Apresentamos o processo de isolamento, propagação e caracterização de bactérias degradadoras de hidrocarbonetos de habitats aquáticos. O protocolo descreve o isolamento bacteriano, a identificação pelo método 16S rRNA e o teste de seu potencial degradador de hidrocarbonetos. Este artigo ajudará os pesquisadores na caracterização da biodiversidade microbiana em amostras ambientais e, especificamente, na triagem de micróbios com potencial de biorremediação.
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Artigo de método
Isolamento, Propagação e Identificação de Espécies Bacterianas com Propriedades Metabolizadoras de Hidrocarbonetos de Habitats Aquáticos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os hidrocarbonetos poluentes são recalcitrantes à degradação e seu acúmulo no meio ambiente é tóxico para todas as formas de vida. As bactérias codificam numerosas enzimas catalíticas e são naturalmente capazes de metabolizar hidrocarbonetos. Os cientistas aproveitam a biodiversidade nos ecossistemas aquáticos para isolar bactérias com potencial de biodegradação e biorremediação. Tais isolados do ambiente fornecem um rico conjunto de vias metabólicas e enzimas, que podem ser posteriormente utilizadas para escalar o processo de degradação em escala industrial. Neste artigo, descrevemos o processo geral de isolamento, propagação e identificação de espécies bacterianas de habitats aquáticos e selecionamos sua capacidade de utilizar hidrocarbonetos como única fonte de carbono in vitro usando técnicas simples. O presente protocolo descreve o isolamento de várias espécies bacterianas e sua posterior identificação utilizando a análise do 16S rRNA. O protocolo também apresenta etapas para a caracterização do potencial degradador de hidrocarbonetos de isolados bacterianos. Este protocolo será útil para pesquisadores que tentam isolar espécies bacterianas de habitats ambientais para suas aplicações biotecnológicas.
Introdução
Os hidrocarbonetos (HC) são amplamente utilizados tanto como combustíveis quanto em aplicações químicas. Hidrocarbonetos aromáticos como benzeno, tolueno e xileno são amplamente utilizados como solventes1. Alcenos como etileno e propileno servem como precursores na síntese de polímeros de polietileno e polipropileno, respectivamente. Polimerização de outro hidrocarboneto, estireno forma poliestireno. As atividades antrópicas introduzem hidrocarbonetos no meio ambiente durante sua produção e transporte. A contaminação do solo e da água por hidrocarbonetos preocupa seriamente o ambiente e a saúde humana. Os micróbios desempenham um papel importan....
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Protocolo
1. Coleta, processamento e análise de amostras
NOTA: Aqui, apresentamos um protocolo para isolar bactérias de habitats aquáticos. Alguns dos isolados podem ser patogênicos, portanto, usar luvas e desinfetar a área de trabalho antes e após o uso.
- Coletar 500 mL de amostra de água em cinco garrafas de vidro estéreis de diferentes locais do corpo hídrico. Medir o pH e a temperatura de cada amostra usando um medidor de pH e termômetro, respectivamente.
NOTA: O protocolo não é específico do local e pode ser facilmente adaptado para isolar organismos de corpos d'água contaminados com hidrocarbonetos também.
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Resultados
O esquema delineando todo o procedimento de isolamento e triagem de bactérias de habitats aquáticos e sua posterior identificação pela análise do 16S rRNA está representado na Figura 1. Amostras de água de uma área úmida em Dadri, Índia, foram coletadas em garrafas de vidro estéreis e imediatamente levadas ao laboratório para processamento. As amostras foram passadas através de folhas filtrantes com poros de 0,22 μm, e os papéis de filtro foram mantidos em contato com difere.......
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Discussão
Está bem estabelecido que apenas aproximadamente 1% das bactérias na Terra pode ser facilmente cultivada em laboratório6. Mesmo entre as bactérias cultiváveis, muitas permanecem descaracterizadas. Melhorias nos métodos moleculares deram uma nova dimensão à análise e avaliação das comunidades bacterianas. No entanto, tais técnicas apresentam limitações, mas não tornam redundantes as análises de cultura. Técnicas de cultivo puro para isolar espécies bacterianas individuais permanecem como o principa.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Karthik Krishnan e aos membros do laboratório RP por seus comentários e sugestões úteis. O DS é apoiado pela SNU-Doctoral fellowship e Earthwatch Institute India Fellowship. O laboratório RP é apoiado por uma bolsa CSIR-EMR e fundos de start-up da Universidade Shiv Nadar.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Eletroforese em gel |
| Cloreto de amônio (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Componente do meio de crescimento |
| Sulfato de amônio | Sigma-Aldrich | A4418 | Componente do meio de crescimento |
| Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Preparação de meios sólidos |
| Cloreto de cálcio (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Componente do meio de crescimento |
| Catecol | Sigma-Aldrich | 135011 | Ensaio de degradação de hidrocarbonetos |
| Brometo de cetiltrimetilamônio, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Isolamento de DNA genômico |
| Clorofórmio | HIMEDIA | MB109 | Isolamento de DNA genômico |
| Fosfato dissódico (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Componente do meio de crescimento |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | componente tampão gDNA |
| Sulfato ferroso, heptahidratado (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Componente do meio de crescimento |
| Glicose | Sigma-Aldrich | G7021 | Componente do meio de crescimento |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Componente de meio de crescimento; Estoques de glicerol |
| Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Isolamento de DNA genômico |
| LB Agar | Difco | 244520 | Meio |
| de crescimento Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Meio de crescimento |
| Sulfato de magnésio (MgSO4) | MERCK | M2643 | Componente |
| do meio de crescimentoSulfato de manganês (II) monohidratado (MnSO4. H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Componente do meio de crescimento |
| Caldo de nutrientes (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Meio de crescimento |
| Peptona | Merck | 91249-500G | Componente do meio de crescimento |
| Fenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Isolamento de DNA genômico |
| Fosfato de potássio, dibásico (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Componente do meio de crescimento |
| Fosfato de potássio, monobásico (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Componente do meio de crescimento |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Isolamento de DNA genômico |
| QIAquick Kit de extração de gel | QIAGEN | 160016235 | DNA purificação |
| QIAquick PCR Kit de purificação | QIAGEN | 163038783 | Purificação de DNA |
| R2A Ágar | Millipore | 1004160500 | Meio de crescimento |
| Espectrofotômetro SmartSpec Plus | BIO-RAD | 4006221 | Medição de absorbância |
| Acetato de sódio | Sigma-Aldrich | S2889 | Isolamento de DNA genômico |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Componente do meio de crescimento |
| Dodecil sulfato de sódio (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Isolamento de DNA genômico |
| Estireno | Sigma-Aldrich | S4972 | Biodegradação |
| de estireno Taq DNA Polimerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Ressuspensão de DNA |
| Caldo de soja tríptico (TSB) | Merck | 22092-500G | Meio |
| crescimento Extrato de levedura | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Componente do meio de crescimento |
| Sulfato de zinco heptahidratado (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Componente do meio de crescimento |
Referências
- Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
- Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environme....
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Reimpressões e permissões
