Artigo de método

Isolamento, Propagação e Identificação de Espécies Bacterianas com Propriedades Metabolizadoras de Hidrocarbonetos de Habitats Aquáticos

DOI:

10.3791/63101

⸱

7 de dezembro de 2021

 , 
1Department of Life Sciences, School of Natural Sciences, Shiv Nadar University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apresentamos o processo de isolamento, propagação e caracterização de bactérias degradadoras de hidrocarbonetos de habitats aquáticos. O protocolo descreve o isolamento bacteriano, a identificação pelo método 16S rRNA e o teste de seu potencial degradador de hidrocarbonetos. Este artigo ajudará os pesquisadores na caracterização da biodiversidade microbiana em amostras ambientais e, especificamente, na triagem de micróbios com potencial de biorremediação.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os hidrocarbonetos poluentes são recalcitrantes à degradação e seu acúmulo no meio ambiente é tóxico para todas as formas de vida. As bactérias codificam numerosas enzimas catalíticas e são naturalmente capazes de metabolizar hidrocarbonetos. Os cientistas aproveitam a biodiversidade nos ecossistemas aquáticos para isolar bactérias com potencial de biodegradação e biorremediação. Tais isolados do ambiente fornecem um rico conjunto de vias metabólicas e enzimas, que podem ser posteriormente utilizadas para escalar o processo de degradação em escala industrial. Neste artigo, descrevemos o processo geral de isolamento, propagação e identificação de espécies bacterianas de habitats aquáticos e selecionamos sua capacidade de utilizar hidrocarbonetos como única fonte de carbono in vitro usando técnicas simples. O presente protocolo descreve o isolamento de várias espécies bacterianas e sua posterior identificação utilizando a análise do 16S rRNA. O protocolo também apresenta etapas para a caracterização do potencial degradador de hidrocarbonetos de isolados bacterianos. Este protocolo será útil para pesquisadores que tentam isolar espécies bacterianas de habitats ambientais para suas aplicações biotecnológicas.

Introdução

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Os hidrocarbonetos (HC) são amplamente utilizados tanto como combustíveis quanto em aplicações químicas. Hidrocarbonetos aromáticos como benzeno, tolueno e xileno são amplamente utilizados como solventes1. Alcenos como etileno e propileno servem como precursores na síntese de polímeros de polietileno e polipropileno, respectivamente. Polimerização de outro hidrocarboneto, estireno forma poliestireno. As atividades antrópicas introduzem hidrocarbonetos no meio ambiente durante sua produção e transporte. A contaminação do solo e da água por hidrocarbonetos preocupa seriamente o ambiente e a saúde humana. Os micróbios desempenham um papel importante na manutenção do ecossistema, regulando os ciclos biogeoquímicos e utilizando uma ampla gama de substratos, que incluem poluentes e xenobióticos também, convertendo-os em carbono e fonte de energia. Esse processo de desintoxicação de contaminantes ambientais por microrganismos é conhecido como biorremediação 3,4,5,6,7.

Microrganismos com capacidade de degradar hidrocarbonetos são encontrados em habitats aquáticos e de solo 8,9,10. Muitas bactérias com potencial para degradar alcanos e HCs aromáticos têm sido identificadas, como Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter e Oleibacter11. O desenvolvimento de abordagens tecnologicamente avançadas independentes de cultura tem ajudado a descobrir novas comunidades microbianas degradadoras de HC12. O material genômico isolado diretamente das amostras de origem é amplificado e sequenciado por métodos de alto rendimento, como o Next Generation Sequencing (NGS), seguido de análise, eliminando a necessidade de cultivar microrganismos. Métodos de NGS, como a análise do metagenoma, são caros e sofrem de inconvenientes relacionados ao processo deamplificação13. Técnicas de cultivo como a cultura de enriquecimento seletivo14 que visam o isolamento de micróbios degradadores de hidrocarbonetos ainda são úteis, pois permitem aos pesquisadores sondar e manipular vias metabólicas em isolados bacterianos.

