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Um estudo piloto sobre a estimulação magnética transcraniana repetitiva dos níveis de Aβ e Tau em fluido cerebrospinal de macaco rhesus

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DOI:

10.3791/63005

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3 de setembro de 2021

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1Department of Rehabilitation Medicine, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Rehabilitation Medicine, Daping Hospital, Army Medical University, 3Key Laboratory of Rehabilitation Medicine in Sichuan Province, West China Hospital, Sichuan University, 4Department of physiology, Southwest Medical University, 5Department of Rehabilitation Sciences, The Hong Kong Polytechnic University, 6Laboratory of Nonhuman Primate Disease Modeling Research, State Key Laboratory of Biotherapy, West China Hospital, Sichuan University, 7Sichuan Kangcheng Biotech Co., Inc.

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos o procedimento para um estudo piloto para explorar o efeito da estimulação magnética transcraniana repetitiva com diferentes frequências (1 Hz/20 Hz/40 Hz) em Aβ e metabolismo tau em fluido cerebrospinal de macaco rhesus.

Resumo

Estudos anteriores demonstraram que um regime não invasivo de cintilação de luz e estimulação de tom auditivo poderia afetar o metabolismo de Aβ e tau no cérebro. Como técnica não invasiva, a estimulação magnética transcraniana repetitiva (rTMS) tem sido aplicada para o tratamento de distúrbios neurodegenerativos. Este estudo explorou os efeitos do rTMS nos níveis de Aβ e tau no fluido cefalorraquidiano rhesus macaco (CSF). Este é um estudo único-cego, auto-controlado. Três frequências diferentes (baixa frequência, 1 Hz; altas frequências, 20 Hz e 40 Hz) de rTMS foram utilizadas para estimular o córtex pré-frontal bilateral-dorsolateral (DLPFC) do macaco rhesus. Foi utilizado um método de cateterismo para a coleta de CSF. Todas as amostras foram submetidas à detecção de chips líquidos para análise de biomarcadores CSF (Aβ42, Aβ42/Aβ40, tTau, pTau). Os níveis de biomarcadores CSF mudaram com o tempo após a estimulação por rTMS. Após a estimulação, o nível Aβ42 em CSF mostrou uma tendência de alta em todas as frequências (1 Hz, 20 Hz e 40 Hz), com diferenças mais significativas para as altas frequências (p < 0,05) do que para a baixa frequência.

Após rTMS de alta frequência, o nível total de Tau (tTau) de CSF aumentou imediatamente no ponto de tempo pós-rTMS (p < 0,05) e diminuiu gradualmente em 24 horas. Além disso, os resultados mostraram que o nível de Tau fosfoilado (pTau) aumentou imediatamente após 40 Hz rTMS (p < 0,05). A razão de Aβ42/Aβ40 mostrou tendência de alta em 1 Hz e 20 Hz (p < 0,05). Não houve diferença significativa nos níveis de tau com estimulação de baixa frequência (1 Hz). Assim, as altas frequências (20 Hz e 40 Hz) de rTMS podem ter efeitos positivos nos níveis de Aβ e tau no macaco rhesus CSF, enquanto a baixa frequência (1 Hz) rTMS só pode afetar os níveis de Aβ.

Introdução

Amilóide-β (Aβ) e tau são importantes biomarcadores CSF. Aβ consiste em 42 aminoácidos (Aβ1-42), que é o produto da proteína precursora amiloide transmembrana (APP) hidrolisada por β e γ-secretas1. Aβ1-42 pode agregar-se em placas amiloides extracelulares no cérebro por causa de suas características de solubilidade1,2. Tau é uma proteína associada a microtúbulos que está presente principalmente em axônios e está envolvida no transporte axonal anterogrado3. A hiperfosforilação tau anormal é induzida principalmente pelo desequilíbrio entre quinases e fosfatases, resultando no descolamento de tau de microtúbulos e na formação de emaranhados neurofibrilares (NFT)1. A concentração de tau aumenta no CSF porque as proteínas tau e fosforiladas tau (pTau) são liberadas no espaço extracelular durante o processo neurodegenerativo. Estudos anteriores mostraram que os biomarcadores de CSF são relevantes para as três principais alterações patológicas do cérebro da doença de Alzheimer (DA): placas amiloides extracelulares, formação de NFT intracelular e perda de neurônios4. Concentrações anormais de Aβ e tau presentes no estágio inicial da DA, permitindo assim o diagnóstico precoce da DA5,6.

