Apresentamos um protocolo para determinar a quiralidade multicelular in vitro, utilizando a técnica de micropatterning. Este ensaio permite quantificação automática dos vieses esquerdo-direito de vários tipos de células e pode ser usado para fins de triagem.
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Artigo de método
Um ensaio de micropatterning para medir a quiralidade celular
Neste artigo
Resumo
Resumo
A quiralidade é uma propriedade celular intrínseca, que retrata a assimetria em termos de polarização ao longo do eixo esquerda-direita da célula. Como essa propriedade única atrai cada vez mais atenção devido aos seus importantes papéis no desenvolvimento e na doença, um método padronizado de quantificação para caracterizar a quiralidade celular avançaria na pesquisa e em aplicações potenciais. Neste protocolo, descrevemos um ensaio de caracterização de quiralidade multicelular que utiliza matrizes micropattered de células. Micropatterns celulares são fabricados em lâminas de vidro revestidas de titânio/ouro por impressão de microcontatos. Após a semeadura na direção geométrica definida (por exemplo, em forma de anel), ilhas revestidas de proteínas, as células migram direcionalmente e formam um alinhamento tendencioso em direção ao sentido horário ou ao sentido anti-horário, que pode ser automaticamente analisado e quantificado por um programa MATLAB escrito sob medida. Aqui descrevemos em detalhes a fabricação de substratos micropatterados, semeadura celular, coleta de imagens e análise de dados e mostramos resultados representativos obtidos usando as células NIH/3T3. Este protocolo já foi validado anteriormente em vários estudos publicados e é uma ferramenta eficiente e confiável para estudar a quiralidade celular in vitro.
Introdução
A assimetria esquerda-direita (LR) da célula, também conhecida como mão celular ou quiralidade, descreve a polaridade celular no eixo LR e é reconhecida como uma propriedade fundamental, conservada, biofísica 1,2,3,4,5. A quiralidade celular tem sido observada tanto in vivo quanto in vitro em múltiplas escalas. Achados anteriores revelaram o redemoinho quiral de citesqueleto de actina em células únicas semeadas em ilhas circulares6, migração tendenciosa e alinhament....
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Protocolo
1. Fabricação de selos de polidimetilsiloxano (PDMS)16
- Desenhe uma matriz de anéis de microescala usando o software CAD, com um diâmetro interno de 250 μm e um diâmetro externo de 450 μm. O padrão usado neste protocolo é uma matriz 10 x 10 com uma distância de 850 μm entre os anéis.
- Imprima uma máscara de transparência do padrão na resolução desejada usando o serviço de impressão de máscaras de uma empresa de microfabização (ver Tabela de Materiais).
NOTA: As dimensões fornecidas do anel foram comprovadamente funcionas para muitos tiposde células 7. - Realizar fotolitografi....
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Resultados
Quinze minutos após a semeadura das células NIH/3T3, a adesão celular no padrão do anel foi confirmada visualmente por imagens de contraste de fase. Após a cultura subsequente de 24 h, as células nos padrões tornaram-se confluentes e alongadas com alinhamentos claramente assimétricos, tendenciosos em direção à direção do sentido horário (Figura 2). A migração direcional de células anexadas é registrada por imagens de lapso de tempo, motilidade celular e morfogênese podem ser quantificadas co.......
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Discussão
O ensaio de padronização em forma de anel descrito aqui fornece uma ferramenta fácil de usar para caracterização quantitativa da quiralidade multicelular, capaz de produzir resultados altamente confiáveis e repetíveis. A geração rápida de microambientes definidos idênticos e análises imparcial permite o processamento automatizado de alto rendimento de grandes tamanhos de amostras. Este protocolo discute a fabricação dos micropatterns do anel, padronização celular e análise automática do alinhamento celular tendencioso e .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (OD/NICHD DP2HD083961 e NHBLI R01HL148104). Leo Q. Wan é um Estudioso de Ciências Biomédicas (PEW 00026185), apoiado pela Pew Charitable Trusts. Haokang Zhang é apoiado pela American Heart Association Predoctoral Fellowship (20PRE35210243).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Koptec | DSP-MD-43 | de etanol de 200 provas | |
| Keyence | BZX-600 | ||
| Meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM), glicose alta | Gibco | 11965092 | |
| Evaporador de feixe de elétrons | Temscal | BJD-1800 | Revestimento de filme de ouro-titânio |
| Soro bovino fetal | VWR | 89510-186 | |
| Fibronectina do microscópio de | Sigma | F1141-5MG | |
| lâminas de microscópio | VWR | 10024-048 | |
| Pinças de vidro | Exelta | 390BSAPI | |
| Pellets de evaporação de ouro | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS- (CH2) 11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| células NIH / 3T3 | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI alinhador de contato | OAI | 200 | Fotolitografia UV |
| Octadecanethiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Agitador orbital | VWR | 89032-088 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Produto de pesquisa internacional | P32080-100T | |
| Polidimetilsiloxano Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Wafer | de silício Universidade Wafer | ID # 809 | |
| Piruvato de sódio | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 fotorresistente | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Pellets de evaporação de titânio | International Advanced Materiais | TI14 | |
| Máscara de transparência (com recurso) | Outputicity.com | N/A | Serviço de impressão de máscara |
| Tripsina-EDTA (0,25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
Referências
- Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413(2016).
- Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q.
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Reimpressões e permissões
