Interfaces de hidrogel fotodegradável para triagem, seleção e isolamento de bactérias

Summary

O uso de hidrogéis fotodegradáveis para isolar células bacterianas utilizando uma ferramenta de pattering de luz de alta resolução é relatado. Procedimentos experimentais essenciais, resultados e vantagens do processo são revistos. O método permite o isolamento rápido e barato de bactérias-alvo que mostram funções raras ou únicas de comunidades ou populações heterogêneas.

Abstract

Biólogos há muito tentam entender a relação entre fenótipo e genótipo. Para entender melhor essa conexão, é crucial desenvolver tecnologias práticas que acoplam o rastreamento celular microscópico com isolamento celular em alta pureza para análise genética a jusante. Aqui, descreve-se o uso de hidrogéis polidegradáveis poli (etileno glicol) para triagem e isolamento de bactérias com fenótipos de crescimento únicos de populações de células heterogêneas. O método conta com encapsulamento ou tração de células com o hidrogel, seguido pela cultura, triagem microscópica, em seguida, uso de uma ferramenta de padronização de luz de alta resolução para controle espacial da degradação do hidrogel e liberação de células selecionadas em uma solução para recuperação. A aplicação de diferentes padrões de luz permite o controle sobre a morfologia da célula extraída, e padrões como anéis ou cruzes podem ser usados para recuperar células com exposição mínima direta à luz UV para mitigar danos ao DNA aos isolados. Além disso, a ferramenta de padronização da luz fornece uma dose de luz ajustável para alcançar várias taxas de degradação e liberação celular. Permite a degradação em alta resolução, permitindo a recuperação celular com precisão espacial em escala de micron. Aqui, demonstra-se o uso deste material para triagem e recuperação de bactérias de hidrogéis a granel e dispositivos microfabricados de laboratório em um chip. O método é barato, simples e pode ser usado para aplicações comuns e emergentes em microbiologia, incluindo o isolamento de cepas bacterianas com perfis raros de crescimento de bibliotecas mutantes e isolamento de consórcios bacterianos com fenótipos emergentes para caracterizações genômicas.

Introduction

O isolamento de células com comportamentos únicos de um ambiente complexo e heterogêneo é fundamental para a obtenção de informações genéticas na biologia¹. Na microbiologia, a seleção e isolamento de micróbios raros ou únicos após a observação torna-se importante em muitas aplicações que requerem uma conexão entre informações genômicas e informações fenotípicas observáveis. Essas aplicações incluem selecionar cepas fenotipicamente raras de bibliotecas mutantes², selecionar microrganismos-chave de comunidades microbianas complexas^3,4, e selecionar bactérias fenotipicamente raras, mas importantes de populações isogênicas. O isolamento de células viáveis, mas não culturais (VBNC) de uma população de bactérias é um exemplo importante deste último, onde as células com o fenótipo VBNC são frequentemente escondidas em populações de bactérias em 1:10² a 1:10⁵ proporções^5,6. Devido às dificuldades generalizadas no isolamento das bactérias, muito ainda é desconhecido sobre muitos microrganismos fenotipicamente raros. Essas limitações enfatizam a necessidade de técnicas de isolamento celular para primeiro identificar a célula-alvo ou células de uma mistura e, em seguida, recuperá-las e isolá-las para análise molecular a jusante⁷.

Alguns dos métodos mais comumente estabelecidos de isolamento celular incluem citometria de fluxo e classificação celular ativada fluorescente (FACS)^8,separação imunomagnética^9,10e microfluidos¹¹. Embora esses métodos de isolamento tenham alto valor, eles também têm desvantagens que limitam seu uso. Por exemplo, o FACS pode fornecer isolamento microbiano de rotina no nível de célula única para análise genômica de seguimento^3, mas muitas vezes é limitado por sua disponibilidade e despesa, bem como problemas de contaminação a jusante¹¹. Abordagens microfluidas, como a citometria de fluxo microfluido, obtiveram muita atenção, o que, em comparação com a citometria de fluxo convencional, permite uma redução significativa no volume amostral necessário¹². No entanto, a separação e recuperação de uma coleção individual ou pequena de células de dispositivos microfluidos é muitas vezes um problema desafiador que normalmente requer uma configuração mais complexa e design de dispositivo¹³. Muitas abordagens baseadas em microfluido caracterizam geneticamente as células antes de serem inseridas e observadas em um dispositivo¹⁴, limitando o número de espécies únicas observadas ao realizar uma tela funcional. Diante dessas limitações, é necessária uma inovação adicional de métodos e materiais práticos para triagem celular e isolamento para uso generalizado em muitos laboratórios.

Este artigo apresenta uma nova abordagem baseada em materiais para rastreamento e isolamento de bactérias. O método utiliza hidrogéis fotodegradáveis para encapsulamento celular, cultura, observação microscópica e liberação e recuperação sob demanda de bactérias-alvo com fenótipos únicos. Hidrogéis são projetados para conter tamanho de malha de 10 nm, onde cada crosslink contém grupos o-nitrobenzyl¹⁵. O material encapsula ou prende células para observação, permitindo a difusão de nutrientes e resíduos de e para células para a cultura. Expor o material a uma fonte de luz UV padronizada de 365 nm através de um microscópio vertical permite a degradação local do hidrogel através de fotocleavage dos grupos o-nitrobenzyl^{16, 17}. A degradação desencadeia a liberação seletiva de células para recuperação para análise a jusante, incluindo análise genômica e, potencialmente, proteômica e transcriômica. A configuração experimental e o protocolo são relativamente simples, baratos e translacionais para laboratórios de microbiologia. Requer apenas encapsulamento celular através da formação de hidrogel, observação de células capturadas com um campo brilhante vertical e microscópio de fluorescência, e a iluminação de células de interesse com uma fonte de luz UV padronizada para recuperação.

Uma das principais vantagens dessa abordagem baseada em materiais para a triagem é sua adaptabilidade a diferentes formatos de triagem. Em seu formato mais básico, o material pode ser usado para triagem encapsulando uma coleção de células heterogêneas em hidrogéis a granel. As células são então observadas para o fenótipo desejado, e células individuais de interesse são removidas para caracterização genômica. Em formatos mais elaborados, o material também pode ser integrado em dispositivos de laboratório em um chip para fornecer liberação e recuperação precisa de células das áreas desejadas do dispositivo. Ambos os formatos são descritos aqui, e ambos habilitaram novas aplicações de triagem microbiana e seleção^17,18,19. O método é demonstrado aqui com organismos gram-negativos modelo(Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) e um modelo de organismo Gram-positivo(Bacillus subtilis) e foi prontamente estendido a uma variedade de outras bactérias.

