Method Article

Classificação do estado de ativação de células-tronco neurais in vitro usando autofluorescência

DOI:

10.3791/63110

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April 12th, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, University of Wisconsin-Madison, 2Morgridge Institute for Research, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve estratégias para identificar e enriquecer o estado celular em culturas primárias de células-tronco neurais de camundongos adultos por imagem de autofluorescência usando i) um microscópio confocal, ii) um classificador de células ativadas fluorescentes para realizar imagens de intensidade ou iii) um microscópio multifotônico para realizar imagens de fluorescência ao longo da vida.

Abstract

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As células-tronco neurais (NSCs) se dividem e produzem neurônios recém-nascidos no cérebro adulto por meio de um processo chamado neurogênese adulta. Os NSCs adultos são principalmente quiescentes, um estado celular reversível em que saíram do ciclo celular (G0), mas permanecem responsivos ao ambiente. Na primeira etapa da neurogênese adulta, as NSCs quiescentes (qNSCs) recebem um sinal e são ativadas, saindo da quiescência e reentrando no ciclo celular. Assim, entender os reguladores da quiescência e saída da quiescência do NSC é fundamental para futuras estratégias direcionadas à neurogênese adulta. No entanto, nossa compreensão da quiescência do NSC é limitada por restrições técnicas na identificação de NSCs quiescentes (qNSCs) e NSCs ativados (aNSCs). Este protocolo descreve uma nova abordagem para identificar e enriquecer qNSCs e aNSCs gerados em culturas in vitro por imagem de autofluorescência NSC. Primeiro, este protocolo descreve como usar um microscópio confocal para identificar marcadores autofluorescentes de qNSCs e aNSCs para classificar o estado de ativação do NSC usando a intensidade de autofluorescência. Em segundo lugar, este protocolo descreve como usar um classificador de células ativadas fluorescentes (FACS) para classificar o estado de ativação do NSC e enriquecer amostras para qNSCs ou aNSCs usando intensidade de autofluorescência. Em terceiro lugar, este protocolo descreve como usar um microscópio multifotônico para realizar imagens de tempo de vida de fluorescência (FLIM) em resolução de célula única, classificar o estado de ativação do NSC e rastrear a dinâmica da saída quiescente usando intensidades de autofluorescência e tempos de vida de fluorescência. Assim, este protocolo fornece um kit de ferramentas de resolução de célula única, sem rótulos e de célula viva para estudar a quiescência e a saída de quiescência do NSC.

Introduction

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As NSCs criam neurônios recém-nascidos ao longo da vida em muitos organismos em um processo conhecido como neurogênese adulta 1,2. Para produzir neurônios recém-nascidos, um qNSC primeiro deve ser ativado, entrando no ciclo celular para expandir a população e produzir progenitores neurais 3,4,5,6. Embora se saiba muito sobre a quiescência do NSC, nossa capacidade de identificar totalmente os drivers e reguladores da quiescência do NSC é limitada por limitações técnicas que existem para isolar e identificar qNSCs e sua transição para a ativação. A imagem de autofluorescência já foi bem-sucedida no estudo de mudanças no estado celular em muitos tipos diferentes de células, como microglia e células T, resolvendo o remodelamento metabólico, que influencia as propriedades ópticas de cofatores metabólicos autofluorescentes, como nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NAD (P) H) e flavina adenina dinucleotídeo (FAD) 7 , 8 . Os NSCs remodelam substancialmente suas redes metabólicas à medida que sofrem saída de quiescência 9,10,11,12,13,14. Assim, para aproveitar essas diferenças, a autofluorescência do NSC foi recentemente usada para identificar e enriquecer o estado de ativação do NSC, detectando mudanças na autofluorescência atribuídas ao remodelamento metabólico que ocorre quando os NSCs saem da quiescência15. A autofluorescência de imagem oferece várias vantagens técnicas: i) não requer a adição de marcadores exógenos, que podem afetar o comportamento celular; ii) pode fornecer dados de célula única de alta resolução sobre o estado de ativação do NSC; e iii) não requer a destruição da célula 7,16. Este protocolo descreve três estratégias para aproveitar a autofluorescência do NSC para estudar os estados celulares quiescentes e ativados do NSC15.