Em 2016, Tsai et al. descobriram que a luz não invasiva (40 Hz) reduziu os níveis de Aβ1-40 e Aβ1-42 no córtex visual de ratos pré-depósito7. Recentemente, eles relataram ainda que a estimulação de tons auditivos (40 Hz) melhorou o reconhecimento e a memória espacial, reduziu os níveis de proteína amiloide no hipocampo e córtex auditivo (AC) de camundongos 5XFAD e diminuiu as concentrações de pTau no modelo de tauopatia P301S8. Esses resultados indicam que técnicas não invasivas podem impactar o metabolismo de Aβ e Tau.

Como uma ferramenta não invasiva, a estimulação magnética transcraniana (TMS) poderia estimular eletricamente o tecido neural, incluindo a medula espinhal, nervos periféricos e córtex cerebral9. Além disso, pode modificar a excitabilidade do córtex cerebral no local estimulado e nas conexões funcionais. Portanto, a TMS tem sido utilizada no tratamento de distúrbios neurodegenerativos e testes prognósticos e diagnósticos. A forma mais comum de intervenção clínica em TMS, rTMS, pode induzir ativação do córtex, modificar a excitabilidade do córtex e regular a função cognitiva/motora.

Foi relatado que 20 Hz rTMS teve um efeito neuroprotetor in vitro contra estressores oxidativos, incluindo glutamato e Aβ e melhorou a viabilidade geral das células HT22 hipocampal monoclonais em camundongos10. Após a estimulação de rTMS de 1 Hz, a enzima app-cleaving de β local 1, APP, e seus fragmentos de terminal C no hipocampo foram consideravelmente reduzidos. Notavelmente, o comprometimento da potencialização a longo prazo, aprendizagem espacial e memória no CA1 hipocampal foi revertido11,12. Bai et al. investigaram o efeito de rTMS na disfunção de oscilação gama induzida por Aβ durante um teste de memória de trabalho. Eles concluíram que a rTMS poderia reverter a disfunção induzida por Aβ, resultando em benefícios potenciais para a memória de trabalho13. No entanto, há poucos relatórios sobre os efeitos do rTMS no metabolismo tau e as mudanças dinâmicas em Aβ e tau em CSF antes e depois da rTMS. Este protocolo descreve o procedimento para investigar os efeitos do rTMS em diferentes frequências (baixa frequência, 1 Hz; altas frequências,20 Hz e 40 Hz) nos níveis Aβ e tau no macaco rhesus CSF.

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Protocolo

Todos os experimentos foram realizados sob a Orientação para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, formulada pelo Ministério da Ciência e Tecnologia da República Popular da China, bem como os princípios da Declaração de Basileia. A aprovação foi dada pelo Comitê de Cuidados Com Animais do Hospital da China Ocidental da Universidade de Sichuan (Chengdu, China). A Figura 1 mostra o projeto de estudo autônomo e cego usado aqui.

1. dispositivos rTMS

  1. Use uma bobina estimuladora de campo magnético em 8 formas para realizar a estimulação rTMS.

2. Animal

  1. Mantenha o macaco rhesus macho (Macaca mulatta, 5 kg, 5 anos) em uma gaiola doméstica individual com acesso livre à água da torneira e chow padrão. Certifique-se de que as condições ambientais sejam controladas para proporcionar uma umidade relativa de 60-70%, uma temperatura de 24 ± 2 °C, e uma luz de 12:12 h: ciclo escuro14,15. Realizar todos os experimentos de acordo com a Orientação para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