Protocol

1. Cepas bacterianas e protocolos culturais

1. Colônias de bactérias em placas de ágar suplementadas com mídia de crescimento apropriada. Neste relatório, B. subtilis (cepa 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) é cultivado em ATGN (0,079 M KH₂PO₄, 0,015 M (NH₄)₂SO₄, 0,6 mM MgSO₄·7H₂O, 0,06 mM CaCl₂·2H₂O, 0,0071 mM MM MnS₂₄· H₂O, 0,125 M Feso_4· 7H₂O, 28 mM de glicose, pH: 7 ± 0,2, 15 g/L de ágar) placas de ágar suplementadas com 100 μg/mL de espectincina e E. coli (cepa 25922, ATCC) em placas de ágar ATGN complementadas com 100 μg/mL ampicillin.
   NOTA: Relatórios prévios de encapsulamento e liberação de hidrogel com esses materiais de Fattahi et al.¹⁹ em vez disso usaram células A. tumefaciens C58
2. Escolha colônias desejadas das placas de ágar atgn e comece culturas noturnas. Para cepas de E. coli e B. subtilis utilizadas aqui, cultura a 37 °C enquanto treme a 215 rpm em meio líquido ATGN por 24 h. Armazene as culturas celulares em 50% de glicerol a -80 °C até o uso futuro.
3. Escolha colônias de ambas as cepas de estoques de glicerol usando laços de inoculação estéril e incubar em mídia líquida ATGN por 24 h a 37 °C e 215 rpm.

2. Preparação do material necessário para a formação de hidrogel

1. Síntese fotodegradávelPEG-o-NB-diacrilato
   NOTA: A síntese interna do PEG- o-NB-diacrilato foi bem descrita e relatada anteriormente^16,17. Alternativamente, como a síntese é rotineira, ela pode ser terceirizada de uma instalação de síntese química.
2. Buffer de crosslinking
   1. Pegue a receita do meio selecionado para a cepa bacteriana e prepare a mídia com nutrientes 2x. Adicione fosfato, por exemplo, NaH₂PO_4, ao médio a uma concentração final de 100 mM. Em seguida, ajuste o valor do pH para 8 usando 5 M NaOH (aq).
   2. Esterilize a solução tampão e armazene-a a -20 °C até que use mais.
      NOTA: Deixe de fora quaisquer metais de transição presentes na mídia, pois esses metais catalisam a oxidação dos tiols aos dissulfetos.
3. Solução PEG- o-NB-diacrilato
   1. Para cada mg do pó dealíquota PEG-o-NB-diacrilato (3.400 Da peso molecular), adicione 3,08 μL de água ultrapura para atingir a concentração de 49 mM de PEG-o-NB-diacrilato (concentração de acrilato de 98 mM).
   2. Vortex a solução até que esteja bem misturada e armazene esta solução a -20 °C até que seja mais útil.
4. Solução PEG-thiol de 4 braços
   1. Para a preparação de PEG-thiol de 4 braços (10.000 da peso molecular), adicione 4 μL de água ultrauso por mg de pó para atingir uma concentração de 20 mM (80 mM de concentração de tiol).
   2. Vortex esta solução até que esteja bem misturada e armazene esta solução a -20 °C até que seja mais útil.

3. Preparação de deslizamentos perfluoroalquilados (não reativos)

1. Coloque até 5 lâminas de vidro (25 mm x 75 mm x 1 mm) dentro de um carteiro de slides de polipropileno. Sonicar os slides com uma solução de detergente de 2% (w/v)(Tabela de Materiais) por 20 min.
2. Enxágüe os slides três vezes com água ultrauso e, em seguida, sonicar os slides na água por 20 minutos. Seque os slides usando um fluxo de N₂.
3. Plasma limpo (ver Tabela de Materiais) em ambos os lados dos slides de vidro de acordo com o protocolo na seção 4.1 por 2 min.
4. Coloque os slides limpos de plasma de volta no carteiro de slides e encha o recipiente com uma solução de 0,5% (v/v) de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H,-perfluorooctil)silano no tolueno. Deixe que esses slides de vidro sejam funcionalizados por 3h a temperatura ambiente (RT).
5. Depois que os slides forem funcionalizados, enxágue os slides dentro do e-mail deslizante, primeiro com tolueno e próximo etanol (três vezes com cada solvente). Em seguida, seque cada lâmina funcionalizada com um fluxo de N₂.

4. Preparação de deslizamentos funcionais de thiol (base)

1. Limpeza das tampas de vidro usando um limpador de plasma
   1. Coloque tampas de 18 mm x 18 mm em uma placa de Petri. Em seguida, coloque a placa de Petri em uma câmara de limpador de plasma e ligue a potência do limpador de plasma.
   2. Ligue a bomba de vácuo para limpar o ar dentro da câmara até que o medidor de pressão leia 400 mTorr.
   3. Abra a válvula de medição para deixar o ar entrar na câmara até que o medidor de pressão atinja uma pressão constante (800-1000 mTorr). Em seguida, selecione RF com o modo "Oi" e exponha as tampas por 3 minutos.
   4. Depois de 3 minutos, desligue o modo RF e a bomba de vácuo.
   5. Tire a placa de Petri da câmara, vire as tampas e coloque-as de volta na câmara para o plasma expor o outro lado da tampa de vidro.
   6. Repita as etapas 4.1.2-4.1.4 para limpar o lado não tratado da tampa de vidro.
   7. Após completar o processo, remova a placa de Petri da câmara e desligue o limpador de plasma e a bomba de vácuo.
2. Limpeza e hidroxingação dos tampas com solução de piranha
   NOTA: Os protocolos padrão de limpeza de piranha podem ser usados para limpar e hidroxilatar deslizamentos de vidro. Piranha solução é uma mistura de 30:70 (v/v) de H₂O₂ e H₂SO₄. Métodos alternativos de limpeza de tampas de vidro também podem ser usados.
   ATENÇÃO: A solução piranha é fortemente corrosiva e explosiva com solventes orgânicos e deve ser tratada com extrema cautela. Devem ser implementadas medidas adequadas de segurança e contenção, como o uso de equipamentos de proteção individual adequados (jaleco, avental resistente a produtos químicos, óculos de segurança, escudo facial, luvas de butyl resistentes a ácido). Todos os vidros e superfícies de trabalho em contato com a solução piranha devem ser limpos, secos e livres de resíduos orgânicos antes do uso. A solução piranha nunca deve ser armazenada em um recipiente parcialmente fechado ou fechado.
   1. Coloque um prato de vidro limpo de 100 mm x 50 mm em um agitador magnético de placa quente com velocidade de agitação ajustável sob um capô de fumaça e adicione 14 mL de H₂SO₄ ao prato.
   2. Coloque delicadamente uma pequena barra de agitação magnética revestida de teflon usando fórceps revestidos de teflon dentro do prato. Em seguida, gire o agitador lentamente para evitar espirrar o ácido.
   3. Em seguida, adicione suavemente 6 mL de H₂O₂ ao prato e deixe a solução ficar bem misturada.
   4. Desligue o agitador e retire a barra de mexida do prato usando as fórceps. Em seguida, coloque suavemente as tampas dentro do prato usando as fórceps e afina a temperatura para 60-80 °C.
   5. Após 30 min, remova suavemente as tampas usando os fórceps e submerse-as em água deionizada (DI) duas vezes para lavar a solução residual de piranha.
   6. Depois de enxaguar com água, guarde as tampas em água DI no RT até que use mais.
   7. Desligue a placa quente e deixe esfriar a solução de piranha.
   8. Para descartar a solução de piranha, coloque delicadamente o prato de vidro de 100 mm x 50 mm contendo a solução de piranha resfriada em um copo de vidro maior e vazio que tem pelo menos 1,5 L de volume. Em seguida, adicione 1 L de água para diluir e adicionar pó de bicarbonato de sódio para neutralizar. Note que o bicarbonato de sódio causará borbulhante e geração de calor e deve ser adicionado muito lentamente, caso contrário, borbulhar pode levar ao espirro do ácido. Quando a adição adicional de bicarbonato de sódio não causar borbulhante, verifique o pH com papel pH para verificar se ele foi neutralizado. Uma vez que a solução é neutralizada e resfriada, ela pode ser derramada pela pia.
3. Funcionalidade thiol dos coverlips
   1. Prepare uma solução de 5% (v/v) de 269 mM de (3-mercaptopropil) solução de trimexisilano (MPTS) em tolueno seco.
   2. Adicione 10 mL da solução aos tubos de centrífugas cônicas individuais de 50 mL e coloque uma mancha de tampa limpa em cada tubo e submerse-a dentro da solução.
      NOTA: Um deslizamento por tubo de 50 mL é usado para garantir a tiaolação de ambos os lados do substrato sem ser perturbado por outros substratos.
   3. Depois de 4h, lave cada tampa (quatro lavagens por tampa) com tolueno, um etanol 1:1 (v/v): mistura de tolueno e etanol.
      NOTA: Isso é feito imergindo cada deslizamento de cobertura sequencialmente em tubos de centrífuga cônica contendo as soluções mencionadas.
   4. Depois de enxaguar o substrato, submergir-os no etanol e armazená-los a 4 °C até que use mais.
      NOTA: Dependendo do número de deslizamentos de cobertura, este método pode se tornar trabalhoso devido ao tratamento de tampas um de cada vez. Para várias tampas, frascos de Columbia que se encaixam em várias tampas ao mesmo tempo podem ser usados.

