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Métodos de cultura direta e indireta para estudar materiais de implante biodegradáveis in vitro

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DOI:

10.3791/63065

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15 de abril de 2022

 ,  ,  , 
1Materials Science and Engineering Program, University of California, Riverside, 2Department of Bioengineering, University of California, Riverside, 3Stem Cell Center, University of California, Riverside

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Introduzimos três métodos de cultura direta, cultura de exposição direta e cultura de exposição para avaliar a citocompatibilidade in vitro de materiais de implante biodegradável. Esses métodos in vitro imitam diferentes interações in vivo de implante celular e podem ser aplicados para estudar vários materiais biodegradáveis.

Resumo

Ao longo das últimas décadas, materiais biodegradáveis têm sido amplamente explorados para aplicações biomédicas, como implantes ortopédicos, odontológicos e craniomaxilofaciais. Para testar materiais biodegradáveis para aplicações biomédicas, é necessário avaliar esses materiais em termos de respostas in vitro de células, citocompatibilidade e citotoxicidade. As normas da Organização Internacional para a Padronização (ISO) têm sido amplamente utilizadas na avaliação de biomateriais. No entanto, a maioria das normas ISO foram originalmente estabelecidas para avaliar a citotoxicidade de materiais não degradáveis, fornecendo assim valor limitado para a triagem de materiais biodegradáveis.

Este artigo introduz e discute três diferentes métodos de cultura, a ver, método de cultura direta, método de cultura de exposição direta e método de cultura de exposição para avaliar a citocompatibilidade in vitro de materiais de implante biodegradáveis, incluindo polímeros biodegradáveis, cerâmicas, metais e seus compósitos, com diferentes tipos de células. Pesquisas têm mostrado que os métodos culturais influenciam as respostas celulares a materiais biodegradáveis porque sua degradação dinâmica induz diferenças espesso-100 na interface e no ambiente local. Especificamente, o método de cultura direta revela as respostas das células semeadas diretamente nos implantes; o método de cultura de exposição direta elucida as respostas das células hospedeiras estabelecidas que entram em contato com os implantes; e o método de cultura de exposição avalia as células hospedeiras estabelecidas que não estão em contato direto com os implantes, mas são influenciadas pelas mudanças no ambiente local devido à degradação do implante.

Este artigo fornece exemplos desses três métodos culturais para estudar a citocompatibilidade in vitro de materiais de implante biodegradável e suas interações com células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea (BMSCs). Também descreve como colher, passagem, cultura, sementes, fixar, manchar, caracterizar as células e analisar mídias e materiais pós-cultura. Os métodos in vitro descritos neste artigo imitam diferentes cenários do ambiente in vivo , ampliando a aplicabilidade e relevância do teste de citocompatibilidade in vitro de diferentes biomaterias para diversas aplicações biomédicas.

Introdução

Durante décadas, materiais biodegradáveis têm sido extensivamente estudados e utilizados em aplicações biomédicas como aplicações ortopédicas 1,2, odontológico3,4 e craniomaxilofacial5. Ao contrário de implantes e materiais permanentes, metais biodegradáveis, cerâmicas, polímeros e seus compósitos gradualmente se degradam no corpo ao longo do tempo através de diferentes reações químicas no ambiente fisiológico. Por exemplo, metais biodegradáveis como ligas de magnésio (Mg)1,6,7 e ligas de zinco (Zn)8,9 são materiais promissores para dispositivos de fixação óssea. Sua biodegradabilidade poderia eliminar a necessidade de cirurgias secundárias para remover os implantes após a cicatrização óssea. Cerâmicas biodegradáveis, como cimentos fosfato de cálcio (CPCs) têm mostrado potencial empolgante para o tratamento de fraturas de compressão vertebral osteoporótica em kyphoplastia percutânea10. Os CPCs fornecem suporte mecânico para o corpo vertebral fraturado e gradualmente se degradam após a cicatrização da fratura.

Polímeros biodegradáveis, como alguns polissacarídeos e poliésteres, também têm sido amplamente explorados para aplicações biomédicas. Por exemplo, o hidrogel chitosano como um polissacarídeo biodegradável tem exibido suas capacidades para prevenir infecções e regenerar tecidos da pele11. O ácido poli-L-láctico (PLLA), o ácido poli(glicólico) (PGA) e o poli(ácido clicótico-coglicólico) (PLGA) são poliésteres amplamente estudados para a fabricação de andaimes porosos 2D ou 3D para aplicações de engenharia de tecidos12,13,14. Além disso, os materiais compostos integram duas ou mais fases de metais, cerâmicas e polímeros para fornecer funções avançadas para uma ampla gama de aplicações biomédicas15,16,17. Por exemplo, compósitos PLGA e fosfato de cálcio podem ser usados para fabricar andaimes biodegradáveis para aplicações como reparar defeitos ósseos do crânio18. Esses andaimes e implantes biodegradáveis poderiam apoiar e promover o crescimento de células e tecidos e, em seguida, gradualmente degradar-se no corpo ao longo do tempo.

