Artigo de método

Gerando organoides cardíacos humanos auto-montados derivados de células-tronco pluripotentes

DOI:

10.3791/63097

⸱

15 de setembro de 2021

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Division of Developmental and Stem Cell Biology, Michigan State University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Michigan State University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos um protocolo para criar organoides cardíacos humanos relevantes de desenvolvimento (hHOs) usando eficientemente células-tronco pluripotentes humanas por auto-organização. O protocolo conta com a ativação sequencial de pistas de desenvolvimento e produz tecidos cardíacos humanos altamente complexos e funcionalmente relevantes.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A capacidade de estudar o desenvolvimento cardíaco humano em saúde e doença é altamente limitada pela capacidade de modelar a complexidade do coração humano in vitro. O desenvolvimento de plataformas mais eficientes semelhantes a órgãos que podem modelar fenótipos complexos in vivo , como organoides e órgãos em um chip, aumentará a capacidade de estudar o desenvolvimento cardíaco humano e doenças. Este artigo descreve um protocolo para gerar organoides cardíacos humanos altamente complexos (hHOs) por auto-organização usando células-tronco pluripotentes humanas e ativação de caminhos de desenvolvimento stepwise usando inibidores de pequenas moléculas. Os corpos embrionários (EBs) são gerados em uma placa de 96 poços com fundo redondo, poços de fixação ultra-baixo, facilitando a cultura de suspensão de construções individualizadas.

Os EBs sofrem diferenciação em hHOs por uma estratégia de modulação de sinalização WNT de três etapas, que envolve uma ativação inicial da via WNT para induzir o destino do mesoderm cardíaco, um segundo passo da inibição de Wnt para criar linhagens cardíacas definitivas, e um terceiro passo de ativação wnt para induzir tecidos proepicardiais de órgãos. Essas etapas, realizadas em formato de 96 poços, são altamente eficientes, reprodutíveis e produzem grandes quantidades de organoides por execução. A análise por imagens de imunofluorescência do dia 3 ao dia 11 de diferenciação revela especificações de campo cardíaco de primeiro e segundo e tecidos de alta complexidade dentro dos HHOs no dia 15, incluindo tecido miocárdio com regiões de cardiomiócitos atrial e ventricular, bem como câmaras internas forradas com tecido endocardial. Os organoides também exibem uma intrincada rede vascular em toda a estrutura e um revestimento externo de tecido epicártico. Do ponto de vista funcional, os HHOs batem robustamente e apresentam atividade normal de cálcio, conforme determinado pela imagem ao vivo fluo-4. No geral, este protocolo constitui uma plataforma sólida para estudos in vitro em tecidos cardíacos semelhantes a órgãos humanos.

Introdução

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Os defeitos cardíacos congênitos (CHDs) são o tipo mais comum de defeito congênito em humanos e afetam aproximadamente 1% de todos os nascidos vivos1,2,3. Na maioria das circunstâncias, as razões para os CHDs permanecem desconhecidas. A capacidade de criar modelos de coração humano no laboratório que se assemelham muito ao coração humano em desenvolvimento constitui um passo significativo para estudar diretamente as causas subjacentes dos CHDs em humanos e não em modelos animais substitutos.

O epítome de modelos de tecido cultivados em laboratório ....

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Protocolo

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1. cultura e manutenção hPSC

NOTA: Os PSCs induzidos por humanos (hiPSCs) ou células-tronco embrionárias humanas (hESCs) precisam ser cultivados por pelo menos 2 passagens consecutivas após o descongelamento antes de serem usados para gerar EBs para diferenciação ou criopreservação. hPSCs são cultivados em meio PSC (ver a Tabela de Materiais) em placas de cultura de 6 poços revestidos de membrana de porão (BM-ECM) revestidos de 6 poços. Ao realizar alterações médias em hPSCs em placas de 6 poços, adicione o meio diretamente ao lado interno do poço, em vez de diretamente em cima das células para evitar o descolamento ou estres....

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Resultados

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Para alcançar a auto-organização hHO in vitro, modificamos e combinamos protocolos de diferenciação previamente descritos para diferenciação de monocamadas 2D de células cardiomiocós-ástica21 e epicárida22 usando moduladores de via Wnt e para organoides pré-cardiaco 3D16 usando os fatores de crescimento BMP4 e Activin A. Utilizando a placa de 96 poços EB e protocolo de diferenciação hHO descritos aqui e mostrados na Figu.......

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Discussão

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Avanços recentes em cardiomiócitos derivados de células-tronco humanas e outras células de origem cardíaca têm sido usados para modelar o desenvolvimento do coração humano22,24,25 e doenças26,27,28 e como ferramentas para triagem de terapêutica29,30 e agentes .......