Recentemente, NSCs isolados de camundongos machos de 6 semanas de idade da zona subgranular do hipocampo, cultivados e reversivelmente colocados em quiescência in vitro 10,13,17,18,19,20,21, exibiram níveis aumentados de autofluorescência pontilhada (PAF) que excitam entre 400-600 nm e emitem entre 500-700 nm. Este sinal era específico para qNSCs em comparação com NSCs ativados e cíclicos15. A capacidade de separar visualmente essas duas populações sem o uso de marcadores de anticorpos ou repórteres adicionais é útil para muitas questões experimentais sobre a natureza dos qNSCs e saídas de quiescência. Assim, primeiro, este protocolo descreve estratégias para obter imagens do PAF em qNSCs usando um microscópio confocal, que pode ser usado para identificar o estado de ativação do NSC. Em segundo lugar, este protocolo descreve estratégias para detectar o PAF usando classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) e descreve ainda como classificar com base nesse sinal para enriquecer qNSCs ou aNSCs. Essas estratégias fornecem uma medida que pode ser usada para agrupar e separar NSCs com base no estado da célula.

Para desenvolver um método de maior resolução de separação de NSCs não apenas em estados distintos, mas também à medida que eles fazem a transição através da saída de quiescência para a ativação total, a imagem de tempo de vida de fluorescência (FLIM) foi realizada usando um microscópio multifotônico para obter imagens de autofluorescência NAD (P) H (denominado Canal 1) e autofluorescência verde (denominado Canal 2; que detecta a autofluorescência FAD e PAF em qNSCs) tempos de vida junto com sua intensidade. Essa abordagem capitaliza o fato de que as propriedades ópticas das moléculas na célula dependem de suas propriedades físicas16,22. Por exemplo, NAD (P) (NAD e NADP são opticamente indistinguíveis e, portanto, NAD (P) é usado para se referir a ambas as espécies) não é autofluorescente no estado oxidado, mas é autofluorescente em seu estado reduzido (NAD (P) H) 23. Além disso, propriedades físicas adicionais de moléculas autofluorescentes, como seu status de ligação a enzimas, podem ser extrapoladasrealizando imagens de fluorescência ao longo da vida 7,22,24. Por exemplo, NAD (P) H tem uma vida útil de fluorescência mais curta quando não está ligado a uma enzima22. Como moléculas autofluorescentes como NAD (P) H, que está envolvida em centenas de reações metabólicas, são usadas de forma diferente por células que progridem através de diferentes estados ou comportamentos celulares, essas mudanças podem ser detectadas e quantificadas usando um microscópio multifotônico detectando o tempo de vida da autofluorescência23. Juntamente com a abundância, ou intensidade, da autofluorescência, essas medidas fornecem informações multidimensionais para separar os NSCs em um estado celular ou outro e por meio das transições dinâmicas entre os estados. Em terceiro lugar, este protocolo descreve a execução, análise e interpretação de FLIM e medidas de intensidade dos sinais do Canal 1 (NAD (P) H) e do Canal 2 (PAF) usando um microscópio multifotônico. Em resumo, este protocolo descreve um kit de ferramentas de célula viva e sem rótulo para estudar a quiescência do NSC que fornece dados de célula única de alta resolução sobre o estado do NSC.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os procedimentos deste protocolo são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Wisconsin-Madison.

