משלב 1.11 למספר התא המשוער מהלוחות הלא רדיואקטיביים.
- לאחר השלמת הניסוי, יש לפרק את מכסה המנוע של תרבית התאים, הספסל וכל המכשירים באמצעות תרסיס רדיואקטיבי. לבסוף, בצע בדיקות מחיקה כדי לוודא שאזור העבודה נקי מקרינה.
2. ספיגת חומצות אמינו ברקמות עצם שבודדו טריות (פרוטוקול II)
- מחממים KRH ל-37 מעלות צלזיוס.
- להרדים עכבר בן 3 ימים ולהסיר את העור על הזרועות. יש לפרק את ההומרי מהכתף באמצעות מספריים ולנתח את שני ההומרים. הסר את כל הרקמות extemporaneous באמצעות אזמל ומלקחיים. הסר את epiphyses מן העצם.
הערה: בנוסף ל- humerii, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לפמורה ילודים, tibiae ו calvariae, כמו גם humerii, פמורה ו tibiae מבודדים מעכברים בני 2 ו -4 חודשים (נתונים שלא פורסמו). - יש לשטוף את מח העצם מהעצם ולשקול את פירי העצם כדי לנרמל בשלב 2.14.
- מרתיחים הומרוס אחד ב-PBS אחד בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להפוך את העצם לשונה. עצם מבושלת decellularized משמש שליטה שלילית.
הערה: כבקרת איכות, פרפין מטמיע את העצמות המבושלות והלא מבושלות לכתמים היסטולוגיים כדי לאשר חזותית שהרתחה הייתה יעילה בדה-צלוליזציה של העצם. - שיווי משקל הן humeri ב 1 מ"ל של KRH במשך 30 דקות באינקובטור תרבית התא ב 37 מעלות צלזיוס.
- צור פתרון עובד של 4 μCi/mL L-[2,3,4-3 H]-ארגינין ב-KRH על-ידי דילול 4 μL של 1μCi/μL L-[2,3,4-3 H]- מלאי ארגינין לכל 1 מ"ל KRH.
הערה: פרוטוקול זה מתאים כדי להעריך את הספיגה של כל חומר מזין עם תווית רדיו שנבחר. L-[2,3,4-3 H]-גלוטמין, L-[14CU]-אלנין ו-L-[2,3-3 H]-פרולין נבדקו עם תוצאות דומות. נתוני ארגינין מוצגים כדי להדגיש את התועלת של פרוטוקול זה.
התראה: כל ההליכים באמצעות קרינה חייבים להתבצע מאחורי מגן הפרספקס תוך שימוש בציוד מגן אישי מתאים (PPE). - דגירה הן של עצם הבקרה הניסיונית והן של עצם הבקרה המבושלת בנפרד ב-KRH המכילה 4 μCi/mL L-[2,3,4-3 H]-ארגינין למשך עד 90 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
הערה: חשוב לקבוע באופן אמפירי את זמני הדגירה עבור תנאים שונים, כולל גיל העכברים, אלמנטים שונים בשלד וסוגי חומצות אמינו radiolabeled על ידי ביצוע קורס זמן. הרוויה מתרחשת לרוב לאחר כ-3-4 שעות. יש להעריך את הקליטה בנקודת זמן בזעם הליניארי של הקליטה. - יש להסיר את המדיום הרדיואקטיבי ולהשליך למיכל הפסולת הרדיואקטיבית הנוזלית. יש לשטוף את humeri שלוש פעמים באמצעות קור כקרח 1 מ"ל של KRH כדי לסיים את התגובה. יש להשליך את כל השטיפות במיכל הפסולת הרדיואקטיבית הנוזלית.
- מעבירים כל עצם לצינור של 1.5 מ"ל. הוסף 500 μL של מאגר RIPA [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8.0); 0.5% NP40 (v/v); 0.5% DOX (w/v); 0.1% SDS (w/v)]. השליכו את לוחות התרבית, הפיפטות הסרולוגיות וקצות הפיפטה במיכל פסולת מוצקה רדיואקטיבית.
- הומוגני את humeri על ידי קיצוץ 100 פעמים עם מספריים במאגר RIPA.
- סוניקט (משרעת: 35%, דופק 1 שניות) העצם ההומוגנית המתקבלת במשך 10 שניות.