5. Fabricação de matrizes de microwell de silício

1. Revestimento de parileno: Use o protocolo padrão descrito nos artigos de pesquisa^{anteriores 20,21} para revestir wafers de silício com parileno.
2. Microfabricação: Siga o protocolo descrito por Barua et al.¹⁸ para projetar e fabricar a matriz de microwell(Figura Suplementar 1).
   NOTA: Técnicas fotolithográficas padrão descritas por Timm et al.¹⁷ foram aplicadas para fabricar matrizes de microwell em wafers de silício revestidos de parileno.

6. Formação de hidrogel

1. Formação de hidrogel a granel em tampas de vidro
   1. Solução precursora de hidrogel: Adicione 12,5 μL do buffer de ligação cruzada a um tubo de microcentrífa de 0,5 mL, seguido por 5,6 μL de solução PEG-o-NB-diacrilatlate. Por último, adicione 6,9 μL de solução PEG-thiol de 4 braços à mistura.
      NOTA: Adicionar o thiol PEG de 4 braços à mistura inicia a reação de crosslinking. Assim, a solução precursora do hidrogel deve ser usada imediatamente após a mistura.
   2. Para encapsulamento celular na solução precursora do hidrogel, siga os passos 6.1.3-6.1.9.
   3. Para encapsulamento celular, antes do passo 6.1.1, inocular o buffer de crosslinking com a densidade celular desejada. Como relatado anteriormente¹⁹, observou-se que a densidade celular de 7,26 × 10⁷ UFC/mL no buffer de ligação cruzada correlaciona-se a uma densidade de ~ 90 células/mm² encapsuladas através do hidrogel.
   4. Coloque a tampa da base alada em uma placa de Petri limpa. Coloque dois espaçadores (ver Tabela de Materiais) nos dois lados opostos da mancha de cobertura.
      NOTA: A funcionalidade thiol das tampas é necessária para a fixação covalente do hidrogel à superfície do deslizamento de tampas. Isso é feito através da reação de grupos de thiol na superfície e dos grupos de acrilato presentes na solução precursora do hidrogel.
   5. Fixar os espaçadores na tampa da base, gravando os espaçadores na placa de Petri.
   6. Pipeta o volume desejado da solução precursora em um slide de vidro não reativo e perfluoroalquilado.
   7. Coloque o deslizamento de vidro perfluoroalquilado na tampa da base(Figura 1C). Aguarde 25 min na RT para que a formação de hidrogel seja concluída.
   8. Após a gelação, remova suavemente o deslizamento de vidro perfluoroalquilado. O hidrogel permanecerá ligado à mancha de cobertura base.
      NOTA: Para tampas de 18 mm x 8 mm para obter uma membrana de 12,7 μm de espessura, use ~7 μL da solução precursora(Figura 1A, B). O uso de maiores volumes de solução precursora pode resultar em hidrogel sob a tampa da base. Isso pode fazer com que a tampa da base grude na placa de Petri e quebre uma tentativa de remoção. Além disso, o resíduo de hidrogel sob o deslizamento de cobertura é problemático para microscopia. A remoção suave do slide de vidro perfluoroalquilado não reativo é necessária, pois a remoção rápida pode danificar o hidrogel.
   9. Coloque o substrato em uma placa de Petri de 60 mm x 15 mm em mídia de cultura especificada. Aqui, a mídia ATGN complementada com 100 μg/mL especttinomicina para B. subtilis ou 100 μg/mL ampicillin para E.coli a 37 °C foi usada para 24 h de cultura.

Figura 1: Formação de hidrogel em tampas de vidro acoolados. (A) Espaçadores com espessura de 12,7 μm são colocados em dois lados opostos de um deslizamento de cobertura base contendo grupos de thiol reativos. (B) A solução precursora do hidrogel é esbotada sobre um escorregador de vidro fluorado não reativo. (C) A lâmina de vidro não reativa é colocada sobre os espaçadores para a formação de um hidrogel de 12,7 μm de espessura. (D) A lâmina de vidro não reativa é removida suavemente, deixando o hidrogel preso à tampa da base. (E) O hidrogel preparado pode ser incubado em mídia para a cultura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Formação de hidrogel sobre matrizes de microwell

1. Semeadura de bactérias em matrizes de microwell
   NOTA: 700 μL de 0,1 OD₆₀₀ suspensões celulares foram semeadas sobre os substratos da matriz de microwell, e o método de decolagem parileno foi aplicado para remover células do fundo usando o protocolo descrito por Timm et al. ²².
2. Prepare a solução precursora do hidrogel adicionando 5,6 μL do PEG-o-NB-diacrilate com 12,5 μL de pH 8 salina tamponada de fosfato ATGN e misturando com 6,9 μL da solução de thiol PEG de quatro braços.
3. Pipeta 12,5 μL da solução precursora em um slide de vidro não reativo e perfluoroalquilado e coloque dois espaçadores de aço de 38 μm (ver Tabela de Materiais) em dois lados opostos do substrato da matriz de microwell inoculado com células.
4. Inverta o deslizamento de vidro perfluoroalkylated com a gota de solução precursora e coloque a gota no meio do substrato de microwell. Em seguida, incubar por 25 min na RT para formação de hidrogel.
5. Remova suavemente o slide de vidro do substrato de microwell. A membrana hidrogel deve permanecer ligada ao substrato de microwell. Prossiga para a etapa 6.1.9.