O isolamento do DNA genômico e o subsequente sequenciamento do material genômico revelam informações valiosas sobre qualquer organismo. O sequenciamento do genoma completo auxilia na identificação de genes que codificam resistência a antibióticos, potenciais alvos de drogas, fatores de virulência, transportadores, enzimas metabolizadoras de xenobióticos, etc15,16,17. O sequenciamento do gene codificador do 16SrRNA provou ser uma técnica robusta para identificar a filogenia bacteriana. A conservação da sequência e função do gene ao longo dos anos o torna uma ferramenta confiável para identificar bactérias desconhecidas e comparar um isolado com a espécie mais próxima. Além disso, o comprimento desse gene é ótimo para análise de bioinformática18. Todas essas características, juntamente com a facilidade de amplificação de genes usando primers universais e o aprimoramento na tecnologia de sequenciamento gênico, fazem dele um padrão ouro para a identificação de micróbios.

Neste trabalho, descrevemos um procedimento para recuperação de microrganismos cultiváveis com potencial degradador de HC a partir de amostras ambientais. O método descrito a seguir descreve a coleta e identificação de bactérias degradadoras de HC e é dividido em cinco seções: (1) coleta de bactérias de amostras de água, (2) isolamento de culturas puras, (3) exploração da capacidade degradadora de HC de isolados bacterianos, (4) isolamento de DNA genômico e (5) identificação baseada em sequenciamento do gene 16S rRNA e análise BLAST. Este procedimento pode ser adaptado para isolar bactérias para as mais diversas aplicações biotecnológicas.

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Protocolo

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1. Coleta, processamento e análise de amostras

NOTA: Aqui, apresentamos um protocolo para isolar bactérias de habitats aquáticos. Alguns dos isolados podem ser patogênicos, portanto, usar luvas e desinfetar a área de trabalho antes e após o uso.

  1. Coletar 500 mL de amostra de água em cinco garrafas de vidro estéreis de diferentes locais do corpo hídrico. Medir o pH e a temperatura de cada amostra usando um medidor de pH e termômetro, respectivamente.
    NOTA: O protocolo não é específico do local e pode ser facilmente adaptado para isolar organismos de corpos d'água contaminados com hidrocarbonetos também.
  2. Filtrar a amostra num lote de 100 ml através de folhas filtrantes de 0,22 μm de poros, em condições assépticas.
    NOTA: O diâmetro do papel de filtro não deve exceder o diâmetro da placa de Petri. Por exemplo, papel de filtro não superior a 85 mm de diâmetro é ideal para uma placa de Petri de 100-120 mm.
  3. Manter os papéis de filtro sobre diferentes placas de meios nutritivos (PYE19, R2A20, M9, LB, NB, TSB, M6321 e M2G22). Os diferentes tipos de meios de crescimento permitem a seleção e o enriquecimento de diferentes microrganismos. As composições dos diversos meios de crescimento estão listadas na Tabela 1. Use um papel para cada placa de mídia e descasque após 2 h usando pinças estéreis.
  4. Diluir em série as amostras de água não filtrada (106 diluição) em água bidestilada estéril, adicionando 100 μL da amostra de água recolhida em 900 μL de água estéril. Isso resulta em uma diluição de 1:10. Desta amostra, retirar 100 μL e adicionar 900 μL de água estéril para obter uma diluição de 1:100. Repita a diluição até que a dobra de diluição seja de 1:1.000.000. Misture por pipetagem. O volume final de cada diluição será de 1 mL.
  5. Espalhe 100 μL da amostra de água diluída individualmente em todas as placas de meios de crescimento mencionadas na etapa 3 em triplicatas.
  6. Incubar as placas a 30 °C durante 24 a 48 horas, dependendo do crescimento das colónias.
    NOTA: A maioria dos isolados ambientais cresce a uma temperatura ótima de 30 °C. Se isolar as amostras de um ambiente com temperaturas extremas, incubar as placas à mesma temperatura do local de coleta.
  7. Em seguida, escolha as colônias usando um palito estéril ou ponta de pipeta e execute a estria do quadrante para obter colônias isoladas.
  8. Incube as placas durante a noite. No dia seguinte, faça uma triagem das colônias com base em suas características morfológicas, como cor, textura, forma, tamanho, margem, elevação, etc. Restreak as colônias para obter culturas puras.
  9. Realizar coloração de grama de cada cultura pura23 e proceder com o preparo do estoque de glicerol.
  10. Para preparar os estoques de glicerol, inocular uma única colônia em 3 mL de meio de cultura apropriado e incubar a 30 °C. A partir da cultura noturna, tomar 700 μL e adicionar 300 μL de glicerol a 100% (esterilizado por autoclavagem) em criofrascos24. Congelar os frascos para injetáveis a -80 °C para armazenamento a longo prazo.

