Este protocolo detalha um método aprimorado para sintetizar altos rendimentos de proteínas recombinantes a partir de um sistema de tradução de transcrição livre de células (TX-TL) livre de células .
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Artigo de método
Um kit de ferramentas de transcrição de transcrição de estreptomíceos de alto rendimento para biologia sintética e aplicações de produtos naturais
Neste artigo
Resumo
Resumo
Estreptomias spp. são uma das principais fontes de antibióticos clínicos e produtos químicos industriais. Estreptomyces venezuelae ATCC 10712 é uma cepa de rápido crescimento e um produtor natural de clororamfenicol, jadomicina e espikromicina, o que o torna um candidato atraente como um chassi de biologia sintética de última geração. Portanto, ferramentas genéticas que aceleram o desenvolvimento da S. venezuelae ATCC 10712, bem como outros modelos de Estreptomia spp. são altamente desejáveis para a engenharia e descoberta de produtos naturais. Para isso, um sistema dedicado de isento de células S. venezuelae ATCC 10712 é fornecido neste protocolo para permitir a expressão heteróloga de alto rendimento de genes G+C (%) elevados. Este protocolo é adequado para reações em lote de pequena escala (10-100 μL) em formato de placa de 96 ou 384 poços, enquanto as reações são potencialmente escaláveis. O sistema livre de células é robusto e pode alcançar altos rendimentos (~5-10 μ M) para uma gama de proteínas recombinantes em uma configuração mínima. Este trabalho também incorpora um amplo instrumento de plasmídeo para medição em tempo real de mRNA e síntese proteica, bem como a coloração de fluorescência em gel de proteínas marcadas. Este protocolo também pode ser integrado com fluxos de trabalho de caracterização de expressão genética de alto throughput ou o estudo de vias enzimóricas de genes G+C (%) altos presentes nos genomas de Actinomycetes.
Introdução
Os sistemas de tradução de transcrição sem células (TX-TL) fornecem uma plataforma ideal de prototipagem para biologia sintética para implementar ciclos rápidos de projeto-construção-teste-aprender, a estrutura de engenharia conceitual para biologia sintética1. Além disso, há um crescente interesse em sistemas TX-TL para a produção de proteína recombinante de alto valor em um ambiente de reação aberta22, por exemplo, para incorporar aminoácidos não-padrão em conjugados de anticorpos 3. Especificamente, tX-TL requer um extrato celular, DNA plasmídeo ou linear, e uma solução energética para catalisa....
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Protocolo
NOTA: Veja a Tabela 1 e a Tabela 2 para receitas para placa de ágar e tampão de lavagem S30A e S30B.
1. Elaboração de soluções e orientação geral
- Mantenha todas as soluções, células (pós-crescimento) e extratos celulares no gelo após a preparação, a menos que uma exceção seja declarada.
- Estoques de armazenamento para 1 M Mg-glutamato, 4 M K-glutamato, 40% (w/v) PEG 6000, 1 g/mL de ácido polivinylsulfônico à temperatura ambiente e todos os outros estoques a -80 °C. Minimizar o número de ciclos de congelamento para evitar a degradação química.
- Para a elaboração de estoques de so....
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Resultados
Este protocolo detalhado é fornecido como um exemplo para ajudar o usuário a estabelecer um sistema TX-TL de Estreptomíces baseado na cepa do modelo S. venezuelae ATCC 10712 (Figura 1). O usuário pode procurar estudar outras cepas de Estreptomia; no entanto, os estágios de crescimento/colheita de outras cepas com tempos de duplicação mais longos ou preferências distintas de crescimento precisarão ser otimizados sob medida para alcançar resultados de pico. Para o re.......
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Discussão
Neste manuscrito, um protocolo S. venezuelae TX-TL de alto rendimento foi descrito com etapas detalhadas que são simples de conduzir tanto para usuários experientes quanto para novos usuários de sistemas TX-TL. Vários recursos dos protocolos Streptomyces45 e E. coli TX-TL41 foram removidos para estabelecer um protocolo mínimo, mas de alto rendimento para o S. venezuelae TX-TL5,26........
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores gostariam de reconhecer o seguinte suporte à pesquisa: EPSRC [EP/K038648/1] para SJM como PDRA com PSF; Wellcome Trust patrocinou bolsa issf para SJM com PSF no Imperial College London; Bolsa de pesquisa da Royal Society [RGS\R1\191186]; Prêmio Wellcome Trust SEED [217528/Z/19/Z] para SJM na Universidade de Kent; e Global Challenges Research Fund (GCRF) Bolsa de doutorado para KC na Universidade de Kent.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Frasco UltraYield de 2,5 L | Thomson | 931136-B | |
| 3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
| 384 Placa de fundo preta/transparente de 384 poços | ThermoFisher | 10692202 | |
| Cloreto de amônio (98%) | Fluorochem | 44722 | |
| ATP, CTP, UTP, GTP (solução de 100 mM, >99%) | ThermoFisher | R0481 | |
| Carbenicilina (contatar fornecedor para pureza) | Melford | C46000-25.0 | |
| D-(+)-glicose (contatar fornecedor para pureza) | Melford | G32040 | |
| DFHBI (≥ 98% - HPLC) | Sigma | SML1627 | |
| DTT (contatar fornecedor para pureza) | Melford | MB1015 | |
| FlAsH-EDT2 (contatar fornecedor para pureza) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
| Glicose-6-fosfato (>98%) | Sigma | G7879 | |
| HEPES Free Acid (contatar fornecedor para pureza) | Melford | B2001 | |
| Sal de hemimagnésio de ácido L-glutâmico tetrahidratado (>98%) | Sigma | 49605 | |
| Cloreto de magnésio (98%) | de | fluoroquímico | |
| Sigma | 70167-500G | ||
| PEG-6000 | Sigma | 807491 | |
| Pierce de 96 poços, 10K MWCO | ThermoFisher | 88260 | |
| Poly(vinil sulfato) sal de potássio | Sigma | 271969 | |
| Glutamato de potássio (>99%) | Amostrador | G1149 | |
| RTS | 5 Prime | 2401530 | |
| Cloreto de sódio (99%) | Fluorochem | 94554 | |
| Supelclean LC-18 SPE C-18 Coluna SPE (1 g) | Extrato | Sigma 505471 | |
| Melford | Y1333 | ||
| Equipamento | |||
| Platereader | BMG | Omega |
Referências
- Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66(2018).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis.
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Reimpressões e permissões