8. Preparação do material para extração celular

1. Preparação do titular do PDMS
   1. Tape uma pilha de dez tampas de 18 x 18 mm juntas e cole esta pilha de tampas no fundo de uma placa de Petri.
   2. Para fabricar suportes PDMS, misture o precursor do PDMS e o agente de cura em uma proporção de 10:1 em uma xícara de plástico, desgase a mistura em um desiccador de vácuo e, em seguida, despeje a mistura na placa de Petri.
   3. Cura PDMS por 90 min a 80 °C. Em seguida, corte ao redor do bloco colado para remover o suporte PDMS e coloque o suporte PDMS em um slide de vidro para facilitar o manuseio para microscopia.
2. Preparação de microsinga e tubos
   1. Corte 20 cm de tubulação PTFE (0,05 em ID) e conecte uma extremidade da tubulação a uma seringa microliter de 100 μL.
      NOTA: Para extração, evite o uso de pipetas, pois desenhar as células liberadas através de uma ponta de pipeta pode danificar a superfície do hidrogel e levar à contaminação.

9. Degradação de hidrogel com a ferramenta de iluminação padronizada

NOTA: As seguintes etapas descritas nesta seção são idênticas tanto para hidrogéis a granel quanto para matrizes de microwell, exceto para os padrões de exposição à luz descritos nas etapas 9.6.4-9.6.6 e 9.6.7-9.6.10.

1. Ligue o microscópio (ver Tabela de Materiais). Em seguida, ligue a ferramenta de iluminação padronizada (ver Tabela de Materiais).
2. Ligue o módulo de controle Analógico e Digital de 365 nm de fonte de luz LED. Em seguida, ligue o módulo de controle de fonte de luz LED.
3. Abra o software do microscópio e o software para a ferramenta de iluminação padronizada. Quando a janela de configuração de hardware for aberta, selecione o botão Carregar.
   NOTA: Três dispositivos serão carregados aqui. (Câmera de terceiros, um módulo de controle e a ferramenta de iluminação padronizada)
4. Pressione o botão Iniciar. A janela do software de padronização de luz agora será aberta. Selecione a primeira opção, o botão Controle de dispositivo, na barra lateral esquerda da janela.
5. Calibrar a ferramenta de iluminação padronizada.
   NOTA: A calibração deve ser feita com o mesmo objetivo do microscópio e filtro que será usado para exposição à luz.
   1. Defina o objetivo do microscópio para a ampliação de 10x.
      NOTA: Esta ampliação permite distância de trabalho suficiente entre a lente do microscópio e a superfície da amostra. Também permite monitorar e registrar o processo de recuperação em tempo real através da janela da imagem.
   2. Coloque a lente do microscópio e o filtro nas configurações utilizadas para exposição à luz e coloque o espelho de calibração sob o microscópio.
   3. Na janela Controle do dispositivo, pressione a guia Controle de LED. Ligue o LED #1 e defina a intensidade da luz para o número desejado. Em experimentos de extração padrão, isso é definido para 60%.
   4. Pressione a guia intitulada com o nome do produto da ferramenta de iluminação padronizada na janela Controle do dispositivo. Em seguida, pressione o botão Mostrar grade.
      NOTA: Um padrão de grade será projetado no espelho de calibração.
   5. Ajuste o foco do microscópio e a exposição da câmera para obter alta qualidade de imagem da grade e gire a câmera para alinhar as linhas de grade paralelas ao quadro da janela da câmera, se necessário.
   6. Selecione o botão Assistente de Calibração sob a guia intitulada com o nome do produto da ferramenta de iluminação padronizada e siga as instruções fornecidas pelo software nesta janela.
      NOTA: Uma janela de configuração da câmera de terceiros será aberta.
   7. Uma janela de seleção de tipo de calibração será aberta. Selecione Calibração Automática e pressione o Próximo.
   8. Quando a janela de ajuste de pré-calibração for aberta, siga as instruções de software e pressione o botão Seguir.
   9. Quando a janela Informações de Mapeamento for aberta, salve esta calibração de acordo na pasta desejada. Isso é feito colocando a data, nome do microscópio, lente objetiva e filtro.
   10. Após a calibração, pressione o botão De definição da área de trabalho encontrado sob a guia intitulada com o nome do produto da ferramenta de iluminação padronizada para definir a área de trabalho da ferramenta de iluminação padronizada, se necessário.
6. Seção de projeto de sequência para preparação de padrões.
   1. Pressione o botão Sequence Design na barra lateral esquerda da janela de software. Em seguida, pressione o botão Editor de sequência de perfil.
   2. Quando a janela do Editor de sequência de perfil for aberta, selecione a opção Novo perfil na lista de perfil.
      NOTA: Agora, uma janela do Editor de Padrões será aberta.
   3. Prepare o padrão desejado para exposição à luz escolhendo diferentes formas e tamanhos de padrão, ou desenhe manualmente o padrão, se desejar.
   4. Para padrões cruzados de círculo e quebrados para o hidrogel a granel, siga os passos 9.6.5- 9.6.6
   5. Para padrões de círculo, defina um círculo com um diâmetro de 30 μm sobre uma colônia de bactérias alvo para cobrir toda a colônia. Escolha a cor de preenchimento de forma branca.
   6. Para padrões cruzados quebrados, escolha a forma de retângulo da janela de desenho padrão com dimensões de 3 μm x 8 μm. Coloque quatro retângulos com esta dimensão nas bordas da colônia alvo, enquanto metade dos padrões têm uma sobreposição com a colônia.
   7. Para padrões de círculos e anéis para as matrizes de microwell, siga os passos 9.6.8-9.6.10.
   8. Para padrões de círculo, desenhe um círculo de 10 μm de diâmetro ao redor do perímetro do poço. Escolha a cor de preenchimento de forma branca.
   9. Para o padrão do anel, desenhe um círculo de diâmetro de 20 μm, coloque-o sobre o poço e escolha a cor de preenchimento de forma branca.
   10. Desenhe outro padrão de círculo de diâmetro de 10 μm com a cor de forma de preenchimento preta e coloque-o ao redor do perímetro do poço.
7. Edite o padrão e modifique as formas com base no método de extração desejado. Certifique-se de que o padrão desejado existe dentro da área de trabalho da ferramenta de iluminação padronizada.
8. Coloque a amostra em um suporte PDMS e pipeta a mídia definida no topo da amostra para evitar a desidratação da amostra e forneça uma solução portadora para células liberadas.
9. Em seguida, substitua-o pelo espelho de calibração.
10. Ajuste o foco do microscópio para obter uma imagem nítida das colônias dentro do hidrogel. Inspecione as colônias para identificar uma colônia de interesses.
11. Aqui, projete os padrões de luz enquanto a visão da câmera mostra as colônias dentro da amostra para testar diferentes padrões para extração celular.
12. Salve o padrão definido. Depois de salvar o padrão definido, selecione a seção Controle de sessão.
13. Nesta seção, sob a guia intitulada com o nome do produto da ferramenta de iluminação padronizada, adicione a sequência salva.
14. Após adicionar a sequência, escolha a opção de simular o padrão para visualizar e ajustar para o local desejado de exposição.
    NOTA: A localização da amostra pode ser ajustada aqui para garantir que o padrão seja projetado precisamente na área alvo.
15. Em seguida, ajuste a intensidade da luz para 60% e o tempo de exposição a 40 s sob a guia de controle led e inicie o processo de exposição.
16. Monitore a degradação do hidrogel em tempo real e no modo brightfield para garantir a liberação da célula.
    NOTA: Evite qualquer movimento na amostra durante a exposição à luz, pois pode causar degradação de áreas indesejadas do hidrogel resultando em contaminação cruzada.

