A extração de moléculas de glicogênio hepático para determinação da estrutura do glicogênio

Resumo

Uma concentração ótima de sacarose foi determinada para a extração de glicogênio hepático usando centrifugação por gradiente de densidade de sacarose. A adição de uma etapa de ebulição de 10 min para inibir enzimas degradadoras de glicogênio mostrou-se benéfica.

Resumo

O glicogênio hepático é um polímero de glicose hiperramificado que está envolvido na manutenção dos níveis de açúcar no sangue em animais. As propriedades do glicogênio são influenciadas por sua estrutura. Assim, um método de extração adequado que isole amostras representativas de glicogênio é crucial para o estudo dessa macromolécula. Comparado a outros métodos de extração, um método que emprega uma etapa de centrifugação por gradiente de densidade de sacarose pode minimizar o dano molecular. Com base nesse método, uma publicação recente descreve como a densidade da solução de sacarose utilizada durante a centrifugação foi variada (30%, 50%, 72,5%) para encontrar a concentração mais adequada para extrair partículas de glicogênio de uma ampla variedade de tamanhos, limitando a perda de partículas menores. Uma etapa de ebulição de 10 minutos foi introduzida para testar sua capacidade de desnaturar enzimas degradadoras de glicogênio, preservando assim o glicogênio. A menor concentração de sacarose (30%) e a adição da etapa de ebulição foram mostradas para extrair as amostras mais representativas de glicogênio.

Introdução

O glicogênio é um polímero complexo e hiperramificado de glicose encontrado em animais, fungos e bactérias¹. Em mamíferos, o glicogênio hepático funciona como um tampão glicêmico, preservando a homeostase, enquanto o glicogênio muscular atua como um reservatório de glicose de curto prazo para fornecer energia diretamente². A estrutura do glicogênio é frequentemente descrita por três níveis (mostrados na Figura 1): 1. As cadeias lineares são formadas por monômeros de glicose via ligações glicosídicas (1→4)-α, com pontos de ramificação conectados via ligações glicosídicas (1→6)-α; 2. partícula....

Protocolo

Fígados de camundongos usados para otimizar este procedimento²¹ eram de 12 camundongos machos BKS-DB/Nju (7,2 semanas de idade, ver Tabela de Materiais). O uso de animais foi aprovado pelo Renmin Hospital da Universidade de Wuhan Animal Care and Ethics Committee, IACUC Issue No. WDRM 20181113.

1 Tecidos animais

1. Pesar fígado de camundongo (1-1,8 g de fígado inteiro de cada camundongo).
2. Congelar rapidamente o fígado do rato em azoto líquido e armazená-lo a -80 °C.

2. Preparação do tampão e dos reagentes

1. Preparar tampão de isolamento de gli....

Resultados

Embora o procedimento descrito acima seja o mais ótimo (sacarose a 30% com a adição de uma etapa de ebulição de 10min), aqui são fornecidos dados para o glicogênio extraído através de três concentrações de sacarose (30%, 50%, 72,5%), com e sem uma etapa de ebulição, como descrito anteriormente²¹. Seguindo o protocolo, a pureza, o rendimento bruto e o rendimento de glicogênio do glicogênio seco extraído por diferentes condições são apresentados na Tabela 1, reproduzida a partir de<.......

Discussão

Estudos anteriores mostraram que a estrutura do glicogênio é importante por suas propriedades; Por exemplo, o tamanho molecular afeta a taxa de degradação do glicogênio¹⁰, e a distribuição do comprimento da cadeia afeta sua solubilidade²⁶. Para entender adequadamente essas relações, é importante extrair glicogênio com um procedimento que isole, tanto quanto possível, uma amostra representativa e intacta. Os métodos tradicionais de extração utilizavam condições alcalinas que.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
8-aminopireno-1,3,6-trissulfonato (APTS)	SIGMA Aldrich	9341	0,1 M solução
Ácido acético	SIGMA Aldrich	695092	0,1 M, solução de pH 3,5
Agilent 1260 Infinity SEC sistema	Agilent, Santa Clara, CA, EUA		Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC)
BKS-DB/Nju camundongos de fundo	Nanjing Biomedical Research Institution da Universidade de Nanjing
Kit de ensaio de D-glicose (formato GOPOD)	Megazyme	K-GLUC
Ácido etilenoditrilotetracético (EDTA)	SIGMA Aldrich	431788
Homogeneizador	IKA	T 25
Ácido clorídrico	SIGMA Aldrich	2104	0,1 M solução
Ácido clorídrico	SIGMA Aldrich	2104	0,1 M solução
P/ACE MDQ plus system	Ab Sciex, US		Eletroforese de carboidratos assistida por fluoróforo (FACE)
Detector de índice de refração	Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, EUA)		Cromatografia de exclusão por tamanho (SEC)
Acetato de sódio	SIGMA Aldrich	241245	1 M, solução de pH 4,5
Azida de sódio	SIGMA Aldrich	S2002
Cloreto de sódio	SIGMA Aldrich	S9888
Cianoborohidreto de sódio	SIGMA Aldrich	156159	solução 1 M
Fluoreto de sódio	SIGMA Aldrich	201154
Hidróxido de sódio	SIGMA Aldrich	43617	0,1 M solução
Nitrato de sódio	SIGMA Aldrich	NISTRM8569
Pirofosfato de sódio	SIGMA Aldrich	221368
Sacarose	SIGMA Aldrich	V90016
SUPREMA pré-coluna, 1.000 e 10.000 colunas	Polymer Standards Services, Mainz, Alemanha		Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC)
Trizma	SIGMA Aldrich	T 1503
Tubos de ultracentrífuga	Beckman		4 mL, tubo ultratransparente de parede fina de topo aberto, 11 x 60 mm