2. Degradação dos hidrocarbonetos

NOTA: O exemplo abaixo é para filtrar os isolados que podem degradar o estireno. Trata-se de uma ligeira modificação do método adaptado em relatório anterior25. Siga os passos em condições assépticas.

  1. De um prato recém-listrado, colher uma colônia e inocular em 5 mL de caldo de soja Tryptic (TSB)/Caldo nutriente (NB). Cultivar a cultura durante a noite a 30 °C com agitação a 200 rpm até que a absorbância atinja ~2.
    NOTA: Com exceção do TSB/NB, qualquer meio de crescimento pode ser escolhido no qual as bactérias atinjam alta densidade celular.
  2. No dia seguinte, pastilha as células a 2862 x g por 5 min a 4 °C e descarte o sobrenadante.
  3. Lavar o pellet duas vezes com 2 mL de solução salina autoclavada (NaCl 0,9%) e girar a 2862 x g por 5 min a 4 °C.
    OBS: O soro fisiológico é isotônico e, portanto, mantém a pressão osmótica no interior das células bacterianas.
  4. Ressuspender o pellet em 2 mL de meio basal líquido livre de carbono (MBCFCL). Medir a absorbância (OD600).
  5. Levar dois frascos Erlenmeyer estéreis com capacidade de 150 mL para controle e grupo experimental. Rotule-os como A e B.
  6. No grupo não inoculado/controle (frasco A), adicionar 40 mL de MBCFC e estireno (5 mM).
  7. No balão B, adicionar 35 mL de LCFBM e estireno (ajustar a concentração final de estireno para 5 mM). Adicionar a suspensão celular com um OD final de600 células ≈ 0,1 e completar o volume restante com LCFBM até 40 mL. Incubar os frascos a 30 °C com agitação a 200 rpm durante 30 dias.
    NOTA: Hidrocarbonetos em excesso podem ser tóxicos para os micróbios, portanto, comece com baixa concentração e aumente-a gradualmente.
  8. Repita o acima para cada cepa adicional que deve ser avaliada quanto à degradação de hidrocarbonetos.
  9. Medir o OD600 de cada frasco a cada 5 dias e traçar uma curva de crescimento. Aumente a incubação até 45 dias se as bactérias puderem utilizar estireno. Um aumento no OD600 indica que a bactéria pode metabolizar estireno.

3. Triagem da degradação de catecol por isolados bacterianos

NOTA: A degradação de hidrocarbonetos aromáticos como estireno, benzeno, xileno, naftaleno, fenóis, etc. produzem catecóis como intermediários de reação. Os catecóis são posteriormente metabolizados por bactérias com a ajuda das enzimas catecol 1,2-dioxigenase e catecol 2,3-dioxigenase através das vias de ortoclivagem e metaclivagem, respectivamente26. Essas enzimas também estão envolvidas na degradação de outros hidrocarbonetos, como o clorobenzeno27. O protocolo citado abaixo utiliza o lisado de células inteiras para o ensaio da enzima catecol 2, 3-dioxigenase28. O mesmo método de lise pode ser usado para rastrear a atividade da catecol 1, 2-dioxigenase. No entanto, a composição da mistura de reação irá variar. Ambas as enzimas são induzíveis na natureza e podem ser induzidas pela adição de fenol aos meios de crescimento.