הערה: סוניקציה ידועה גם כמייצרת אירוסולים. ניתן לבצע צעדי סוניקציה בארון בטיחות ביולוגי. כדי להפחית את היווצרות אירוסול, חשוב לא למלא את הצינורות. סוניקציה של נפחי דגימה קטנים עלולה לגרום לסוניקציה לא שלמה או לאובדן דגימה עקב קצף. אם מתרחשת הקצפה, צנטריפוגה את הדגימה במשך 5 דקות כדי לשקוע. - להבהיר את הליזאט על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב >10,000 x גרם בטמפרטורת החדר. מעבירים 200 μL של ה-supernatant לבקבוקוני scintillation המכילים 8 מ"ל של תמיסת ה-scintillation. מערבבים על ידי ניעור בקבוקוני הנצנוץ במרץ. השליכו את כל הפסולת הרדיואקטיבית המוצקה (למשל, צינורות משומשים, קצוות פיפטה, צלחות וכו') במיכל הפסולת הרדיואקטיבית המוצקה.
- קרא רדיואקטיביות (cpm) באמצעות מונה Scintillation. יש להשליך בקבוקוני scintillation משומשים במיכל הפסולת הרדיואקטיבית המיועד לבקבוקוני scintillation.
- הפחת את ה- cpm של עצם מבושלת (ערך בסיסי) מה- cpm של עצם ניסיונית. לנרמל את הרדיואקטיביות עם משקל העצם משלב 2.3.
- רססו את מכסה המנוע, המכשירים והספסל של תרבית התאים בחומר מתפרק רדיואקטיביות. בצע בדיקות מחיקה כדי לוודא שאזור העבודה נקי מקרינה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הובלת חומצות אמינו מווסתת על ידי מובילי חומצות אמינו רבים הקשורים לממברנה אשר סווגו למערכות הובלה נפרדות המבוססות על מאפיינים רבים, כולל ספציפיות מצע, קינטיקה, כמו גם תלות יונים ו- pH25. לדוגמה, ספיגת גלוטמין יכולה להיות מתווכת על ידי מערכות ההובלה התלויות Na+ A, ASC, γ+L ו- N או מערכת L הבלתי תלויה ב- Na+-. המערכות התלויות ב-Na+ נבדלות על ידי היכולת להחליף את Li+ ב-Na+ (מערכת N) או ברגישות לחומצה האנלוגית 2-(מתילאמינו)איזובוטירית (MeAIB) (מערכת A). מטרת הניסוי הייתה להגדיר את כמות צריכת הגלוטמין המיוחסת לכל מערכת הובלה. ספיגת גלוטמין L-[3,4-3 שעות] נמדדה בתאי ST2 נפגשים ב-KRH רגיל המכיל 120 mM NaCl, KRH נטול Na+ המכיל 120 mM כולין כלוריד, KRH רגיל המכיל 5 mM MeAIB או NA+ ללא KRH המכיל 120 mM LiCl. סך הרדיואקטיביות (ספירות לדקה) נורמל למספר התא. הסרת Na+ הובילה להפחתה של 90% בספיגת גלוטמין. זה הצביע על כך שמערכת L אחראית ל-10% מספיגת הגלוטמין בעוד ש-90% מספיגת הגלוטמין תלויה בתאי NA+ בתאי ST2 (איור 2). נוכחות Li+ רק הגדילה את ספיגת הגלוטמין ב-2% בהשוואה למצב נטול Na+ ואילו 5 mM MEAIB לא השפיעו על ספיגת הגלוטמין. נתונים אלה מצביעים על כך שרוב ספיגת הגלוטמין מתווכת על ידי מערכות ASC ו- γ + L בעוד שמערכת N ומערכת A אחראיות לכ-2% ו-0% מספיגת גלוטמין תלוית Na+, בהתאמה.