3. Um método de amostragem CSF cisterna magna serial

  1. Que dois experimentadores treinados realizem um método de cateterismo para amostrar CSF da cisterna magna (Figura 2).
  2. Posicionamento
    1. Anestesiar o macaco por uma injeção intramuscular de 5 mg/kg de zolazepam-tiletamina (ver a Tabela de Materiais). Para garantir a anesthetização bem sucedida do macaco, procure respiração profunda e lenta, reflexo maçante ou ausente da córnea, e relaxamento dos músculos das extremidades. Monitore sua temperatura, pulso, respiração, cor da membrana mucosa e tempo de recarga capilar durante esta fase.
    2. Administre 2 mg/kg de morfina por injeção intramuscular a cada 4 horas.
    3. Coloque o macaco sobre uma mesa de operação na posição de decúbito lateral. Dobre o pescoço do macaco, incline a parte de trás do macaco, e traga os joelhos em direção ao peito.
  3. Punção
    1. Para desinfecção, prepare a área ao redor da parte inferior das costas usando técnica asséptica. Insira uma agulha espinhal entre as vértebras lombares L4/L5, empurre-a até que haja um "pop" quando entrar na cisterna lombar onde o flavum ligamentum está alojado.
    2. Empurre a agulha novamente até que haja um segundo "pop" onde ela entra na dura mater. Retire o estom com a agulha espinhal e colete gotas de CSF.
  4. Inserção de cateter
    1. Sob orientação fluoroscópica, insira o cateter peridural através da agulha de punção no espaço subaracnóide até que esteja flutuando na cisterna magna.
  5. Implantação de portas
    1. Faça uma incisão de 5 cm do local da punção até a direção da cabeça e isole a pele do tecido subcutâneo para colocar a porta de amostragem. Conecte a porta ao fim do cateter peridural e implante a porta sob a pele; então, suturar a incisão. Desinfete a ferida diariamente para evitar infecções.
      NOTA: O macaco se recupera totalmente no dia seguinte à cirurgia.
  6. Coleção CSF
    1. Use as barras da gaiola para conter o macaco e mantenha as costas dobradas.
    2. Insira uma seringa no centro da porta de amostragem para extrair o CSF da cisterna magna através do cateter. Descarte os primeiros 0,2 mL de CSF (o volume total do cateter e da porta é de 0,1 mL), e depois colete 1 mL de CSF para análise16.

4. Treinamento adaptativo da cadeira de macaco

  1. Fixar o macaco na cadeira do macaco antes do experimento para evitar interromper o processo de intervenção rTMS (Figura 3A,B).
  2. Coletar CSF para análise biomarcadora no estado acordado do macaco para evitar a influência de drogas anestésicos.
  3. No terceiro dia após o cateterismo subaracnóide, duas semanas antes do início do experimento, submete o macaco a treinamento adaptativo com a cadeira de macaco, duas vezes por dia, por 30 minutos cada vez.

5. rTMS treinamento adaptativo/estimulação sham

  1. Realize o treinamento adaptativo rTMS/estimulação sham uma semana após o treinamento adaptativo com a cadeira de macaco, uma semana antes do início do experimento formal para evitar dificultar o progresso do experimento por causa de vibrações e sons durante o processo de estimulação.
  2. Use uma bobina falsa (que só produz vibração e som e não gera um campo magnético) para estimular o macaco. Ofereça alimentos ao macaco após a estimulação para ajudá-lo a se adaptar ao processo (Figura 3C).
  3. Realize o treinamento adaptativo rTMS em uma cadeira de macaco duas vezes ao dia, por 30 minutos cada vez por um total de 2 semanas.