  1. Com a ajuda de uma alça estéril, inocular a colônia bacteriana de uma placa recém-riscada em meio de sais minerais (MSM) suplementado com fenol 1-4 mM. Incubar a cultura a 30 °C e 200 rpm. Colher a cultura a 4 °C quando OD600 atingir entre 1,4-1,6 (ou seja, em fase exponencial tardia) girando a 4500 x g por 20 min.
  2. Lavar o pellet celular com tampão fosfato (0,5 M, pH 7,5).
  3. Ressuspender as células no tampão fosfato acima mencionado e ajustar o OD600 final ≈ 1.0.
  4. Lisar as células por sonicação pulsada por 1,5 min, sendo a duração de cada pulso de 15 s. Após essa etapa, a suspensão deve estar clara ou menos turva. Caso contrário, aumente o número de pulsos e verifique se a suspensão está limpa. Após cada pulso, mantenha a amostra no gelo para evitar a degradação da proteína.
  5. Remover os restos celulares e as células intactas por centrifugação a 9.000 x g por 30 min, mantendo a temperatura fria (4 °C).
  6. Pipetar cuidadosamente o sobrenadante transparente. Esta fração tem o extrato bruto para ensaio enzimático.
  7. Determinar a concentração proteica do extrato bruto pelo método de Bradford ou Lowry29,30.
  8. Para determinar a atividade da catecol 2,3-dioxigenase, medir a formação do produto final da reação (2-hidroximucônico semialdeído) por um espectrofotômetro.
  9. Preparar a mistura de reacção adicionando 20 μL de catecol (50 mM), 960 μL de tampão fosfato (50 mM, pH 7,5) e 20 μL do extracto bruto.
  10. Para o controle negativo, substituir o extrato bruto por tampão fosfato e ajustar o volume final para 1 mL.
  11. Incubar a mistura de reação por 30 min. Em intervalos de tempo definidos, medir a absorbância a 375 nm. Um aumento na absorbância indica a formação do produto final da reação, o ácido 2-hidroximucônico semialdeído (2-HMS). Realizar o experimento em triplicatas.
    NOTA: O catecol é sensível à luz e ao oxigênio. Conservar a mistura de reacção no escuro e fechar bem os tubos para evitar a degradação natural do catecol.

4. Isolamento do DNA genômico da cultura pura

NOTA: Este é o protocolo geral para o isolamento de DNA genômico. A coloração de Gram foi realizada durante a etapa de coleta, processamento e análise das amostras. Devido à variação na espessura da parede celular de bactérias gram-positivas e gram-negativas, o método de lise celular é modificado de acordo. Use luvas ao isolar e desinfete a bancada com etanol 70% para evitar que as nucleases degradem o DNA. Alguns dos produtos químicos mencionados abaixo podem causar queimaduras graves na pele e o cuidado adequado deve ser tomado ao manuseá-los.