10. Recuperação celular

NOTA: O procedimento de recuperação celular é idêntico tanto para hidrogéis a granel quanto para matrizes de microwell.

1. Após exposição à luz de 365 nm e liberação celular, colete as células usando uma seringa microliter e tubos microfluídicos(Figura 2).
   NOTA: A recuperação celular precisa ser feita imediatamente após a exposição do padrão. Isso permite a recuperação de células localizadas antes que as células liberadas se afastem da área irradiada.
2. Altere o microscópio de brightfield para filtro FITC ou TRITC para permitir visualizar a área exposta da amostra a olho nu.
3. Uma vez localizada a área exposta, coloque a extremidade da tubulação sobre o local irradiado. Em seguida, mude o filtro de microscópio de volta para brightfield para monitorar a recuperação de células em tempo real.
4. Use a seringa presa na outra extremidade da tubulação para retirar cuidadosamente as células liberadas. Retire 200 μL da solução e insira a solução em um tubo de centrífuga de 1,5 mL para análise ou revestimento de DNA.

Figura 2: Representação esquemática do método de extração para coleta de células liberadas do hidrogel. Aqui, imediatamente após a exposição uv de 365 nm, a degradação do hidrogel e a liberação celular, o microscópio é usado para iluminar a amostra de hidrogel com luz de um filtro TRITC, resultando em uma mancha verde brilhante cobrindo a área onde ocorreu a liberação celular. Isso auxilia o usuário na identificação do local espacial para coleta de amostras. Após visualizar essa área, a tubulação de coleta anexada a uma seringa microlitera é colocada neste local e a amostra é coletada. A microscopia Brightfield a 10x de ampliação é usada para monitorar a extremidade da superfície de tubos e hidrogel em tempo real para coleta precisa de células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

11. Purificação genômica de DNA e medição da qualidade do DNA

1. Use o kit de purificação de DNA (ver Tabela de Materiais) para extrair DNA de isolados de bactérias.
   1. Siga a especificação do fabricante descrita no manual do kit de purificação de DNA²³ até a última etapa (etapa 7), exigindo eluição com Buffer AE.
   2. Para a etapa de elução, siga a especificação do fabricante, com a diferença de usar 100 μL de Buffer AE em vez de 200 μL.
   3. Repetir a eluição uma vez conforme descrito na etapa 11.1.2. Este passo leva ao aumento do rendimento geral do DNA.
2. Meça a qualidade do DNA usando um espectrofotômetro UV-Vis (ver Tabela de Materiais).
   1. Ligue o espectrômetro. Após a inicialização do dispositivo, na página inicial, selecione a opção dsDNA na tela.
   2. Em seguida, levante o braço do pedestal e limpe a posição do pedestal com água DI e lenços sem fiapos.
   3. Pipeta 2 μL de uma solução em branco, aqui tampão AE, na posição do pedestal e levemente trazer o braço de pedestal para baixo e selecionar Em branco na tela.
   4. Em seguida, levante o pedestal e limpe a posição do pedestal com água DI para remover qualquer material residual da medição anterior.
   5. Carregue a amostra (2 μL) na posição do pedestal, abaixe o braço do pedestal e selecione o botão Medir na tela.
   6. Redo passos 11.2.4 e 11.2.5 para todas as amostras.
   7. Uma vez feita a medição, selecione "Experiências finais" na tela. Insira a unidade flash no dispositivo e pressione "Exportar dados" na tela.

12. Determinando a viabilidade celular a partir de extratos de hidrogel e microwell

1. Diluir as suspensões bacterianas por um fator de diluição de^{10 5} usando uma placa de 96 poços.
2. Pipeta 10 μL da suspensão bacteriana diluída e mancha três vezes em placas ATGN para cada suspensão de bactérias.
3. Incline as placas para espalhar as células nas superfícies do ágar. Seque as placas ATGN contendo as suspensões bacterianas.
4. Incubar as placas a 37 °C por 48 h. Conte e regise os números das Unidades de Formação de Colônias (UFC). Conte as três propagações de suspensões bacterianas em cada placa.
   NOTA: Realize as etapas 12.1-12.4 em um gabinete de segurança biológica para evitar a contaminação da placa.

Results

Para investigar a capacidade da luz UV de desencadear a degradação controlada do hidrogel para liberação celular, os hidrogéis foram encapsulados primeiro sobre tampas thiolated sem a presença de bactérias. Cada hidrogel foi exposto a três padrões de círculo de réplica de luz em diferentes intensidades e tempos de exposição. A degradação percentual do gel foi calculada após a exposição à luz UV em cada intensidade de luz, e o tempo de exposição foi então quantificado por grupos de tiool pingente acoplado com um corante fluoresceína-5-maelimida para imagem de fluorescência^19,24. Um exemplo representativo de como esses dois parâmetros afetam a degradação do hidrogel é mostrado na Figura 3. Como evidente, a luz padronizada fornecida pela ferramenta de iluminação padronizada fornece controle espaço-temporal da degradação do hidrogel em uma resolução que pode permitir a liberação de apenas um pequeno número de células.

Figura 3: Controle sobre a degradação do hidrogel. A dose de luz UV e a taxa de degradação do hidrogel resultante são incapazes através da ferramenta de iluminação padronizada. (Inset) Duas intensidades de luz diferentes foram escolhidas para a degradação padronizada do hidrogel. Após exposição à luz UV de 365 nm, hidrogéis foram rotulados com fluoresceína-5-maleimida para imagem de fluorescência. Reimpresso (adaptado) com permissão da Fattahi et al.¹⁹ Copyright 2020 American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para extração celular, diferentes padrões de luz foram usados para investigar a liberação celular(Figura 4). Aqui, as células das bactérias Agrobacterium foram encapsuladas em hidrogéis a granel sobre tampas de vidro arrojadas, então cultivadas em colônias de microescala. Os hidrogéis foram então inspecionados em microscopia de campo brilhante, e microcolônias direcionadas foram expostas a padrões variados de luz UV. Observou-se que diferentes padrões de exposição influenciaram a morfologia das células liberadas. Isso é potencialmente benéfico para várias aplicações. Por exemplo, expor um padrão de anel ao redor da colônia alvo resulta na liberação de toda a colônia ainda encapsulada em um hidrogel PEG protetor e sem exposição direta à luz UV(Figura 4A),que pode preservar células e fornecer uma fácil purificação a jusante. Em contraste, expondo parte ou toda a colônia à luz UV, as células podem ser extraídas tanto como aglomerados celulares agregados (Figura 4B) ou como células individuais livres(Figura 4C).

Figura 4: Controle sobre a morfologia das células extraídas. (A) Uso de um padrão de anel para liberar toda a colônia celular, protegida em uma matriz PEG. (B) Uso de um padrão cruzado quebrado para liberação celular em agregados. (C) Uso de um padrão cruzado para liberar células individuais. Reimpresso (adaptado) com permissão de Fattahi et al.¹⁹ Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Crítico no protocolo de encapsulamento está tanto a densidade de semeadura celular quanto a espessura do hidrogel, pois ambos os parâmetros podem influenciar o número de células incorporadas no hidrogel para observação. Para demonstrar, as amostras de células de tumefaciens A. foram encapsuladas em hidrogéis de duas espessuras diferentes usando espaçadores finos (12,7 μm) ou espaçadores de espessura (40 μm) cultivados, e imagens seguindo os protocolos estabelecidos. Hidrogéis mais finos resultaram em uma densidade de microcollonia de 90 colônias/mm² em todo o hidrogel, onde foi observada sobreposição mínima de colônias(Figura 5A). Em contraste, espessuras de hidrogel superiores a 12,7 μm resultaram na formação de colônias sobrepostas na direção vertical (Figura 5B), o que pode resultar na extração de múltiplas colônias. Colônias sobrepostas podem causar contaminação cruzada durante a extração devido à natureza bidimensional do padrão de luz. Por exemplo, uma colônia superior pode ser alvo, enquanto uma colônia subjacente também é extraída com ela(Figura 5C). Portanto, recomenda-se o uso de espaçadores de 12,7 μm para a preparação de hidrogel.