שינינו את פרוטוקול I כדי לאפיין ספיגת חומצות אמינו בפירי עצם ex vivo. בניסוי זה פעלנו לפי פרוטוקול II כדי לאפיין קינטיקה של ספיגת ארגינין בעצמות ארוכות מבודדות מעכברים בני 3 ימים (p3). כדי לעשות זאת, ניתחנו תחילה את שני ההאמריים מעכברי p3. האפיפיסות הוסרו, והמח נסובב החוצה וכל הומרוס נשקל לנורמליזציה. ההומרוס הקונטרלטרלי הוגדר כבקרה שלילית והורתח כדי להרוג את הפעילות התאית. לאחר מכן, ההאמריים הניסיוניים והמבושלים הודגמו עם 4μCi/mL L-[2,3,4-3 H]-ארגינין למשך עד שעתיים. ספיגת הארגינין עלתה באופן ליניארי במהלך הניסוי הזה (איור 3A). לשם השוואה, ההומרי המבושל לא הפגין עלייה דינמית בספיגת ארגינין בניסוי זה, אלא היה בעל רדיואקטיביות בסיסית המיוחסת לספיחה של הגשושית במטריצת העצם. ספיגת הארגינין המנורמלת והמתוקנת מוצגת באיור 3B.
איור 1: זרימת עבודה של מבחני ספיגת חומצות אמינו עם תווית רדיו. סקירה סכמטית של מבחני ספיגת חומצות אמינו במבחנה (פרוטוקול I) ובעצמות ex vivo (פרוטוקול II). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: תכונות קינטיות של L-[3,4-3 שעות]-ספיגת גלוטמין ב-ST2 במבחנה. (A) L-[3,4-3 שעות]-מבחני ספיגת גלוטמין המבוצעים בנוכחות (+) או היעדרות (-) של נתרן (Na+), MeAIB או ליתיום (Li+) בתאי ST2. (B) אחוז התרומות המשוערות של מערכת A, N, L או ASC ו- γ + L לספיגת גלוטמין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: Ex vivo L-[2,3,4-3 H]-ספיגת ארגינין בהאמרי יילודים. (A) L-[2,3,4-3 H]-ספיגת ארגינין שבוצעה במשך 2 שעות בהומרי חי ומבושל שבודד מעכברי C57BL/6 בני 3 ימים. (B) L-[2,3,4-3 שעות]-ספיגת ארגינין עם הומרי מבושל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מספק גישה מהירה ורגישה להערכת ספיגת חומצות אמינו בתגובה לתמורות ניסיוניות שונות במבחנה או ex vivo. בהשוואה לערכות הזמינות מסחרית (למשל, גלוטמין וערכת קביעת גלוטמט), שיטה זו הרבה יותר רגישה, מהירה ופחות דורשתעבודה של 16,17,25. בפרוטוקול שלנו, אנו מעריכים קליטה במאגר קרבס רינגרס HEPES. אנו משתמשים במדיה זו מכיוון שהיא נוסחה בסיסית המאפשרת שינויים מהירים וקלים כדי לבחון מגוון רחב של תנאים לאפיון ספיגת חומצות אמינו. לדוגמה, כדי לבדוק אם מערכת ההובלה תלויה ב-Na+, אנו יכולים פשוט להחליף את NaCl בכולין כלוריד כדי להפוך את Na+ ללא KRH. גמישות זו היא יתרון לחקור את מערכות התחבורה השונות המתווכות קליטה של חומצות אמינו בודדות. מדיית צמיחה בסיסית כגון alpha-MEM מתאימה גם לבדיקה זו. במקרה זה, אנו בדרך כלל רוכשים אלפא-MEM שחסרה את חומצת האמינו הבודדת המדוברת, אשר מוחלפת בחומצת האמינו הרדיו-תווית עבור הניסוי. לדוגמה, כדי להעריך את ספיגת הגלוטמין אנו משתמשים באלפא-MEM נטול גלוטמין בתאי סטרומאל ראשוניים של מח העצם15. ל- KRH יש כמה מגבלות בשל הרכבו הפשוט. KRH אינה אפשרות אידיאלית אם המטרה היא ללמוד מערכות תחבורה אקטיביות משניות כגון אוהדים ואנטיפורטרים. לדוגמה, ספיגת לאוצין דרך Slc7a5/Slc3a2 מתרחשת בתמורה לגלוטמין. במקרה זה, ספיגת לאוצין עשויה להיות מוערכת בשל חוסר גלוטמין ב- KRH; במקום זאת, עדיף להשתמש במדיום אלפא-MEM נטול לאוצין במקרה זה. כמו כן חשוב לציין כי השימוש במונה גייגר אינו חובה בעת עבודה עם איזוטופ 3H. עם זאת, מומלץ לשמור על מונה גייגר פועל כמחווה כדי להתריע בפני אנשים שאתה עובד עם קרינה.