  1. Isolamento de DNA genômico de bactérias Gram-negativas31.
    1. Escolher uma única colônia e inocular em um meio de crescimento fresco em tubos de ensaio estéreis.
    2. Coloque os tubos num agitador de incubadora a 200 rpm e deixe que as bactérias cresçam durante a noite a 30 °C.
    3. No dia seguinte, pellet 1,5 mL de cultura cultivada durante a noite a 12.400 x g por 3 min.
    4. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 200 μL de tampão de lise (40 mM Tris-acetato, pH 7,8, 20 mM acetato de sódio, 1 mM EDTA, 1% SDS).
    5. Adicionar 66 μL de solução de NaCl (5 M) e misturar bem.
    6. Pellet da mistura resultante a 12.400 x g durante 10 min (4 °C).
    7. Pipetar o sobrenadante límpido num tubo de microcentrífuga fresco e adicionar um volume igual de clorofórmio.
    8. Inverter a misturar a solução várias vezes até observar uma solução leitosa.
    9. Gire a 12.400 x g durante 3 minutos e transfira o sobrenadante para um frasco para injetáveis limpo.
    10. Adicionar 1 mL de etanol 100% gelado; misturar por inversão até que as fitas brancas de DNA se precipitem.
    11. Centrifugar o ADN precipitado a 2.200 x g durante 10 min a 4 °C e eliminar o sobrenadante.
    12. Lavar o pellet de DNA com 1 mL de etanol 70% e deixar o pellet de DNA secar por 5 min à temperatura ambiente.
    13. Depois de seco, ressuspenda o pellet em 100 μL de tampão 1x Tris-EDTA(TE) e armazene o DNA a -20 °C.
    14. Medir a concentração (A260/280) usando espectrofotômetro e executar o DNA em gel de agarose (1%) para avaliar a qualidade do DNA24.
  2. Isolamento de DNA genômico de cepa gram-positiva32
    1. Escolher uma única colônia e inocular em meio de crescimento fresco em tubos de ensaio estéreis.
    2. Coloque os tubos em um agitador de incubadora a 200 rpm e deixe as bactérias crescerem durante a noite a uma temperatura de crescimento adequada.
    3. No dia seguinte, tomar 1,5 mL da cultura cultivada e centrifugar a 8.600 x g por 5 min.
    4. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células no tampão TE.
    5. Ajustar o OD600 = 1,0 com tampão TE e transferir 740 μL da suspensão celular para um tubo de microfuga limpo.
    6. Adicionar 20 μL de lisozima (caldo de 100 mg/mL) e misturar bem por pipetagem. Incubar a 37 °C durante 30 minutos (em banho seco).
    7. Adicione 40 μL de 10% de SDS e misture bem.
    8. Adicionar 8 μL de Proteinase K (10 mg/mL). Misture bem e incube a 56 °C por 1-3 h (em banho seco). A suspensão deve ficar clara agora com o aumento da viscosidade, marcando a lise celular eficiente.
      NOTA: A suspensão pode ser deixada durante a noite se as células não forem lisadas corretamente.
    9. Pré-aqueça a mistura CTAB/NaCl a 65 °C (em banho seco) e adicione 100 μL desta mistura à suspensão celular. Misture bem.
    10. Incubar a 65 °C durante 10 minutos (em banho seco).
    11. Adicione 500 μL de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) e misture bem. Gire a 16.900 x g por 10 min a 25 °C.
    12. Transfira a fase aquosa para um tubo de microcentrífuga fresco evitando a fase orgânica (fase viscosa no fundo).
    13. Adicione cuidadosamente 500 μL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) e misture bem. Gire a 16.900 x g por 10 min a 25 °C.
    14. Tome a fase aquosa em um tubo de microcentrífuga fresco. Adicione 500 μL de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) e misture bem.
    15. Transferir a fase aquosa e adicionar 0,6 volume de isopropanol (pré-resfriado a -20 °C).
    16. As fitas de ADN precipitadas devem ser visíveis na forma de rosca. Incubar a -20 °C durante 2 h durante a noite.
    17. Centrifugar a 16.900 x g por 15 min a 4 °C para pellet o DNA.
    18. Decantar cuidadosamente o isopropanol e lavar o pellet com 1 mL de etanol 70% frio (pré-resfriado a -20 °C) para remover quaisquer impurezas.
    19. Centrifugar a 16.900 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
    20. Deixe o pellet secar à temperatura ambiente durante 20 min ou mantenha o tubo a 37 °C. Certifique-se de que o pellet não está excessivamente seco.
    21. Ressuspender em 100 μL de tampão 1x TE e armazenar o DNA a -20 °C.
      NOTA: Se o pellet ficar excessivamente seco e for difícil de ressuspender, incube o tubo de microcentrífuga com pellet de DNA e água livre de nuclease a 37 °C por 15-20 min e ressuspenda novamente por pipetagem.
    22. Medir a concentração (A260/280) em espectrofotômetro após diluição de 1:100 em tampão TE 1x e executar o DNA em gel de agarose (1%) para avaliar a qualidade do DNA24.

5. Sequenciamento do 16S rRNA

NOTA: O protocolo descrito abaixo é para amplificação e sequenciamento do 16S rRNA para identificação bacteriana. Informações derivadas da sequência 16S rRNA são usadas para a identificação de um organismo desconhecido e para encontrar a relação entre diferentes organismos.

  1. Para identificar as cepas, amplificar o DNA isolado das culturas bacterianas puras por PCR com primers universais direcionados à sequência 16S rRNA para bactérias: 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') e 1492R (5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')33.
  2. Preparar a mistura de PCR (reações de 25 μL) em gelo com 18 μL de água autoclavada/livre de nuclease, 2,5 μL de tampão 10x, 0,5 μL de primers forward e reverse (100 μM stock), 2 μL da mistura dNTPs (100 μM stock), 1 μL de DNA template (2-15 ng/μL) e 1 U de Taq Polymerase.
  3. Use as seguintes condições de ciclagem para amplificação do gene 16S rRNA: Desnaturação inicial a 94 °C por 10 min (desnaturação final a 94 °C por 40 s, recozimento do primer a 56 °C por 1 min, extensão a 74 °C por 2 min) x 30 ciclos, extensão final a 74 °C por 10 min.
  4. Após o término do ciclo, misturar 5 μL de amostra e 1 μL de corante de carga de DNA 5x. Executar em gel de agarose a 1% para verificar a amplificação. Conservar os produtos de PCR a 4 °C a curto prazo ou congelá-los a -20 °C até nova utilização.
  5. Para o sequenciamento do gene 16S rRNA, configurar a mesma reação mencionada acima para maior volume (100 μL).
  6. Purificar os amplicons para sequenciamento de Sanger24,34 usando o kit de purificação do produto PCR ou misturar toda a amostra com corante de carga de DNA e carregar em um gel de agarose para executar o método de extração em gel.
  7. Feito o sequenciamento, converta o arquivo de resultados no formato FASTA e verifique a similaridade da sequência com a ferramenta básica de busca de alinhamento local (BLAST) no NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)35.