Figura 5: A espessura do hidrogel afeta a pureza da extração. (A) Utilizando espaçadores com uma espessura de 12,7 μm para formação de hidrogel, as colônias são formadas dentro de um plano focal de 10x. (B) A sobreposição de colônias pode ser observada a 10x de ampliação se forem utilizados espaçadores com espessuras maiores que 12,7 μm. (C) A contaminação cruzada pode ocorrer com uma sobreposição de colônias durante a liberação celular: (i) um padrão de anel é usado para liberar uma colônia celular alvo, (ii) a colônia celular alvo se desprende do hidrogel, e (iii) uma segunda colônia subjacente é observada durante a exposição à luz sob a colônia alvo. Esta colônia também é removida, resultando em contaminação cruzada. Reimpresso (adaptado) com permissão da Fattahi et al.¹⁹ Copyright 2020 American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Dado o dano potencial a bactérias com luz UV, o efeito de variados micropatterns de luz UV na viabilidade celular foi ainda estudado utilizando modelo, bactérias Gram-positivas(B. subtilis) e modelo, bactérias Gram-negativas(E. coli). Cada um foi encapsulado dentro de hidrogéis a granel e cultivado em colônias de microescala de acordo com os protocolos padrão, verificando sua compatibilidade com o hidrogel. Microcolônias-alvo de tamanhos equivalentes (26 ± 1 μm de diâmetro) foram então expostas a uma dose de luz constante (168 mJ/mm²), seja na forma de padrões de círculo expondo microcolônias inteiras à luz UV ou padrões cruzados que degradam apenas bordas de hidrogel para minimizar a exposição da luz às células. As células foram então recuperadas e banhadas para quantificar a UFC/mL recuperada de cada colônia. Não foi encontrada diferença significativa no nível de recuperação celular(Figura 6A). Para investigar melhor a pureza das células extraídas, o DNA foi extraído de amostras de E. coli e analisado utilizando um espectotómetro UV-Vis. Para ambos os padrões, os níveis de qualidade do DNA estão dentro de uma faixa A₂₆₀/A₂₈₀ entre 1,8 e 2.0(Figura 6B),que está na faixa ideal para sequenciamento genômico²⁵. Isso demonstra que os padrões UV utilizados para liberação sob as condições descritas têm efeito mínimo sobre a quantidade de células viáveis recuperadas dos hidrogéis a granel ou da qualidade genômica do DNA após a extração.

Figura 6: Impacto de diferentes padrões de exposição à luz na viabilidade celular e qualidade do DNA de bactérias liberadas a partir de hidrogéis a granel. (A) Níveis de recuperação celular para e. coli e B. subtilis após a extração usando padrões cruzados e padrões de círculo. Para este experimento, a extração foi feita a partir de colônias esféricas com o mesmo diâmetro (26 μm ± 1 μm) para garantir que o número de células liberadas de cada colônia fosse equivalente. As soluções extraídas foram então emplacardas para calcular a UFC/mL adquirida a partir de cada padrão. A análise estatística não mostrou diferença significativa na UFC/mL obtida a partir de padrões cruzados e circulares tanto para E. coli quanto B. subtilis (valor P > 0,05, n= 6 para ambas as cepas). (B) Quantificação espectrofotométrica da qualidade do DNA para células isoladas de E. coli utilizando padrões cruzados e circulares. Aqui, a análise estatística não mostrou diferença significativa na qualidade do DNA para os padrões utilizados (valor P > 0,05, n = 6) ( C ) Imagens decampobrilhante de colônias com diâmetros iguais expostos a padrões cruzados e circulares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os arrays Microwell fornecem uma interface alternativa de triagem de laboratório em um chip que oferece recursos de triagem mais controlados em comparação com hidrogéis a granel. Por exemplo, as matrizes de microwell permitem a semeadura de bactérias em locais de cultura discretos onde o número de células no inóculo pode ser controlado. Características geométricas de microwells, como profundidade e diâmetro, também são controladas através de métodos padrão de microfabricação. Com esses benefícios, os microwells têm sido úteis para estudar o crescimento de bactérias sob confinamento espacial²⁶, e mais recentemente para a descoberta de interações simbióticas e antagônicas entre diferentes espécies bacterianas quando confinadas na microescala¹⁸. A extração celular de poços para análise genômica, como o sequenciamento de amplicon 16S, é fundamental para essas aplicações. Usando o mesmo material de hidrogel, a luz UV pode ser exposta sobre um poço contendo células de interesse, seja como padrões de círculo ou anel. Este último garante a degradação do hidrogel apenas no perímetro de microwell para evitar a irradiação direta das células. Para demonstrar isso, as células de tumefaciens que expressavam mCherry foram semeadas em poços, o hidrogel foi então anexado à matriz de microwell. As células eram cultivadas e irradiadas com padrões de círculo ou anel. A membrana foi então manchada com corante fluoresceíno-5-maleimida. Imagens de fluorescência de duas cores revelaram que tanto a membrana quanto as células dentro dos poços são removidas para ambos os padrões de irradiação¹⁷. Ao contrário do formato de hidrogel a granel, a extração celular aqui só foi observada na forma de aglomerados celulares¹⁸.

Figura 7: Imagens representativas de microscopia confocal que mostram impacto do padrão de luz no isolamento celular a partir de matrizes de microwell. (A) Microwells com diâmetros de 40 μm contendo bactérias (vermelhas) após semeadura e cultura. (B) Exposição à luz usando padrões de círculo e anel (azul). (C) A diminuição da fluorescência vermelha demonstra que as células são extraídas de poços irradiados. (D) Imagem de fluorescência de duas cores de membranas e bactérias após a irradiação, indicando a remoção tanto do hidrogel (verde) quanto das bactérias (vermelhas) dos poços alvo. (E) Z-stack, imagem de fluorescência de duas cores de poços alvo. A linha vermelha em (D) denota o plano xz imaged in (E), e a linha verde em (E) denota o plano xy imagem em(D). Amostras em imagens (C-E) foram lavadas para remoção de células liberadas, depois fixadas e imagens. Barra de escala = 40 μm. Reimpresso (adaptado) com permissão de van der Vlies et al.¹⁷. Copyright 2019 American Chemical Soceity. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para quantificar a viabilidade celular das bactérias e a qualidade do DNA após a extração neste formato, as células B. subtilis e E. coli foram semeadas, cultivadas e, em seguida, liberadas de matrizes de microwell usando padrões de círculo e anel(Figura 8A,B). As células liberadas foram então banhadas em placas de ágar ATGN, e a qualidade do DNA das células extraídas foi quantificada. Para garantir que um número consistente de células estivesse presente durante cada extração, microwells com intensidades fluorescentes semelhantes (~6000 a.U.) e, portanto, um número semelhante de células foram alvo de liberação. O número de células viáveis extraídas usando um padrão de círculo não foi significativamente diferente do número de células viáveis extraídas utilizando padrão de anel para qualquer bactéria(Figura 8C). Além disso, os níveis de qualidade do DNA não foram significativamente diferentes entre os padrões do círculo e do anel para qualquer bactéria(Figura 8D). Assim, semelhante aos achados em hidrogéis a granel, a aplicação da luz UV na intensidade e duração especificadas aqui teve um impacto insignificante na viabilidade e qualidade do DNA das células extraídas das matrizes de microwell. Esses achados demonstram que as células de bactérias viáveis podem ser seletivamente recuperadas de microwells com danos mínimos para análise a jusante.