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo National Heart, Lung, and Blood Institute dos Institutos Nacionais de Saúde sob os números de premiação K01HL135464 e R01HL15151505 e pela American Heart Association sob o prêmio número 19IPLOI34660342. Agradecemos ao Núcleo avançado de Microscopia da MSU e ao Dr. William Jackson do Departamento de Farmacologia e Toxicologia da MSU pelo acesso aos microscópios confocal, ao Núcleo de Microscopia de QI e ao Núcleo de Genômica da MSU para serviços de sequenciamento. Também queremos agradecer a todos os membros do Laboratório Aguirre por seus valiosos comentários e conselhos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Alexa Fluor 488 Burro anti-ratoInvitrogenA-212021:200
Alexa Fluor 488 Burro anti-coelhoInvitrogenA-212061:200
Alexa Fluor 594 Burro anti-ratoInvitrogenA-212031:200
Alexa Fluor 594 Burro anti-coelhoInvitrogenA-212071:200
Alexa Fluor 647 Burro anti- cabraInvitrogenA328491:200
HAND1Abcamab196622Coelho; 1:200
HAND2Abcamab200040Coelho; 1:200
NFAT2Abcamab25916Coelho; 1:100
PECAM1DSHBP2B1Coelho; 1:50
TNNT2Abcamab8295Mouse; 1:200
THY1Abcamab133350Coelho; 1:200
TJP1InvitrogenPA5-19090Cabra; 1:250
VIMAbcamab11256Cabra; 1:250
WT1Abcamab89901Coelho; 1:200
Meios e Reagentes
AccutaseTecnologias Celulares InovadorasNC9464543reagente de dissociação celular
Activin AR& D Systems338AC010
B-27 Suplemento (Menos Insulina)Suplementode cultura de células sem insulina Gibco A1895601
B-27 SuplementoGibco17504-044Suplemento de cultura de células
BMP-4GibcoPHC9534
Albumina de soro bovinoBioworld50253966
CHIR-99021Selleck442310
D-(-)-FrutoseMillipore SigmaF0127
DAPIThermo Scientific622481:1000
Dimetil SulfóxidoMillipore SigmaD2650
DMEM/F12Gibco10566016
Essential 8 Flex Medium KitGibcoA2858501meio de células-tronco pluripotentes (PSC) contendo 1% penicilina-estreptomicina
Fluo4-AMInvitrogenF14201
GlicerolMillipore SigmaG5516
GlicinaMillipore Sigma410225
Matrigel GFRCorningCB40230Matriz extracelular da membrana basal (BM-ECM)
Soro de burro normalMillipore SigmaS30-100mL
ParaformaldeídoMP BiomedicalsIC15014601Pó dissolvido em tampão PBS - use a 4%
penicilina-estreptomicinaGibco15140122
solução tampão de fosfatoGibco10010049
solução tampão de fosfato (10x)Gibco70011044
Polybead MicrospheresPolysciences, Inc.7315590 µ m
ReLeSRStem Cell TechnologiesNC0729236reagente de dissociação para hPSCs
RPMI 1640Gibco11875093
TiazovivinaMillipore SigmaSML1045
Triton X-100Millipore SigmaT8787
Trypan Blue SolutionGibco1525006
VECTASHIELD Vibrance Antifade Montagem MédiaVector LaboratoriesH170010
WNT-C59SelleckNC0710557
Outros
Tubos de Microcentrífuga de 1,5 mLFisher Scientific02682002
Tubos Falcon de 15 mLFisher Scientific1495970C
Frascos Criogênicos de 2 mLCorning13-700-500
Reservatórios de Reagentes de 50 mLFisherbrand13681502
Placas de Cultura de Células de Fundo Plano de 6 PoçosCorning0720083
8 Vidro de cobertura com vidro de cobertura de alto desempenho #1.5CellvisC8-1.5H-N
Microplacas de Fixação Ultra Baixa Transparente de 96 poçosCostar07201680
ImageJNIHImage software de processamento
Kimwipes Kimberly-Clark Professional06-666toalhetes de laboratório
Micro Cover GlassVWR48393-24124 x 50 mm No. 1.5
Lâminas de MicroscópioFisherbrand1255015
Moxi Cell CounterOrflo Technologies  MXZ001
de contagem de células Moxi Z - Tipo MOrflo  TecnologiasMXC001
Pipetas MulticanalFisherbrand FBE120030030-300 µ L
Olympus cellVivoOlympusPara Caclium Imaging, análise com Imagej
Sorvall Legend X1 CentrífugaThermoFisher Scientific75004261
Misturador TérmicoThermoFisher Scientific13-687-717
Top Coat Nail VarishSeche VitePode comprar em qualquer supermercado
Anticorpos de

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
  2. Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease....

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Reimpressões e permissões

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Etiquetas

Human Heart OrganoidsPluripotent Stem CellsSelf Assembling OrganoidsWnt Signaling ModulationEmbryoid BodiesCardiac Mesoderm DifferentiationImmunofluorescence ImagingCalcium ImagingCardiomyocyte SpecificationVascular Network Formation

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