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Resultados

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O esquema delineando todo o procedimento de isolamento e triagem de bactérias de habitats aquáticos e sua posterior identificação pela análise do 16S rRNA está representado na Figura 1. Amostras de água de uma área úmida em Dadri, Índia, foram coletadas em garrafas de vidro estéreis e imediatamente levadas ao laboratório para processamento. As amostras foram passadas através de folhas filtrantes com poros de 0,22 μm, e os papéis de filtro foram mantidos em contato com difere...

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Discussão

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Está bem estabelecido que apenas aproximadamente 1% das bactérias na Terra pode ser facilmente cultivada em laboratório6. Mesmo entre as bactérias cultiváveis, muitas permanecem descaracterizadas. Melhorias nos métodos moleculares deram uma nova dimensão à análise e avaliação das comunidades bacterianas. No entanto, tais técnicas apresentam limitações, mas não tornam redundantes as análises de cultura. Técnicas de cultivo puro para isolar espécies bacterianas individuais permanecem como o principa...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos ao Dr. Karthik Krishnan e aos membros do laboratório RP por seus comentários e sugestões úteis. O DS é apoiado pela SNU-Doctoral fellowship e Earthwatch Institute India Fellowship. O laboratório RP é apoiado por uma bolsa CSIR-EMR e fundos de start-up da Universidade Shiv Nadar.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AgaroseSigma-AldrichA4718Eletroforese em gel
Cloreto de amônio (NH4Cl)Sigma-AldrichA9434Componente do meio de crescimento
Sulfato de amônioSigma-AldrichA4418Componente do meio de crescimento
Bacto-AgarMillipore1016141000Preparação de meios sólidos
Cloreto de cálcio (CaCl2)MERCKC4901-500GComponente do meio de crescimento
CatecolSigma-Aldrich135011Ensaio de degradação de hidrocarbonetos
Brometo de cetiltrimetilamônio, CTABSigma-AldrichH6269Isolamento de DNA genômico
ClorofórmioHIMEDIAMB109Isolamento de DNA genômico
Fosfato dissódico (Na2HPO4)Sigma-AldrichS5136Componente do meio de crescimento
EDTASigma-AldrichE9884componente tampão gDNA
Sulfato ferroso, heptahidratado (FeSO4.7H20)Sigma-Aldrich215422Componente do meio de crescimento
GlicoseSigma-AldrichG7021Componente do meio de crescimento
GlicerolSigma-AldrichG5516Componente de meio de crescimento; Estoques de glicerol
IsopropanolHIMEDIAMB063Isolamento de DNA genômico
LB AgarDifco244520Meio
de crescimento Luria-Bertani (LB)Difco244620Meio de crescimento
Sulfato de magnésio (MgSO4)MERCKM2643Componente
do meio de crescimentoSulfato de manganês (II) monohidratado (MnSO4. H20)Sigma-Aldrich221287Componente do meio de crescimento
Caldo de nutrientes (NB)Merck (Millipore)03856-500GMeio de crescimento
PeptonaMerck91249-500GComponente do meio de crescimento
FenolSigma-AldrichP1037Isolamento de DNA genômico
Fosfato de potássio, dibásico (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786Componente do meio de crescimento
Fosfato de potássio, monobásico (KH2PO4)Sigma-AldrichP9791Componente do meio de crescimento
Proteinase KThermoFisher ScientificAM2546Isolamento de DNA genômico
QIAquick Kit de extração de gelQIAGEN160016235DNA purificação
QIAquick PCR Kit de purificaçãoQIAGEN163038783Purificação de DNA
R2A ÁgarMillipore1004160500Meio de crescimento
Espectrofotômetro SmartSpec PlusBIO-RAD4006221Medição de absorbância
Acetato de sódioSigma-AldrichS2889Isolamento de DNA genômico
Cloreto de sódio (NaCl)Sigma-AldrichS9888Componente do meio de crescimento
Dodecil sulfato de sódio (SDS)Sigma-AldrichL3771Isolamento de DNA genômico
EstirenoSigma-AldrichS4972Biodegradação
de estireno Taq DNA PolimeraseNEBM0273X16s rRNA PCR
Tris-EDTA (TE)Sigma-Aldrich93283Ressuspensão de DNA
Caldo de soja tríptico (TSB)Merck22092-500GMeio
crescimento Extrato de leveduraSigma-AldrichY1625-1KGComponente do meio de crescimento
Sulfato de zinco heptahidratado (ZnSO4.7H20)Sigma-Aldrich221376Componente do meio de crescimento
genômico de

