Este protocolo de dissociação de células neurais destina-se a amostras com uma baixa quantidade de material inicial e produz uma suspensão de célula única altamente viável para análise a jusante, com medidas de fixação e coloração opcionais.
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Artigo de método
Dissociação Mecânica e Enzimática Combinada do Tecido Hipocampal cerebral do rato
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este protocolo de dissociação neural (uma adaptação do protocolo que acompanha um kit comercial de dissociação cerebral adulta) otimiza o processamento de tecidos em preparação para análises detalhadas a jusante, como citometria de fluxo ou sequenciamento unicelular. A dissociação neural pode ser conduzida através de dissociação mecânica (como o uso de filtros, técnicas de corte ou trituração de pipetas), digestão enzimática ou uma combinação dela. A natureza delicada das células neuronais pode complicar os esforços para obter a suspensão de célula única altamente viável e verdadeira com detritos celulares mínimos necessários para análise unicelular. Os dados demonstram que essa combinação de dissociação mecânica automatizada e digestão enzimática consistentemente produz uma suspensão unicelular altamente viável (>90%), superando as dificuldades acima mencionadas. Embora algumas das etapas exijam destreza manual, essas etapas diminuem o manuseio da amostra e a perda potencial de células. Este manuscrito detalha cada etapa do processo para equipar outros laboratórios para dissociar com sucesso pequenas quantidades de tecido neural em preparação para análise a jusante.
Introdução
O hipocampo foi descrito pela primeira vez por um anatomista bolonhesa, Giulio Cesare Aranzio, em 1500. Ao nomear esta nova estrutura, Aranzio foi provavelmente inspirado por sua estranha semelhança com o cavalo-marinho do gênero Hipocampo1. O hipocampo está envolvido em respostas ao estresse, mas é amplamente conhecido por seu papel no aprendizado e na memória. Mais especificamente, o hipocampo é responsável pela codificação e recuperação da memória declarativa e espacial1.
O hipocampo, ou hipocampo propriamente dito, é dividido nos subcampos CA1 (cornu ammoni....
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Protocolo
Os experimentos foram realizados de acordo com os padrões éticos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UAMS. Camundongos fêmeas C57Bl6/J de 6 meses de idade foram comprados e agrupados (4 ratos por gaiola) sob um ciclo constante de 12 horas de luz/escuridão.
1. Preparação de reagentes
- Prepare a solução de estoque de manchas vivas/mortas fixas. Reconstitua a mancha fluorescente com 20 μL de sulfóxido de dimetila (DMSO).
- Enrole o frasco em papel alumínio, rotule-o como "Reconstituído", e armazene-o a -20 °C por até seis meses.
- Prepare uma solução salina de 0,9% com heparina. Diluir o....
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Resultados
As amostras foram processadas com um citômetro de fluxo em uma instalação central, e os dados resultantes foram avaliados com um pacote de software para análise de fluxo. Anteriormente, foram analisados os controles de compensação- a mancha viva/morta e o controle negativo. Se forem utilizados vários fluorochromes, os controles de fluorescência menos um (FMO) e os controles de uma única mancha devem ser preparados para cada anticorpo. A compensação pela sobreposição espectral para as amostras experimentais foi calculada .......
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Discussão
Várias etapas neste protocolo de dissociação neural requerem técnica proficiente e destreza-perfusão, aspiração supernante e remoção de mielina. Durante todo o processo de perfusão, os órgãos internos devem permanecer intactos (além de remover o diafragma e cortar o coração); isso inclui evitar as câmaras superiores do coração com a agulha borboleta. Enquanto a quantidade de soro fisiológico com heparina necessária varia, o fluido transparente que flui do coração indica que o processo está completo. O cérebro deve ser co.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos à Aimee Rogers por fornecer treinamento prático e suporte contínuo ao produto. Agradecemos à Dra. Agradecemos a Meredith Joheim e ao Grupo de Comunicação Científica da UAMS pela edição gramatical e formatação deste manuscrito. Este estudo foi apoiado pelo NIH R25GM083247 e NIH 1R01CA258673 (A.R.A).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de Microcentrífuga de 1,5 mL | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, cor sortida |
| 15 mL Falcon Tubes | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | Poliestireno |
| 25 mL Pipetas Sorológicas | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
| Tubo de Ensaio de Poliestireno de Fundo Redondo de 5 mL | Falcon | 352052 | |
| Filtro de Vácuo/ Armazenamento de 500 mL Sistema de Garrafas | Corning | 431097 | |
| 70 μ Filtro de células M | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Miltenyi Biotec | 130-107-677 | Contém Enzima P, Tampão Z, Tampão Y, Enzima A, Tampão A, Solução de Remoção de Detritos | |
| Folha de Alumínio | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
| Anti-ACSA-2-PE-Vio770, camundongo, clone REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Proteína Básica Anti-Mielina | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
| Anti-PSA-NCAM-PE, humano, camundongo e rato, Clone 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
| BD LSRFortessa | BD | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
| CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
| CD31 Anticorpo | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
| Agitador de placa quente de cerâmica | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
| Dimetilsulfóxido Fisher | Scientific | BP231-100 | |
| Etanol | Pharmco da Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon Tubos de Centrífuga Cônicos de 50 mL | Tesoura Fina Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | Perfusão |
| FlowJo | BD( | v10.7.0) | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator com Aquecedores | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Copo de Vidro | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
| Heparina sódica | Fresenius Kabi | 504011 | |
| Kit de Mancha de Células Mortas Aqua Fixável VIVO/MORTO | ThermoFisher | L34965 | |
| Barra de Agitação Magnética | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
| Noyes Tesoura de Mola Fine | Science Tools | 15012-12 | Dissecção |
| Paraformaldeído | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
| Pontas de pipeta GP LTS 20 µ L 960A/10 | Rainin | 30389270 | |
| Ponteiras de Pipeta GP LTS 250 µ L 960A/10 | Ponteiras | Rainin 30389277 | |
| RT LTS 1000 µ L FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
| Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μ L) | Rainin | 30386597 | |
| RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
| Balde de gelo redondo com tampa | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
| Tubos de fundo redondo com tampa do filtro de célula | Falcon | 100-0087 | |
| S1 Enchimentos de pipeta | ThermoFisher Scientific | 9541 | |
| Espátula e Sonda | Fine Science Tools | 10090-13 | Dissecção & |
| Conjunto de Infusão Asada Perfusion Surflo 23 G x 3/4" | Termuno | SV-23BLK | Agulha de borboleta |
| Rack de Tubo de Ensaio | Fisher Scientific | 14-809-37 | |
| Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher | descontinuado | Ou outra centrífuga de mesa padrão |
| Bomba Peristáltica de Fluxo Variável | Fisher Scientific | 13-876-2 | Modelo de fluxo baixo |
| Kit Inicial VetFlo para Ratos | Máscara | de Anestesia Kent Scientific VetFlo-MSEKIT | , tubulação, câmara de indução, latas de carvão |
| Sistema de Anestesia de Canal Único Vaporizador VetFlo | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2– 4 LPM |
| Vi-CELL XR Analisador de Viabilidade de Células | Beckman Coulter Life Sciences | 731196 | Contagem de Células |
| Vi-CELL XR 4 Sacos de Frascos de Amostra | Beckman Coulter Life Sciences | 383721 | Contagem de Células |
Referências
- Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, J. The Hippocampus Book. , Oxford University Press, Inc. (2007).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences ....
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Reimpressões e permissões
