Um método não-rótulo, não-isotópico não-radio-isotópico para avaliar a atividade uracil-DNA glicosylase foi desenvolvido usando espectrometria de massa MALDI-TOF para análise direta do produto que contém local apurinic/apyrimidinic. O ensaio provou ser bastante simples, específico, rápido e fácil de usar para a medição de glicosilase de DNA.
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Artigo de método
Ensaio de Glicosylase Uracil-DNA por Desorção a Laser Assistida por Matriz/Análise de Espectrometria de Massa
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Uracil-DNA glicosylase (UDG) é um componente-chave na via de reparo de excisão base para a correção de uracil formado a partir de deaminação hidrolítica da citosina. Assim, é crucial para a manutenção da integridade do genoma. Um método altamente específico, não rotulado, não-radio-isotópico foi desenvolvido para medir a atividade udg. Um duplex de DNA sintético contendo um uracil específico do local foi cortado pelo UDG e, em seguida, submetido à análise de espectrometria de massa assistida pela Matrix(MALDI-TOF MS). Um protocolo foi estabelecido para preservar o produto apurinic/apyrimidinic (AP) no DNA sem quebra de fios. A alteração do valor m/z do substrato para o produto foi utilizada para avaliar a hidrólise uracil por UDG. Um substrato G:U foi utilizado para análise cinética UDG que produz o Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM/s e Kcat = 9,31 s-1. A aplicação deste método a um ensaio inibidor de gllicosylase uracil (UGI) rendeu um valor IC50 de 7,6 pM. A especificidade do UDG usando uracil em várias posições dentro de substratos de DNA de fio único e duplamente encalhados demonstrou diferentes eficiências de decote. Assim, este método simples, rápido e versátil MALDI-TOF MS pode ser um excelente método de referência para várias glicosilases de DNA monofuncionais. Também tem o potencial como ferramenta para a triagem inibidora de glicosilase de DNA.
Introdução
Embora o uracil seja uma base normal no RNA, é uma lesão comum e altamente mutagênica no DNA genômico. Uracil pode surgir de deaminação hidrolítica espontânea/enzimática de uma desoxicytidina. Em cada célula viva, essa desaminação ocorre 100-500 vezes por dia sob condições fisiológicas1,2. Se essas alterações não forem reparadas, pode haver uma mudança na composição da sequência de DNA, causando mutação. Como uracil no DNA prefere emparelhar com dATP durante a replicação, se a citosina desaminar para uracil, em dois eventos de replicação, haverá uma nova mutação de transição G:C para A:T em metade do DNA progê....
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Protocolo
1. Preparação de substrato/modelo
- Design uracil substrato/modelo duplex com um conteúdo G+C equilibrado de ~50 ± 10% e temperatura mínima de fusão de 50 °C para a região duplex.
NOTA: Uma diferença de nucleotídeos entre 18 substratos e 19 modelos nt (Tabela 1 e Figura 1) ajuda a melhor interpretação do sinal de MS e a ressaração adequada. A cadeia de modelo serve como DNA complementar para gerar incompatibilidades A-U ou G-U (Tabela 1), mas também pode ser usada como sinal de referência em medições de MS. O uso de oligonucleotídeos sintéticos purificados pelo HPLC é satisfató....
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Resultados
Modelos e substratos
Tomando oligonucleotídeos sintéticos com U no centro (U+9) emparelhados com um modelo G como exemplo (Figura 1A), um controle em branco de quantidades equimolares de modelo e substrato contendo uracil pode ser usado para controle de qualidade da pureza oligonucleotídeo sintético (Figura 1B; os sinais correspondem ao m/z designado e ao baixo ruído de fundo). Para a análise dos dados de MS, as alturas máximas foram medidas .......
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Discussão
Este artigo fornece um procedimento detalhado para o uso de um método de ensaio UDG MALDI-TOF MS para detectar diretamente produtos de DNA contendo AP. As principais vantagens deste método são que os substratos contendo uracil são livres de rótulos, escaláveis, fáceis de trabalhar e oferecem maior flexibilidade no design de substratos.