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
  2. Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environment. 707, 135578(2020).
  3. Siddiqa, A., Faisal, M. Microbial degradation of organic pollutants using indigenous bacterial strains. Handbook of Bioremediation. , 625-637 (2021).
  4. Hossain, F., et al. Bioremediation potential of hydrocarbon degrading bacteria: isolation, characterization, and assessment. Saudi Journal of Biological Sciences. , (2021).
  5. Wongbunmak, A., Khiawjan, S., Suphantharika, M., Pongtharangkul, T. BTEX biodegradation by Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum W1 and its proposed BTEX biodegradation pathways. Scientific Reports. 10 (1), 17408(2020).
  6. Bodor, A., et al. Challenges of unculturable bacteria: environmental perspectives. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19 (1), 1-22 (2020).
  7. Phale, P. S., Sharma, A., Gautam, K. Microbial degradation of xenobiotics like aromatic pollutants from the terrestrial environments. Pharmaceuticals and Personal Care Products: Waste Management and Treatment Technology. , 259-278 (2019).
  8. Brooijmans, R. J. W., Pastink, M. I., Siezen, R. J. Hydrocarbon-degrading bacteria: the oil-spill clean-up crew. Microbial Biotechnology. 2 (6), 587-594 (2009).
  9. Sorkhoh, N. A., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Stretton, R. J., Radwan, S. S. Crude oil and hydrocarbon-degrading strains of Rhodococcus rhodochrous isolated from soil and marine environments in Kuwait. Environmental Pollution. 65 (1), 1-17 (1990).
  10. Chaillan, F., et al. Identification and biodegradation potential of tropical aerobic hydrocarbon-degrading microorganisms. Research in Microbiology. 155 (7), 587-595 (2004).
  11. Bôto, M. L., et al. Harnessing the potential of native microbial communities for bioremediation of oil spills in the Iberian Peninsula NW coast. Frontiers in Microbiology. 12, 879(2021).
  12. Wang, Y., et al. A culture-independent approach to unravel uncultured bacteria and functional genes in a complex microbial community. PloS One. 7 (10), 47530(2012).
  13. Jovel, J., et al. Characterization of the gut microbiome using 16S or shotgun metagenomics. Frontiers in Microbiology. 7, 459(2016).
  14. Spini, G., et al. Molecular and microbiological insights on the enrichment procedures for the isolation of petroleum degrading bacteria and fungi. Frontiers in Microbiology. 0, 2543(2018).
  15. Pightling, A. W., et al. Interpreting whole-genome sequence analyses of foodborne bacteria for regulatory applications and outbreak investigations. Frontiers in Microbiology. , 1482(2018).
  16. Salipante, S. J., et al. Application of whole-genome sequencing for bacterial strain typing in molecular epidemiology. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1072-1079 (2015).
  17. Lovley, D. R. Cleaning up with genomics: applying molecular biology to bioremediation. Nature Reviews Microbiology. 1 (1), 35-44 (2003).
  18. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
  19. Poindexter, J. S. Biological properties and classification of the Caulobacter group. Bacteriological Reviews. 28 (3), 231-295 (1964).
  20. Reasoner, D. J., Geldreich, E. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (1), 1-7 (1985).
  21. Pardee, A. B. The genetic control and cytoplasmic expression of “Inducibility” in the synthesis of β-galactosidase by E. coli. Journal of Molecular Biology. 1 (2), 165-178 (1959).
  22. Ely, B. Genetics of Caulobacter crescentus. Methods in Enzymology. 204, 372-384 (1991).
  23. R, C. Gram staining. Current Protocols in Microbiology. , Appendix 3 (2005).
  24. Green, M. R., Hughes, H., Sambrook, J., MacCallum, P. Molecular cloning: a laboratory manual. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 1890(2012).
  25. Chauhan, D., Agrawal, G., Deshmukh, S., Roy, S. S., Priyadarshini, R. Biofilm formation by Exiguobacterium sp. DR11 and DR14 alter polystyrene surface properties and initiate biodegradation. RSC Advances. 8 (66), 37590-37599 (2018).