Figura 8: Impacto de diferentes padrões de exposição à luz na viabilidade celular e qualidade do DNA de bactérias liberadas de matrizes de microwell. (A,B) Tanto para e. coli quanto para B. subtilis,padrões de círculo e padrões de anéis foram usados para extração celular de microwells de 10 μm. Padrão de círculo com diâmetro de 10 μm e padrão do anel com diâmetro interno de 10 μm e diâmetro externo de 20 μm foram utilizados neste experimento para extração celular. Microwells com os mesmos diâmetros foram usados para garantir que o número de células liberadas de cada microwell fosse o mesmo. (C) As soluções extraídas foram então emplacar-se para calcular a UFC/mL adquirida a partir de cada padrão de exposição. A análise estatística não mostrou diferença significativa na UFC/mL obtida a partir do padrão de círculo e anel tanto para E. coli quanto B. subtilis (valor P > 0,05, n = 6 para ambas as cepas). (D) A espectrofotometria foi usada para medir a qualidade do DNA das células E. coli e B. subtilis usando padrões de círculo e anel. Aqui, a análise estatística não mostrou diferença significativa na qualidade do DNA para os padrões utilizados (valor P > 0,05, n = 6 para ambas as cepas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Design e fabricação de matrizes de microwell. (A) Técnicas padrão de microfabricação foram aplicadas para fabricar matrizes de microwell em wafers de silício. (B) Cada substrato consistiu em 7 x 7 matrizes de poços de diâmetro de 10μm com profundidade de 20 μm e 30 μm de arremesso. (C) Cada matriz consistia de 225 microwells. Este valor foi modificado a partir de Barua et al.¹⁸. Copyright 2021 Frontiers Media. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Discussion

Este manuscrito demonstra o uso de hidrogéis fotodegradáveis para triagem e isolamento de bactérias. O material e a abordagem permitem a cultura de alto rendimento, o controle sobre as mídias de crescimento e as condições de crescimento e a extração celular limpa e precisa de forma simples e econômica. A extração requer apenas um microscópio fluorescente juntamente com a ferramenta de iluminação padronizada e pode ser feita de forma sequencial para isolar vários alvos celulares. Cada extração leva de 5 a 10 minutos para ser realizada, e até 30 colônias alvo foram removidas de um único hidrogel. Uma das principais vantagens da abordagem é sua adaptabilidade a uma variedade de diferentes formatos de ensaio, como demonstrado aqui com a triagem de hidrogéis a granel e matrizes de microwell. O processo de separação em ambos os formatos tem sido usado com sucesso para isolar bactérias que exibem comportamento de crescimento único para genotipo a jusante após cultura e observação microscópica, uma capacidade crítica para conectar genótipo celular ao fenótipo. Até o momento, caracterizações genômicas de bactérias extraídas dessas interfaces incluíram sequenciamento de amplicon 16S para identificar coleções de várias espécies de bactérias de microbiomas ambientais que geram comportamento de crescimento emergente¹⁸, e para o sequenciamento de genoma inteiro para identificar com sucesso mutações genéticas que causam perfis raros de crescimento em células presentes dentro das bibliotecas mutantes¹⁹.

O uso de hidrogéis a granel para triagem e isolamento celular é o formato mais simples e simples. Hidrogéis fotodegradáveis em massa formam-se rapidamente (25 min) depois de misturar os precursores sobre tampas de vidro transparentes para encapsular células em uma matriz de cultura celular 3D que é imageda com um microscópio de fluorescência vertical ou invertido padrão. Assim, o método tem potencial para ser translacional para laboratórios comuns de microbiologia que não possuem recursos de microfabização ou expertise. Uma desvantagem para este formato é que as células são orientadas aleatoriamente ao longo do hidrogel tridimensional. Portanto, as células podem aparecer fora do plano focal quando imagens com objetivos de ampliação mais elevados e extração podem ser difíceis se colônias de células forem orientadas muito perto umas das outras ou se houver uma sobreposição vertical de colônias. Depositar um hidrogel fino (<13 μm) como descrito é fundamental para mitigar essa desvantagem. A exposição em padrões de luz cruzada quebradas(Figura 4B) é preferível aqui, pois este padrão resulta em células livres do hidrogel que têm exposição mínima à luz UV e podem ser prontamente recuperadas através de revestimento.

Em contraste, o formato de matriz de microwell fornece uma interface mais bem controlada, uma vez que as células bacterianas são particionadas em microwells discretas que servem como pequenos locais de cultura ou co-culturas^17,18,26. Dimensão, tom e densidade de microwell são precisamente fabricados usando técnicas fotolithográficas padrão. Em comparação com hidrogéis a granel, as bactérias podem ser extraídas de matrizes de microwell com maior grau de especificidade e menor chance de contaminação cruzada, já que as células só estão presentes em locais predefinidos, não dispersas aleatoriamente por todo o hidrogel. A concentração e as proporções de células bacterianas na solução de semeadura também podem ser variadas para controlar a quantidade e a composição do inóculo de microwell através de um processo de semeadura que tem sido caracterizado em relatórios anteriores²⁶, dando ao usuário flexibilidade no desenho experimental da tela. A principal desvantagem da triagem com o formato de matriz de microwell é o tempo adicional e a experiência necessária para a microfabricção. A fabricação de microwells foi estimada em ~$10 por matriz, o que inclui custos materiais e despesas de limpeza. Além disso, as matrizes de microwells são tradicionalmente feitas de silício, o que pode causar dificuldades de imagem, uma vez que os substratos não são transparentes. Além disso, uma alta quantidade de luz espalhada da superfície de silício pode limitar a imagem dentro dos microwells e pode diminuir a resolução de padrões durante a exposição de hidrogel com luz UV da ferramenta de iluminação padronizada (vista na Figura 8A,B). Micro-poços semelhantes foram fabricados em substratos transparentes de quartzo para atender a esses tipos de limitações²⁷; no entanto, essa fabricação é consideravelmente mais difícil. A exposição a padrões de anéis que iluminam o perímetro do poço é preferível aqui para liberar células livres dos poços, minimizando a exposição uv.