Como mostrado na Tabela Suplementar 1, diferentes materiais biodegradáveis podem ter mecanismos, produtos e taxas variadas de degradação. Por exemplo, ligas de magnésio, como Mg-2 wt % Zn-0,5 wt % Ca (ZC21)1, Mg-4 wt% Zn-1 wt% Sr (ZSr41)19, e Mg-9 wt% Al-1 wt% Zinco (AZ91)20, degradam-se reagindo com água, e seus produtos de degradação incluem principalmente íons Mg2+, íons OH, gás H2 e deposições minerais. A taxa de degradação dos metais biodegradáveis varia dependendo de suas diferentes composições, geometrias e ambientes de degradação. Por exemplo, Cipriano et al.19 relataram que os fios ZSr41 (Ø1,1 × 15 mm) perderam 85% de massa, enquanto os fios mg puros com a mesma geometria perderam 40% de massa após serem implantados na tíbia de rato por 47 dias. Materiais cerâmicos biodegradáveis, como hidroxiapatita (HA) e fosfato de tricálgio β (β-TCP) podem se degradar através da dissolução líquida extracelular orientada por soluções ou se dividir em pequenas partículas e, em seguida, degradar-se através de processos de dissolução líquida extracelular e de ressorção mediada por células. Os produtos de degradação dessas cerâmicas à base de fosfato de cálcio podem incluir íons Ca2+, (PO4)3- íons, íons OH e deposições minerais21. A taxa de degradação da cerâmica fosfato de cálcio é significativamente afetada por suas estruturas cristalinas. Por exemplo, Van Blitterswijk et al.22 relataram que a HA com 40 vol.% de microporos não perdeu massa, enquanto β-TCP com 40 vol.% de microporos perdeu 30± 4% de massa após ser implantado na tíbia de coelhos por 3 meses. Polímeros como PLGA14,23 podem se degradar devido à hidrólise das ligações ester na presença de água, e os produtos de degradação incluem principalmente ácidos lácticos e glicólicos. Pode levar um mês para que o PLGA 50/50 e vários meses para o PLGA 95/5 para alcançar a degradação completa24.

Os testes de resposta celular e citocompatibilidade são fundamentais para avaliar e testar esses materiais de implante biodegradável para aplicações biomédicas. No entanto, os padrões atuais da Organização Internacional para a Padronização (ISO), como a ISO 10993-5:2009 "Avaliação biológica de dispositivos médicos-Parte 5 Testes para citoxicidade in vitro", foram inicialmente projetados para avaliar a citotoxicidade de biomaterias não degradáveis, como as alusões Ti e as teoys Cr-Co in vitro25. Especificamente, a ISO 10993-5:2009 abrange apenas os testes in vitro de citotoxicidade do extrato, contato direto e testes de contato indireto. No teste do extrato, o extrato é preparado por meio de amostras imersas em fluidos de extração, como meios de cultura com soluções de soro e soro fisiológico salino sob uma das condições padrão de tempo e temperatura. O extrato ou diluição coletados é então adicionado à cultura celular para estudar a citotoxicidade. Para o teste de contato direto, o contato direto entre a amostra e as células é obtido colocando a amostra de teste na camada celular estabelecida (aderida). No teste de contato indireto, a mídia cultural contendo soro e ágar derretido é pipeta para cobrir as células estabelecidas. A amostra é então colocada na camada de ágar solidificada com ou sem filtro.

As normas ISO mostraram algumas limitações quando aplicadas para avaliar materiais biodegradáveis in vitro. Ao contrário dos materiais não degradáveis, os comportamentos de degradação de materiais biodegradáveis são dinâmicos e podem mudar em um momento diferente ou em condições ambientais variadas (por exemplo, temperatura, umidade, composição da mídia e tipo celular). O teste extrato avalia apenas a citotoxicidade dos produtos de degradação do material e não reflete o processo dinâmico de degradação amostral. Tanto os testes de contato diretos quanto indiretos do padrão ISO caracterizam apenas as interações entre as células estabelecidas e as amostras. Além disso, no teste de contato indireto, os materiais e células estão em diferentes microambientes que não refletem o ambiente in vivo e não captam a degradação dinâmica de materiais biodegradáveis.

O objetivo deste artigo é introduzir e discutir os métodos de teste de citocompatibilidade para diversos materiais de implante biodegradáveis para abordar as limitações acima mencionadas dos métodos descritos nas normas ISO vigentes. Os métodos apresentados neste artigo consideram o comportamento dinâmico de degradação dos materiais de implante e as diferentes circunstâncias das interações celular-material in vivo. Especificamente, este artigo fornece três métodos de teste de citocompatibilidade, ou seja, cultura direta, cultura de exposição direta e cultura de exposição para vários materiais biodegradáveis, incluindo polímeros biodegradáveis, cerâmicas, metais e seus compósitos para aplicações de implantemédicos.