6. Protocolo de tratamento

  1. Utilize três frequências diferentes (1 Hz/20 Hz/40 Hz) de rTMS para estimular o bilateral-DLPFC (R-L-DLPFC) do macaco, como descrito anteriormente17. Localize o DLPFC de acordo com o sistema internacional 10-20.
    1. Realizar três sessões diferentes de rTMS com um período de lavagem superior a 24 h18,19.
      1. Para o primeiro período, utilize os seguintes parâmetros: uma frequência de 1 Hz para rTMS, um padrão de rTMS composto por 20 trens estourados, 20 pulsos com intervalos inter-trens de 10 s entre trens e uma intensidade de estimulação de 100% do limiar médio do motor de repouso (RMT), duas vezes por dia durante três dias consecutivos20,21.
      2. Para o segundo período, utilize os seguintes parâmetros: trens de alta frequência (20 Hz) rTMS com 100% de RMT para 2 s de duração com intervalos inter-trens de 28 s, um total de 2.000 estímulos (40 estímulos/trem, 50 trens) por sessão, duas vezes por dia durante três dias consecutivos22.
      3. Para o terceiro período, utilize os seguintes parâmetros: trens de frequência gama (40 Hz) rTMS com 100% de RMT entregues em 1 s de duração separados por intervalos inter-trens de 28 s. Mantenha o número total de pulsos para cada sessão o mesmo que com 20 Hz rTMS, duas vezes por dia durante três dias consecutivos7,22.

7. Biomarcadores CSF

  1. Analise quatro biomarcadores CSF: Aβ42, Aβ42/Aβ40, tTau e pTau.

8. Método de coleta e detecção de índices CSF

  1. Use um método de cateterismo minimamente invasivo para amostrar o CSF.
  2. Use as barras da gaiola para conter o macaco e mantenha as costas dobradas. Instrua o outro operador a inserir uma seringa no centro da porta de amostragem, garantindo que o CSF seja extraído através do cateter.
  3. Coletar CSF em 5 pontos de tempo (4 amostras por ponto de tempo em intervalos de 3 minutos): pré-rTMS, 0 h/2 h/6 h/24 h pós-rTMS23,24,25. Coletar um total de 60 amostras para 3 frequências; número e armazená-los em uma geladeira de -80 °C por até 1 mês. Após o experimento, submou todas as amostras à detecção de chips líquidos de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).

9. Análise estatística

  1. Apresentar todos os dados como média ± desvio padrão (SD).
  2. Realize o teste Shapiro-Wilk para testar a normalidade em caso de um pequeno tamanho amostral. Realize o teste de comparações múltiplas de ANOVA e Tukey de duas formas.
    NOTA: O valor (duas caudas) < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

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Resultados

Os resultados mostraram que a rTMS poderia afetar os níveis de Aβ e tau no CSF do macaco rhesus. Os níveis de biomarcadores CSF mudaram com o tempo após a estimulação de rTMS em diferentes frequências (1 Hz, 20 Hz e 40 Hz).

Aβ42 e Aβ42/Aβ40
Como mostrado na Figura 4A, após a estimulação de rTMS de 1 Hz, os níveis de Aβ42

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Discussão

Aβ1-42, um biomarcador bem estabelecido de AD, é um biomarcador de núcleo CSF relacionado ao metabolismo Aβ e formação de placas amiloides no cérebro e tem sido amplamente utilizado em ensaios clínicos e na clínica26. Estudos recentes têm demonstrado que a razão CSF Aβ42/Aβ40 é um melhor biomarcador diagnóstico do que apenas Aβ42 porque é um indicador melhor da patologia do tipo DA AD27,28. As pr...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer à Sichuan Green-House Biotech Co., Ltd por fornecer a cadeira de macaco e outros dispositivos relativos. Esta pesquisa não recebeu nenhuma subvenção específica de qualquer agência de financiamento nos setores público, comercial ou sem fins lucrativos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Kit de punção de anestesia para uso únicoWeigao, Shandong, China
Estimulador de campo magnético CCY-IYIRUIDE MEDICAL, Wuhan, China
GraphPad Prism versão 7.0GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, EUA
Painel de esferas magnéticas beta e tau amilóide humanaEMD Millipore Corporation, Billerica, MA 01821 EUAchip líquido detecção
MILLIPLEX Analyst 5.1EMD Millipore Corporation, Billerica, MA 01821 USA
Monkey Chair HH-E-1Brainsight, Cambridge, MA 02140 USA
Zoletil 50Virbac, Françazolazepam– Tiletamina

Referências

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