O problema mais comum que ocorre em ambos os formatos é o desprendimento do hidrogel do substrato subjacente durante a cultura devido ao inchaço do hidrogel. Se este for um problema para hidrogéis a granel, a presença, densidade e uniformidade de grupos de thiol na camada química (MTPS) de fixação através da superfície da tampa de vidro base deve ser verificada usando uma técnica de caracterização de superfície apropriada (XPS, ATR-FTIR, AFM, etc.). Baixas densidades de grupos de thiol de superfície devido à funcionalidade superficial ineficiente podem levar a uma interação fraca entre o substrato e o hidrogel. Se ocorrer um baixo nível de tiaolação superficial, a estabilidade da solução MTPS deve ser verificada. Deve-se tomar cuidado na limpeza inicial do escorregador de vidro para garantir uma superfície limpa antes do tratamento do MTPS, e deve-se tomar cuidado para garantir o uso de tolueno anidro durante a reação superficial do MTPS (Seção de Protocolo 4). No caso de matrizes de microwell, as superfícies não são tialadas, e os hidrogéis, em vez disso, anexam através do enchimento parcial dos poços com o hidrogel, que ancora o hidrogel ao substrato^{de silício 17}. Se o desprendimento de hidrogel for um problema neste sistema, mais microestações ou outras características de microescala podem ser gravadas na matriz para ancorar ainda mais o hidrogel ao substrato para promover um apego mais forte.

Uma limitação da técnica em ambos os formatos é a estabilidade limitada dos hidrogéis na presença de bactérias. Nota-se que algumas bactérias, como a A. tumefaciens,podem degradar o hidrogel ao longo de 5-7 dias^17,19, o que limita o tempo de experimento. A investigação atual dos mecanismos de degradação bacteriana está em andamento; É hipótese de que os grupos éster presentes nos monômeros diacrilatados estejam sujeitos à hidrólise mediada por bactérias e/ou degradação enzimática, como observado em outros sistemas¹⁷. O desenvolvimento de químicas mais estáveis de hidrogel estenderá o tempo que as bactérias podem permanecer no hidrogel e estenderá a tela a microrganismos com taxas de crescimento mais lentas. Uma segunda limitação é que, em ambos os formatos, a recuperação e extração celular ocorrem em ambiente aberto, resultando em volumes de extração relativamente altos (30-100 μL), que podem ser suscetíveis à contaminação externa. Assim, deve-se ter cuidado para garantir que células suficientes estejam presentes das colônias-alvo, minimizando o volume da solução de extração. Para obter células suficientes para chapeamento e recuperação ou para extração de material de DNA, observou-se que em hidrogéis a granel, as células devem ser cultivadas tempo suficiente para atingir diâmetros de colônias de pelo menos 10 μm. Para diminuir o volume necessário para extração celular, observou-se que o uso de uma seringa e tubos microliter (Figura 2) foi mais eficiente do que a pipetação. A tubulação permitiu que os isolados fossem retirados do ponto de liberação com mais precisão, exigindo menos volume da solução e diminuindo a chance de contaminação.

Trabalhos futuros envolvem compreender o efeito das propriedades mecânicas de hidrogel no crescimento celular, uma vez que as características mecânicas desses hidrogéis são bem controladas pela seleção de precursores monômeros baseados em PEG apropriados de vários pesos moleculares²⁸, e as interações mecânicas provavelmente desempenham um papel importante no comportamento das bactérias²⁹. Como os materiais de hidrogel podem ser facilmente incorporados em uma variedade de diferentes sistemas e dispositivos, o desenvolvimento adicional também é focado na integração deste material em sistemas microfluidos. Isso reduziria a solução de extração para femtoliter para volumes picoliter, em comparação com os volumes tradicionais de 30-100 μL atualmente exigidos no formato de coleta aberta. Volumes menores de soluções reduziriam consideravelmente a contaminação potencial e moveriam a abordagem para o isolamento e a caracterização de células únicas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Mercaptopropil) trietoxissilano	Sigma-Aldrich	175617-25G	> 95%
Alconox detergente em pó	Alconox	1104
Sulfato de amônio	Fisher Chemical	A702-500	Autoclave granular certificada ACS
SK300C	Yamato Scientific	18016
Bacillus subtilis 1A1135	Bacillus Genetic Stock Center	1A1135
Microscópio vertical de campo claro	Olympus Corporation	BX51
Cloreto de cálcio, anidro	Fisher Chemical	C614-500	para pellets de dessecadores, centrífuga de malha 4-20
5702	Eppendorf	5702
Ácido cítrico monohidratado	Sigma-Aldrich	C1909-500G	ACS reagente, > 99,0%
D-glicose ( Dextrose)	VWR Amresco Life Science	0188-1KG
Dneasy Blood & Kit de Tecidos	Qiagen	69504	Kit de purificação de DNA
DOWSIL 184 base de elastômero de silicone	Dow Silicones Corporation		Temperatura de armazenamento: -30-60 ° C
DOWSIL 184 agente de cura de elastômero de silicone	Dow Silicones Corporation		Temperatura de armazenamento: < 32 C
Espectrofotômetro de microplacas EPOCH2	BioTek Instruments	EPOCH2
Escherichia coli ATCC 25922	Thermo Fisher Scientific	R19020
Etanol, anidro	Fisher Chemical	459844
Fisherbrand vidro de cobertura de microscópio	Fisher Scientific	12540A
Lâminas de microscópio premium Fisherfinest simples	Fisher Scientific	12-544-4
Solução de peróxido de hidrogênio	Sigma-Aldrich	216763-500ML	Contém inibidor, 30% em peso em H2O
Incu-Shaker Mini	Benchmark	E5-0014-01
Isopropanol	Sigma-Aldrich	190764
Sulfato de magnésio, 7 hidratos	Macron Fine Chemicals	6066-04	Avantor Performance Materials, Inc.
Metanol	Sigma-Aldrich	179337-4L	ACS reagente, > 99,8%
NanoDrop Um espectrofotômetro	Thermo Scientific	ND-ONEC-W
Nitrogênio, comprimido	Matheson	UN1066
Limpador de plasma de oxigênio	Harrick Plasma	PDC-001-HP
Pentaeritritol tetra (mercaptoetil) polioxietileno (4 braço-PEG)	América NOF Corporation	PTE-100SH	Sunbright-PTE-100SH
Solução salina tamponada com fosfato (PBS), 10X	VWR Amresco Life Science	K813-500ML	Armazene entre 15 ° C– 30 &graus; C
Polidimetilsiloxano (PDMS) Slygard 184	Dow Corning	4019862
Polygon400	Mightex	DSI-D-000
Lâminas de microscópio premium	Fisher Scientific	12-544-4	25 x 75 x 1 mm
Bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich	S5761-500G
Cloreto de sódio	Sigma Life Science	S5886-500G	Biorreagente, adequado para cultura de células
Hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich	S8045-500G	BioXtra, > 98%, pellets (anidro)
Fosfato de sódio monobásico di-hidratado	Sigma-Aldrich	71505-250G	BioUltra, para biologia molecular, > 99,0% (T)
Medidor de espessura de aço inoxidável	Produtos da marca de precisão	77739
Ácido sulfúrico	Sigma-Aldrich	320501-2.5L
Tolueno, anidro, 99,8%	Sigma-Aldrich	244511-1L	anidro, > 99,8%
Tricloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctil) silano (TPS), 97%	Sigma-Aldrich	448931-10G
Caldo de soja tríptico	Sigma-Aldrich	22092-500G	Para microbiologia
Super Nuova Agitador de placa quente digital	Thermo Scientific	S131825
Sonicador ultrassônico	Fischer Scientific	FS-110H