No método de cultura direta, as células suspensas nos meios culturais são diretamente semeadas nas amostras, avaliando assim as interações entre células recém-semeadas e os implantes. Na cultura de exposição direta, as amostras são colocadas diretamente na camada celular estabelecida para imitar as interações de implantes com células hospedeiras estabelecidas no corpo. Na cultura de exposição, as amostras são colocadas em suas respectivas pastilhas de poço e, em seguida, introduzidas nos poços de cultura com células estabelecidas, o que caracteriza as respostas das células estabelecidas às mudanças no ambiente local induzidas pela degradação do implante quando não têm contato direto com implantes. Os métodos de cultura direta e cultura de exposição direta avaliam as células direta ou indiretamente em contato com os materiais de implante na mesma cultura bem. A cultura de exposição caracteriza as células indiretamente em contato com os materiais de implante dentro de uma distância prescrita na mesma cultura bem.

Este artigo apresenta uma descrição detalhada dos testes de citocompatibilidade para diferentes materiais biodegradáveis e suas interações com células modelo, ou seja, células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea (BMSCs). Os protocolos incluem a colheita, cultivo, semeadura, fixação, coloração e imagem das células, juntamente com análises de materiais pós-cultura e mídia, que se aplicam a uma variedade de materiais de implante biodegradável e uma ampla gama de tipos de células. Esses métodos são úteis para a triagem de materiais biodegradáveis para diferentes aplicações biomédicas em termos de respostas celulares e citocompatibilidade in vitro.

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Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Califórnia em Riverside (UCR) para coleta de células e tecidos. Uma mulher de 12 semanas, Sprague-Dawley (SD) é mostrada como um exemplo no vídeo. Ratos mais jovens do sexo feminino e masculino são preferidos.

1. Preparação da cultura celular

NOTA: Os três métodos de cultura descritos neste artigo são geralmente aplicáveis para diferentes tipos de células que são aderentes. Aqui, os BMSCs colhidos a partir de desmame de ratos serão introduzidos como exemplo para a preparação da cultura celular. Dependendo de sua relevância para aplicações médicas específicas, diferentes tipos de células podem ser utilizados, incluindo células primárias colhidas de animais ou doadores humanos e linhas celulares de um banco celular/tecido.