שליטה קריטית ומחייבת עבור הפרוטוקול השני היא הרתיחה של העצם הקונטרלטרלית. זה הכרחי מכיוון שמטריצת העצם יכולה לספוג חומצות אמינו רדיואקטיביות ללא תלות בהובלה קלה על ידי תאי עצם. על ידי דה-צלוליזציה של העצם, אנו יכולים להעריך את כמות הקרינה הלכודה על ידי מטריצת העצם ולהשתמש בה כרדיואקטיביות הבסיסית כדי לנרמל את הקליטה. שליטה חשובה נוספת היא לשקול את העצמות לאחר הסרת epiphyses ומח. משקל העצם משמש לנרמול הספיגה ביחס לגודל פיר העצם. זה חשוב מכיוון שגודל העצמות עשוי להשתנות בשל גורמים רבים החל משונות במהלך הסרת האפיפיסות ועד מוטציות גנטיות המשפיעות על הצמיחה. שיטה חלופית היא לכמת את תכולת הדנ"א של פיר העצם לצורך נורמליזציה. מניסיוננו, נרמול תכולת הדנ"א דומה למשקל העצם אך מוסיף שלבים נוספים העוסקים בחומרים רדיואקטיביים. לכן, אנו מעדיפים לנרמל למשקל העצם.
פרוטוקולים אלה יכולים להיות מותאמים לקווי תאים, כולל ATDC5, MC3T3, 293, או תאים ראשוניים אחרים כגון אוסטאובלסטים קלבריאליים, כונדרוציטים, תאים סטרומליים של מח עצם, מקרופאגים של מח עצם ואוסטאוקלסטים. בנוסף, הפרוטוקולים ניתנים להתאמה בקלות להערכת איזוטופים רדיואקטיביים אחרים (למשל, 14C ו-35S) כמו גם חומרים מזינים שונים, כולל חומצות אמינו, גלוקוז וחומצות שומן. יתר על כן, ניתן להתאים את הפרוטוקול השני גם לעצמות בוגרות ולתרביות כדוריות, תוך התחשבות בהתאמה לזמן הדגירה. למרות שפרוטוקול זה ניתן להתאמה גבוהה, חשוב לאפיין את הקינטיקה של המולקולות המסומנות באיזוטופים החדשים או בקווי תאים חדשים לפני ביצוע ניסויים. קינטיקה של ההובלה עשויה להשתנות באופן דרסטי בין מולקולות שונות, איזוטופים שונים או סוגי תאים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין גילויים.
Acknowledgments
מעבדת קרנר נתמכת על ידי מענקי R01 של המכון הלאומי לבריאות (AR076325 ו-AR071967) ל-C.M.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 1 mL syringe | BD precision | 309628 | |
| 30G Needle | BD precision | 305106 | |
| Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | |||
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Choline chloride | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissection Tool | Forceps, scissors, scapels | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamine | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Liquid scintilation vials | Sigma | Z190535 | |
| Lithium chloride solution, 8M | Sigma | L7026 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| Microcentrifuge tube, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic&Materials | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (Scintillation solution) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Methylamino)isobutyric acid | Sigma | M2383 |
References
- Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
- Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).
- Karner, C. M., Long, F. Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts. Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).
- Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).
- Nagano, T., et al. Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species. Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).
- Comes, S., et al. L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation. Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).
- Fan, J., et al. Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia. Molecular Systems Biology. 9, 712 (2013).
- Hosios, A. M., et al. Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells. Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).
- Welbourne, T. C. Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney. Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).
- Sullivan, L. B., et al. Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells. Cell. 162 (3), 552-563 (2015).
- Nelsen, C. J., et al. Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression. The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).
- Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor. Nature Communications. 7, 11457 (2016).
- Green, C. R., et al. Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis. Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).
- Shiraki, N., et al. Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation. Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Hu, G., et al. The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).
- Rached, M. T., et al. FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts. Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).
- Elefteriou, F., et al. ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae. Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).
- Maleknia, S. D., Johnson, R. Mass spectrometry of amino acids and proteins. Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).
- Rennie, M. J. An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism. The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).
- Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone. Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).
- Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. Active transport of amino acids into bone cells. Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).
- Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).