A extração de fenol/clorofórmio recomendada pelo fornecedor UDG permite a inativação da enzima para evitar a degradação do DNA do produto. No entanto, o protoco.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos ao Centro Integrado de Genômica Funcional da NCFPB (Taipei, Taiwan) e ao NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Taiwan) pelo apoio técnico. Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan, R.O.C. [número de subvenção MOST109-2314-B-002 -186 para K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 para S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 para W.-h.F.]. H.-L.C. é um beneficiário de uma bolsa de doutorado da Universidade Nacional de Taiwan. Financiamento para cobrança de acesso aberto: Ministério da Ciência e Tecnologia, R.O.C.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2-Amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol (base Tris) | J.T padeiro | Protocolo 1,2 | |
| Água deionizada autoclavada | MILLIPORE | Protocolo 1,2 | |
| EDTA | J.T Baker | Protocolo 1,2 | |
| Luvas | Protocolo AQUAGLOVE | 1,2,3 | |
| Ácido clorídrico (HCl) | SIGMA | Protocolo 1,2 | |
| Balde de gelo | Taiwan.Inc | Protocolo 2 | |
| Pontas de pipeta de baixa retenção (0,5-10 µ L) | gene | Protocolo 1,2 | |
| Pontas de pipeta de baixa retenção (1.250 µ L) | fornecimento científico nacional co, Inc. | Protocolo 1,2 | |
| Pontas de pipeta de baixa retenção (200 µ L) | fornecimento científico nacional co, Inc. | Protocolo 1,2 | |
| MassARRAY& | nbsp; Agena Bioscience, CA | Protocol 4, 5 Os programas de controle de espectrometria de massa incluem Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE e Start RT Process. | |
| MassARRAY Nanodispensador | AAT Bioquest, Inc. | RS1000 | Protocolo 3 |
| Microcentrífuga | Protocolo Kubota | 2 | |
| Microcentrífuga | Protocolo Clubio | 2 | |
| Tubo de microcentrífuga (1,5 mL) | Fornecimento científico nacional co, Inc. | Protocolo 2 | |
| Microcentrifuge tube rack | Taiwan.Inc | Protocolo 1,2 | |
| Micropipeta (Pág. 1000) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| (P2) | Protocolo Gilson | 1,2 | |
| Micropipeta (P10) | Protocolo Gilson | 1,2 | |
| Micropipeta (P100) | Protocolo Gilson | 1,2 | |
| Micropipeta (P200) | Protocolo Gilson | 1,2 | |
| Micropipeta (SL2) | Protocolo Rainin | 1,2 | |
| Oligonucleotídeos Tecnologias | Integradas de DNA (Cingapura) | Protocolo n.º 1,2 | |
| Calculadora Quest Graph IC50 (v.1) | AAT Bioquest, Inc. | Fig. 4 https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1 | |
| Hidróxido de sódio (NaOH) | WAKO | Protocol 2 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | Protocolo 3, 5 |
| Temporizador | Taiwan.Inc | Protocolo 2 | |
| Software Typer 4.0 | Agena Bioscience, CA | #10145 | Protocolo 6 Typer 4.0 consiste em quatro programas, incluindo Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor e Typer Analyzer. |
| Tampão da reação de UDG (10x) | New England Biolabs, miliampère | B0280S | Protocolo 2 |
| Glycosylase do Uracil | , miliampère | M0281S | Protocolo 2 |
| Glicosylase | New England Biolabs do Uracil-ADN, miliampère | M0280L | Protocolo 2 |
| Espectrofotômetro UV-1601 | SHIMADZU | Protocolo 1 | |
| Banho-maria | ZETA ZC-4000 ( Taiwan.Inc)Protocolo | 2 |
Referências
- Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. Biochemistry. 29 (10), 2532-2537 (1990).
- Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E.
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Reimpressões e permissões