  1. Colhendo BMSCs de desmassares de ratos
    NOTA: O diagrama esquemático na Figura 1 mostra os passos para colher BMSCs de desmasmasques de ratos.
    1. Eutanize o rato Sprague Dawley (SD) por inalação de CO2 .
    2. Remova a pele e os tecidos musculares e conjuntivos para dissecar o fêmur do rato eutanizado. Coloque os ossos femorais em um tubo cônico de 15 mL (polipropileno) contendo meio de cultura celular. Coloque os tubos cônicos no gelo até o momento da realização da extração celular.
      NOTA: A tíbia também pode ser usada para colher BMSCs. O meio de cultura celular é o Médio Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco, suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina (P/S).
    3. Transfira os ossos para uma placa de Petri no armário de segurança biológica. Corte as extremidades do osso usando uma lâmina cirúrgica e lave a medula óssea em um tubo cônico de 50 mL (polipropileno) lavando a cavidade da medula óssea com mídia de cultura celular usando uma seringa com uma agulha de 251/2 G.
      NOTA: Insira uma seringa com uma agulha de 18 G na mídia com medula óssea. Lentamente e suavemente, tome e dispense a mídia para quebrar o grande pedaço de medula até que não haja aglomerações visíveis de células/tecidos.
    4. Filtrar a suspensão da célula usando um filtro de 70 μm, seguido de centrifugação a 126 × g (1.000 rpm) por 5 min para obter as pelotas de célula.
    5. Aspire a mídia supernante e reabasteca com 10 mL de mídia fresca. Pipeta suavemente para cima e para baixo para resuspensar as células usando uma pipeta sorológica de 10 mL.
    6. Pipete a suspensão diretamente na parte interna de um frasco T-75 e adicione mídia para trazer o volume até 25 mL. Cultura as células em uma incubadora em um ambiente padrão de cultura celular estéril (ou seja, 37 °C, atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar).
    7. Após 3-7 dias, enxágue as células não aadeentes aspirando o antigo meio e reabastecendo com meio fresco. Continue a culturar e alimentar as células com meio fresco até que estejam prontas para a passagem celular, congelamento ou uso em um experimento.
  2. Manutenção celular
    1. Mude o meio de cultura celular regularmente para remover os resíduos celulares e repor os nutrientes aproximadamente todos os dias até que as células sejam 90%-100% confluentes. Com 90% de confluência, passagem, congelamento ou uso das células em um experimento.
    2. Células de passagem
      NOTA: A passagem, também referida como subcultura, é um termo que se aplica sempre que as células são transferidas de uma cultura para outra. As células recém-colhidas estão na fase de passagem 0 (P0). As quantidades de solução de ácido triáctico de trippsin-etilenodiaminete (trypsin-EDTA) e mídia descrita neste artigo são para um frasco T-75.
      1. Verifique as células sob um microscópio óptico para confirmar se as células são 90% confluentes.
      2. Aspire o meio do frasco celular.
      3. Dispense 10 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) no frasco usando uma pipeta sorológica. Balance suavemente o frasco para enxaguar as células com PBS; aspirar toda a PBS.
        NOTA: Esta etapa serve como uma lavagem extra para garantir que nenhuma célula morta ou resíduos celulares sejam transferidos durante a passagem.
      4. Dispense 3 mL de trypsin-EDTA no frasco celular diretamente na superfície das células. Balance suavemente o frasco para garantir que toda a superfície com as células esteja coberta pela trippsin-EDTA.
      5. Coloque o frasco de célula com trippsina-EDTA na incubadora por 5 minutos para permitir que as células se desprendem.
      6. Após 5 minutos na incubadora, verifique as células sob um microscópio óptico para confirmar se as células estão separadas. Se algumas células não se separarem, toque no lado do frasco da célula suavemente, e verifique o frasco novamente.
      7. Adicione 9 mL de meio fresco ao frasco celular para diluir o trypsin-EDTA. Isso fornece proteínas mais acessíveis para a trippsina-EDTA se ligar em vez de lise das células.
      8. Pipeta as células na mídia e trypsin-EDTA e distribuí-las em um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar as células a 126 × g (1.000 rpm) por 5 min.
      9. Sem perturbar a pelota celular, aspire o meio com trippsin-EDTA.
      10. Adicione 5-10 mL de mídia fresca ao tubo de centrífuga e resuspenque suavemente as células no meio usando uma pipeta sorológica de 10 mL.
      11. Pipeta as células suspensas em médio fora do tubo centrífuga e divide o volume em frascos de cultura fresca de 2-3. Adicione meio suficiente para levar o volume médio total a 25 mL para cada frasco.
        NOTA: A razão de divisão durante a subcultura pode variar dependendo dos tipos celulares e características específicas de crescimento.
      12. Verifique as células sob um microscópio óptico e coloque-as de volta na incubadora.
    3. Células congelantes
      1. Verifique as células sob um microscópio óptico para confirmar se as células são 90% confluentes.
      2. Repetição de passos 1.2.2.2 a 1.2.2.9.
      3. Adicione 900 μL de meio fresco ao tubo de centrífuga com uma micropipette de 100-1000 μL. Células lentamente e suavemente resuspendas em médios usando a mesma micropipette.
      4. Transfira a suspensão celular de 900 μL para um criovial. Adicione 100 μL de dimetilsulfoxida (DMSO).
      5. O mais rápido possível, coloque o criovial em um recipiente de espuma cilíndrica projetado para regular a diminuição da temperatura (veja a Tabela de Materiais). Coloque o recipiente de espuma no congelador -80 °C.
    4. Células de descongelamento
      1. Descongele as células congeladas no banho de água. Pegue um tubo cônico estéril de 15 mL cheio de 5 mL de meio fresco, coloque as células no tubo cônico e centrífugas a 126 × g (1.000 rpm) por 5 min.
      2. Aspire o meio contendo DMSO.
      3. Adicione 5-10 mL de meio fresco ao tubo cônico de 15 mL de células. Devagar e suavemente pipeta para cima e para baixo para resuspensar as células.
      4. Pipetizar as células suspensas em médio entre o tubo cônico de 15 mL e dispensar em um novo frasco T-75. Ao dispensar células, use um movimento de varredura para distribuir as células o mais uniformemente possível na parte inferior do frasco celular.
      5. Adicione meio fresco suficiente para levar o volume médio total a 25 mL para cada frasco T-75.
      6. Verifique as células sob um microscópio óptico e coloque o frasco de célula de volta na incubadora.