  26. Takeo, M., Nishimura, M., Shirai, M., Takahashi, H., Negoro, S. Purification and characterization of catechol 2,3-Dioxygenase from the aniline degradation pathway of Acinetobacter sp. YAA and its mutant enzyme, which resists substrate inhibition. Bioscience, Biotechnology, Biochemistry. 71, 70079-70080 (2007).
  27. Nguyen, O. T., Ha, D. D. Degradation of chlorotoluenes and chlorobenzenes by the dual-species biofilm of Comamonas testosteroni strain KT5 and Bacillus subtilis strain DKT. Annals of Microbiology. 69 (3), 267-277 (2019).
  28. Hupert-Kocurek, K., Guzik, U., Wojcieszyńska, D. Characterization of catechol 2, 3-dioxygenase from Planococcus sp. strain S5 induced by high phenol concentration. Acta Biochimica Polonica. 59 (3), (2012).
  29. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  30. Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
  31. Chen, W. P., Kuo, T. T. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Research. 21 (9), 2260(1993).
  32. William, S., Feil, H., Copeland, A. Bacterial genomic DNA isolation using CTAB. Sigma. 50 (6876), (2012).
  33. Frank, J. A., et al. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology. 74 (8), 2461-2470 (2008).
  34. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  35. Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 5-9 (2008).
  36. Harayama, S., Rekik, M. Bacterial aromatic ring-cleavage enzymes are classified into two different gene families. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15328-15333 (1989).
  37. Li, X., et al. Efficiency of chemical versus mechanical disruption methods of DNA extraction for the identification of oral Gram-positive and Gram-negative bacteria. The Journal of International Medical Research. 48 (5), 300060520925594(2020).
  38. Coico, R. Gram staining. Current Protocols in Microbiology. , Appendix 3 (2005).
  39. Clarridge, J. E. III Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clinical Microbiology Reviews. 17 (4), 840(2004).
  40. Dereeper, A., et al. Phylogeny. fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 465-469 (2008).
  41. Wadowsky, R. M., Wolford, R., McNamara, A. M., Yee, R. B. Effect of temperature, pH, and oxygen level on the multiplication of naturally occurring Legionella pneumophila in potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (5), 1197-1205 (1985).
  42. du Toit, W. J., Pretorius, I. S., Lonvaud-Funel, A. The effect of sulphur dioxide and oxygen on the viability and culturability of a strain of Acetobacter pasteurianus and a strain of Brettanomyces bruxellensis isolated from wine. Journal of Applied Microbiology. 98 (4), 862-871 (2005).
  43. Johnson, J. S., et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  44. Kim, E., et al. Design of PCR assays to specifically detect and identify 37 Lactobacillus species in a single 96 well plate. BMC Microbiology. 20 (1), 1-14 (2020).
  45. Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and limitations of 16S rRNA gene amplicon sequencing in revealing temporal microbial community dynamics. PLoS ONE. 9 (4), (2014).
  46. Johnson, B. H., Hecht, M. H. Recombinant proteins can be isolated from E. coli cells by repeated cycles of freezing and thawing. Bio/Technology. 12 (12), 1357-1360 (1994).
  47. Rodríguez-Carmona, E., Cano-Garrido, O., Seras-Franzoso, J., Villaverde, A., García-Fruitós, E. Isolation of cell-free bacterial inclusion bodies. Microbial Cell Factories. 9 (1), 71(2010).
  48. Hoiczyk, E., Hansel, A. Cyanobacterial cell walls: News from an unusual prokaryotic envelope. Journal of Bacteriology. 182 (5), 1191(2000).
  49. Erstad, S. M., Sakuragi, Y. Easy and efficient permeabilization of cyanobacteria for in vivo enzyme assays using B-PER. Bio-Protocol. 8 (1), (2018).

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