2. Preparação e esterilização da amostra

  1. Preparação da amostra
    1. Use placas tratadas com cultura tecidual, como 6, 12, 24, 48 ou 96 poços para experimentos de cultura celular descritos neste artigo. Selecione o tipo de placas de cultura tecidual e o volume de meio em cada poço com base em diferentes desenhos experimentais, como a dimensão da amostra.
  2. Esterilizar ou desinfetar todas as amostras biodegradáveis antes da cultura celular.
    NOTA: Desinfecção é aceitável para in vitro estudos quando as amostras são propensas a alterações químicas e/ou superficiais em algumas condições de esterilização envolvendo alto calor, oxidante e/ou radicais. Os métodos de esterilização ou desinfecção para diferentes tipos de amostras variam dependendo das diferentes propriedades dos materiais, como polímeros, metais e cerâmicas. O processo de esterilização ou desinfecção pode envolver calor, gás, radiação, produtos químicos, alta pressão ou uma combinação destes.
    1. Metais biodegradáveis
      1. Em geral, use radiação ultravioleta (UV) para desinfetar metais biodegradáveis para estudos in vitro .
        NOTA: Por exemplo, Zhang et al. relataram que amostras de magnésio puro (Mg) e ZC21 Mg foram desinfetadas sob radiação UV por 4h antes de serem utilizadas nos estudos celulares1. Para estudos in vivo , as amostras são geralmente necessárias para serem esterilizadas. Para muitos metais biodegradáveis, como ligas de magnésio ou magnésio, o autoclaving usando vapor deve ser evitado porque essas amostras podem ser oxidadas ou corroídas em água6. Um prato de quartzo é recomendado para desinfecção UV porque fornece melhor transparência UV do que a maioria dos copos e plásticos.
      2. Esterilize amostras de ação de linha mg sob calor seco em um forno ou autoclave na faixa de temperatura de 100-200 °C.
        NOTA: Como algumas ligas metálicas ainda podem ser oxidadas na superfície a altas temperaturas no ar, a radiação de alta intensidade pode ser usada como alternativa em alguns casos. No entanto, a radiação de alta intensidade, como a radiação alfa ou gama, deve ser evitada ao esterilizar folhas metálicas finas. Pode causar deslocamento de átomos dentro dos materiais, alterando a microestrutura dos materiais.
      3. Use a esterilização de gás óxido de etileno (EtO) como método alternativo para metais biodegradáveis sensíveis ao calor e à radiação26.
    2. Cerâmica biodegradável
      1. Geralmente, desinfeta cerâmicas biodegradáveis usando radiação UV ou solução de 70% de etanol antes de estudos in vitro .
        NOTA: Por exemplo, Liu et al. relataram que as amostras de fosfato de cálcio foram desinfetadas via imersão em 70% de etanol por 1 h e exposição à luz UV por 12 h em cada lado antes de serem usadas em testes de citocompatibilidade in vitro27.
      2. Use autoclaves para esterilizar cerâmicas biodegradáveis se a alta temperatura e o vapor de água não danificarem suas composações e microestruturas.
        NOTA: Algumas cerâmicas podem ser afetadas pelo autoclaving. Por exemplo, a mudança de fase e o enrurecimento da superfície foram encontrados quando as cerâmicas de zircônia estabilizadas por yttria foram autoclavadas a 121 °C por 15 min. Além disso, os CPCs não podem ser esterilizados via autoclaving com vapor porque as amostras reagirão com água.
      3. Utilize métodos alternativos de esterilização, como a radiação Cobalt-60 para as cerâmicas de zircônia estabilizadas por yttria e amostras DE CPC28.
    3. Polímeros biodegradáveis
      1. Em geral, desinfete polímeros biodegradáveis usando radiação UV ou 70% de etanol antes de usá-los em estudos celulares in vitro.
        NOTA: Alguns polímeros podem sofrer alterações químicas sob radiação UV. Para esterilização, pode-se utilizar tratamento de raios gama, como a radiação Cobalt-60. Por exemplo, os pós de amido foram esterilizados sob radiação Cobalt-60 antes de serem utilizados em estudos in vitro células29.
      2. Materiais de polímero autoclave que podem suportar alta temperatura e umidade.
        NOTA: Por exemplo, polímeros como o polipropileno podem ser autoclavados, pois podem tolerar temperaturas de autoclavação (ou seja, 121-134 °C). Alguns polímeros como a policaprolactona (PCL) não podem ser autoclavados por causa de seus pontos de fusão relativamente baixos (ou seja, em torno de 60 °C)30.
      3. Use gás EtO para esterilizar materiais poliméricos sensíveis à esterilização de calor ou radiação.

3. Métodos de cultura celular

  1. Métodos de cultura direta
    NOTA: O diagrama esquemático na Figura 2A mostra os passos do método de cultura direta. Neste artigo, os BMSCs foram cultivados em uma placa derivada de MG colocada dentro dos poços de uma placa tratada com 12 poços de cultura tecidual como exemplo para ilustrar o método de cultura.
    1. Siga os passos descritos nas etapas 1.2.2.1-1.2.2.10 para obter a suspensão da célula.
    2. Use um frasco confluente de 90% para determinar a concentração celular na suspensão celular usando um hemótmetro. Diluir a suspensão celular usando meio fresco para uma concentração celular prescrita necessária para o estudo celular in vitro.
      NOTA: A densidade de semeadura das células é determinada pelo desenho experimental. Por exemplo, densidades celulares de 2.000-40.000 células/cm2 têm sido utilizadas em diferentes estudos celulares com materiais biodegradáveis.
    3. Coloque as amostras (placa de Mg) no centro das 12 placas de cultura tecidual bem tratadas. Sequencialmente, enxágue as placas de cultura com 2 mL de PBS e 2 mL de DMEM para calibrar a pressão osmótica em condições estéreis. Adicione 3 mL da suspensão celular diluída em cada poço sobre as amostras de interesse.
    4. Cultura as células em uma incubadora sob condições padrão de cultura celular por 24 h.
      NOTA: O tempo de cultura pode ser maior ou menor que 24 horas, dependendo do design experimental.
  2. Culturas de exposição direta
    NOTA: O diagrama esquemático na Figura 2B mostra os passos da cultura de exposição direta.
    1. Conforme descrito nas etapas 3.1.1 e 3.1.2, prepare a suspensão celular com as concentrações necessárias de células baseadas no desenho experimental para diferentes tipos de células e aplicações pretendidas.
    2. Enxágüe as placas de cultura com 2 mL de PBS e 2 mL de DMEM sequencialmente para calibrar a pressão osmótica em condições estéreis. Adicione 3 mL da suspensão da célula diluída em cada poço. Cultura as células na incubadora umidificada sob condições padrão de cultura celular por 24 h ou até que as células atinjam 50-80% de confluência.
      NOTA: O nível de confluência celular pode variar para diferentes tipos de células e design experimental.
    3. Depois de 24 horas, enxágue as células da placa do poço com PBS usando uma pipeta para remover células mortas flutuantes.
    4. Coloque as amostras desinfetadas ou esterilizadas diretamente nas células aderidas. Adicione 3 mL de meio fresco em cada poço.
    5. Cultura as células sob condições padrão de cultura celular por mais 24 h.
      NOTA: O tempo de cultura pode ser maior ou menor que 24 horas, dependendo do design experimental.
  3. Culturas de exposição
    NOTA: O diagrama esquemático na Figura 2C mostra os passos do método de cultura de exposição.
    1. Os passos iniciais para a preparação celular são os mesmos da cultura de exposição. Conforme descrito nas etapas 3.1.1 e 3.1.2, prepare a suspensão celular com as células desejadas. Semelhante aos passos 3.2.1 e 3.2.2, semeou as células na placa do poço na densidade desejada e as cultural em uma incubadora sob condições padrão de cultura celular por 24 h.
    2. Após 24 horas, enxágue as células aderentes com PBS para remover células mortas flutuantes, seguida pela adição de 3 mL de meio fresco em cada poço.
    3. Em seguida, coloque as amostras no poço de inserções com um tamanho de poros de membrana de 0,4 μm e coloque as pastilhas do poço com as amostras em cada poço com as células.
    4. Cultura as células sob condições padrão de cultura celular por mais 24 h.
      NOTA: O tempo de cultura pode ser maior ou menor que 24 horas, dependendo do design experimental.

4. Caracterização pós-cultura das células

NOTA: Para cultura direta e cultura de exposição direta, corrija, manche, imagem e analise as células aderentes tanto em placas de poço quanto em amostras. Para cultura de exposição, analise as células aderidas às placas de poço.

  1. Fixação celular
    1. Colete o meio de pós-cultura de cada poço em um tubo cônico correspondente de 15 mL para análise posterior. Colete todas as amostras após a cultura para análise suplementar.
    2. Enxágüe as células aderentes em ambas as amostras e placas de poço 3 vezes usando PBS.
    3. Adicione 1 mL de paraformaldeído de 4% (PFA, formalina tamponada 10% neutra) em cada placa de poço. Coloque a tampa de volta na placa do poço e deixe o PFA reagir por 20 minutos.
    4. Depois de 20 min, aspire o PFA e dispense-o em uma garrafa de lixo. Enxágüe a placa do poço 3 vezes usando PBS para remover o PFA e transfira o resíduo para a garrafa de resíduo.
  2. Coloração celular
    1. Prepare os estoques de trabalho dos agentes de coloração seguindo as instruções dos fabricantes.
      NOTA: Por exemplo, alexa Fluor 488 Phalloidin é usado para manchar F-actin, e 4′, 6-diamidino-2-fenilôndole (DAPI) é usado para manchar núcleos celulares. O tempo de coloração pode ser reduzido se as amostras se degradarem rapidamente nas soluções de coloração.
    2. Adicione 200-400 μL de agente de coloração de roscida Alexa Fluor 488 Phalloidin diluído a cada poço para cobrir as células na placa do poço e na amostra. Enrole a placa do poço em papel alumínio para evitar a exposição à luz, e permita que a Alexa Fluor 488 Phalloidin reaja por 20 minutos à temperatura ambiente.
    3. Colete o agente de coloração Alexa Fluor 488 Phalloidin e dispense-o no frasco de resíduo correspondente. Enxágüe a placa do poço 3 vezes usando PBS para remover o excesso de Alexa Fluor 488 Phalloidin, e dispense o PBS usado na garrafa de resíduo correspondente.
    4. Adicione 200-400 μL de DAPI diluído a cada poço para cobrir as células no poço e na amostra. Enrole a placa do poço em papel alumínio e deixe que o DAPI reaja por 5 minutos à temperatura ambiente.
    5. Colete o DAPI e dispense-o na garrafa de resíduo correspondente. Enxágüe a placa do poço 3 vezes usando PBS para remover o DAPI e dispense o PBS usado na garrafa de resíduo correspondente.
  3. Imagem celular
    1. Após a coloração, imagem as células usando um microscópio de fluorescência. Sempre que possível, tire imagens de contraste de fases das células, além de imagens de fluorescência. Imagem das células nas amostras biodegradáveis o mais rápido possível ou imediatamente após a coloração para evitar ou reduzir possíveis alterações causadas pela degradação contínua das amostras. Armazene as células nas placas do poço em uma solução tampão a 2-8 °C após a fixação, e apenas a imagem das células o mais rápido possível após a coloração para evitar a perda de sinais de fluorescência.
    2. Para cultura direta e cultura de exposição direta, imagem e avaliação de dois tipos de células: (1) as células das amostras (em contato direto com as amostras) e (2) as células aderentes na placa do poço ao redor das amostras (contato indireto com as amostras), conforme mostrado na Figura 3A.
    3. Para a cultura de exposição, como mostrado na Figura 3B, use um guia de imagem ao tirar as imagens de fluorescência das células para determinar se a resposta celular seria diferente em resposta ao gradiente dinâmico de degradação das amostras. Imagem e analisar as células localizadas na área dentro do anel interno (3,5 mm de distância do centro) e o anel externo (7 mm de distância do centro) separadamente.
      NOTA: O guia de imagem é usado para definir a distância entre as células e as amostras.
    4. Para cada amostra e bem nas placas de cultura, pegue aleatoriamente pelo menos cinco imagens de cada área de interesse onde as células estejam em contato direto ou contato indireto com as amostras a uma distância predefinida.
  4. Análise de imagem
    1. Para todas as imagens celulares obtidas a partir da etapa 4.3, quantifique a morfologia celular medindo a área de disseminação celular e a proporção usando softwares como ImageJ para análise de imagens.
    2. Conte o número de células em cada área de imagem. Calcule a densidade de adesão celular em condições de contato diretas e indiretas como o número de células por área unitária.

5. Análises pós-cultura de mídia e amostras

  1. Meça o pH do meio pós-cultura.
    NOTA: Algumas amostras alteram o valor do pH do meio durante sua degradação. Por exemplo, metais biodegradáveis, como ligas de magnésio, geralmente aumentam o valor do pH do meio devido à sua degradação31. Em contraste, polímeros biodegradáveis como o PLGA frequentemente diminuem o valor do pH do meio quando se degradam32. Medir o valor do pH do meio pós-cultura pode indicar a degradação dessas amostras in vitro.
    1. Antes da fixação celular, colete o meio pós-cultura como na etapa 4.1.1.
    2. Meça os valores de pH do meio pós-cultura em cada poço imediatamente após a coleta, utilizando um medidor de pH pré-calibrado.
      NOTA: O pH da mídia pode derivar ao longo do tempo devido a condições ambientais como nível de CO2 e temperatura, que devem ser levadas em consideração.
  2. Analisar as composições médias para o comportamento de degradação de amostras biodegradáveis. Para algumas amostras que causam uma mudança de cor do meio, meça o valor da densidade óptica (O.D.) do meio pós-cultura usando um espectotômetro ou um leitor de microplaca para determinar o comportamento de degradação. Alternativamente, utilize espectroscopia ultravioleta visível (UV-VIS) e Fourier transforme espectroscopia infravermelha atenuada de refleticência total atenuada (FTIR-ATR) para analisar os produtos de degradação no meio pós-cultura.
    NOTA: Medir os produtos de degradação no meio pós-cultura é valioso para entender o comportamento de degradação das amostras. Uma das abordagens mais comuns é medir os íons de interesse no meio pós-cultura usando um espectrômetro de emissão plasma-óptica indutivamente acoplado (ICP-OES). O ICP-OES pode ser usado para medir as composições do meio pós-cultura de metais e cerâmicas, mas pode não ser adequado para polímeros. Polímeros geralmente consistem em carbono, hidrogênio e oxigênio, e a quantificação precisa desses elementos é difícil para iCP-OES.
    1. Seguindo a etapa 5.1.2 para medição de pH, colete e dilua o meio utilizando um fator de diluição desejável para as medidas ideais das concentrações de íons.
    2. Meça as concentrações dos íons de interesse no meio pós-cultura utilizando um ICP-OES.
  3. Análise pós-cultura de amostras
    NOTA: Após o estudo in vitro celular, as amostras biodegradáveis podem mudar de dimensão, massa, morfologia superficial, microestrutura e composição. A análise pós-cultura das amostras ajuda a entender o mecanismo de degradação das amostras.
    1. Após a cultura celular, pegue as fotografias das amostras para mostrar possíveis alterações na dimensão da amostra, cor, morfologia e outras características visíveis.
    2. Seque ou desidrate as amostras pós-cultura e meça a massa, a dimensão e o volume da amostra para quantificar quaisquer alterações na massa, dimensão e volume.
    3. Use um microscópio eletrônico de varredura (SEM) para caracterizar a microestrutura e morfologia das amostras. Use espectroscopia de raios-X dispersivos de energia (EDX) e difração de raios-X (XRD) para caracterizar a composição e a fase dos produtos de degradação nas amostras. Use FTIR-ATR para detectar a ligação química nas superfícies da amostra.

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Resultados

A Figura 4 mostra as imagens representativas de fluorescência de BMSCs em condições de contato diretas e indiretas utilizando diferentes métodos culturais. A Figura 4A,B mostra os BMSCs em condições de contato direto e indireto após a mesma cultura direta de 24 horas com ligas de magnésio ZC211. As ligas ZC21 consistem em 97,5 wt% magnésio, 2 wt% zinco e 0,5% de cálcio. As células que não têm contato direto com as amostra...

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Discussão

Diferentes métodos de cultura celular podem ser usados para avaliar a citocompatibilidade in vitro de biomateriais de interesse para vários aspectos das aplicações in vivo. Este artigo demonstra três métodos de cultura in vitro , ou seja, cultura direta, cultura de exposição direta e cultura de exposição, para imitar diferentes cenários in vivo onde materiais de implante biodegradáveis são usados dentro do corpo humano. O método de cultura direta é usado principalmente para avaliar o c...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

Os autores apreciam o apoio financeiro da Fundação Nacional de Ciência dos EUA (NSF CBET 1512764 e NSF PIRE 1545852), dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH NIDCR 1R03DE028631), da Bolsa de Desenvolvimento da Faculdade Regentes da Universidade da Califórnia (UC) Regentes, e do Comitê de Pesquisa seed Grant (Huinan Liu), e da UC-Riverside Dissertation Research Grant (Jiiaaj Lin). Os autores apreciam a Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) na UC-Riverside para o uso de SEM/EDS e Dr. Perry Cheung para o uso de instrumentos XRD. Os autores também apreciam Thanh Vy Nguyen e Queenie Xu por edição parcial. Os autores também gostariam de agradecer Cindy Lee por gravar a narração do vídeo. Quaisquer opiniões, achados e conclusões ou recomendações expressas neste artigo são dos autores e não refletem necessariamente as opiniões da Fundação Nacional de Ciência ou dos Institutos Nacionais de Saúde.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pipeta serológica de 10 mLVWR490019-704
Placas tratadas com cultura de tecidos de 12 poçosThermo Fisher Scientific353043
Tubo cónico de 15 mL (polipropileno)VWR89039-666
Agulha de 18 GBD305196
25½ Agulha GBD305122
4′,6-diamidino-2- fenilindol dilactato (DAPI)InvitrogenD3571
Tubo cónico de 50 mL (Polipropileno)VWR89039-658
70 μ Filtro de nylon FisherScientific50-105-0135
Alexa Flour 488-faloidinaLife technologiesA12379
Armário de segurança biológicaLABCONCOClasse II, Centrífuga Tipo A2
EppendorfRotor F-35-6-30, Centrífuga5430
Prato Redondo de Quartzo Fusível TransparenteAdValue TechnologyFQ-4085
Incubadora CO2SANYOMCO-19AIC
CoolCell Freezer ContainerCorning432000projetado para regular a diminuição da temperatura
CryovialThermo Fisher Scientific5000-1020
Dimetil Sulfóxido (DMSO)Sigma-Aldrich472301
Dulbecco' s Águia modificada' s medium (DMEM)Software de análise Sigma-AldrichD5648
EDXOxford InstrumentsAztecSynergy
Espectroscopia de raios-X por dispersão de energia (EDX)FEI50mm2 X-Max50 SDD
Soro bovino fetal (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.
Microscópio de fluorescênciaNikonEclipse Ti
FormaldeídoVWR100496-496
HemacitômetroHausser Scientific3520
Software ImageJInstitutos Nacionais de Saúde e o Laboratório de Instrumentação Óptica e Computacional (LOCI, Universidade de Wisconsin)
Espectrometria de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado
(ICP-OES)		PerkinElmerOptima 8000
Microscópio óticoVWRVistaVision
Penicilina/estreptomicina (P/S)Thermo Fisher Scientific, Inc.,15070063
medidor de pHVWRmodelo SB70P
Tamponamento de fosfato salino (PBS)VWR97062-730
Microscópio eletrônico de varredura (MEV)FEINova NanoSEM 450
lâmina cirúrgicaVWR76353-728
Frascos de cultura de tecidosVWRT-75, MSPP-90076
Inserções TranswellCorning3460
Solução de ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (tripsina-EDTA)Sigma-AldrichT4049
difratação de raios X (XRD)PANalyticalEmpyrean Series 2
Recipiente de espuma SH30910

Referências

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