1. Usando um microscópio confocal para obter imagens de PAF em qNSCs e aNSCs para identificar o estado celular do NSC

  1. Gerar qNSCs e aNSCs in vitro a partir de culturas primárias de NSC.
    1. NSCs de cultura purificados de cérebros de camundongos adultos em um meio proliferativo para expansão (Tabela 1) 18 , 20 , 21 . Assim, por padrão, as culturas de NSC in vitro são aNSCs.
    2. Para gerar qNSCs, use o protocolo a seguir para revestir aNSCs em vidraria revestida e, em seguida, trate-os com meio qNSC para induzir a quiescência ao longo de 3 dias.
    3. Prepare vidraria com um índice de refração adequado para objetivas de imersão em óleo para NSCs aderentes, revestindo primeiro com uma solução de poli-L-ornitina (PLO; 10 mg / mL em água para plástico, 50 mg / mL em água para vidro) suficiente para cobrir o fundo do prato (para um poço de cubeta de imagem de 1 cm2 , use ~ 150 μL) por 1 h a 37 ° C em ddH2O.
    4. Remova a solução de PLO e lave 3 vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
    5. Cubra com solução de laminina (5 mg / mL) suficiente para cobrir o fundo do prato (para uma cubeta de imagem de 1 cm2 , use ~ 150 μL) em PBS e incube no mínimo por 3 h a 37 ° C, ou durante a noite.
    6. Remova a solução de laminina e adicione um meio de cultura suficiente para cobrir o fundo do prato (para um poço de cubeta de imagem de 1 cm2 , use ~ 150 μL).
    7. Prepare as células para tripsinização centrifugando aNSCs (elas podem começar como monocamadas ou neuroesferas) a 120 x g por 4 min em temperatura ambiente (RT, ~ 25 ° C).
    8. Tripsinize aNSCs peletizados da etapa anterior em 100 μL de mistura de tripsina por 5 min a 37 ° C e, em seguida, resfrie a tripsinização com 200 μL de mistura de inibidores de tripsina (Tabela 1).
    9. Deixe os NSCs descansarem por 2 minutos e, em seguida, triture-os mecanicamente pipetando para cima e para baixo 10 vezes.
    10. Adicione 5 mL de meio aNSC e gire as células a 120 x g por 4 min.
    11. Ressuspenda os NSCs em 1 mL de meio aNSC e coloque as células em confluência de 10% a 20% em meio aNSC. Por exemplo, coloque ~ 5.000 células em um poço de uma cubeta de imagem de 1 cm2 com meio de 150 μL.
    12. Depois de permitir 24 h para que os aNSCs adiram à superfície da placa, remova o meio aNSC e substitua-o por meio qNSC suficiente para cobrir o fundo da placa (para um poço de cubeta de imagem de 1 cm2, use ~ 150 μL; Tabela 1 - conforme descrito anteriormente 10,13,17,18) em poços nos quais a quiescência será induzida.
    13. Altere o meio aNSC e qNSC pelo menos uma vez a cada 2 dias. Após 3 dias em meio qNSC, os NSCs estão quiescentes e podem ser usados para experimentos de imagem.
  2. Use um microscópio confocal para obter imagens de qNSCs e aNSCs ao vivo in vitro.
    NOTA: Cada microscópio tem seu software proprietário; Assim, siga estas etapas executando ações análogas para configurar um microscópio específico. Este protocolo fornecerá instruções para trabalhar em NIS-Elements.
    1. Configure o microscópio confocal para imagens de autofluorescência.
      1. Clique em 405 Laser e digite na janela de emissão no menu 405 Laser . Clique em TD para coletar uma imagem de luz transmitida e defina o valor de HV para visualizar a amostra.
      2. Defina a potência do laser para 3.5% e ganhe para 75. Defina Zoom para 2. Configure os parâmetros de varredura confocal, defina a Pixel Dwell para 0,5 e defina a resolução para 2048 x 2048 pixels.
    2. Traga as células em foco sob uma lente objetiva de imersão em óleo de ~ 60x usando campo claro para focar.
    3. Mude para o modo de varredura confocal clicando em Eye Port, garantindo que o caminho da luz agora esteja indo para o cabeçote de varredura e que nenhum cubo de filtro esteja no caminho da luz.
    4. O PAF é enriquecido em qNSCs e é amplamente excitável e emitível (ver Figura 1). Escolha a melhor configuração óptica com base nos recursos do sistema usando a Figura 1 como guia. Para obter o sinal mais forte e limpo, excite com um laser entre ~400-500 nm, colete ~580-620 nm e use uma lente objetiva de imersão em óleo ~60x.
      NOTA: A imagem de autofluorescência requer potências de laser mais altas para excitar do que os experimentos de imagem típicos exigiriam. Se a imagem de outras moléculas autofluorescentes ou outros marcadores junto com o PAF, projete cuidadosamente a configuração óptica para evitar vazamento nos canais de autofluorescência.
    5. Adquira imagens de autofluorescência em qNSCs e aNSCs. Clique em Digitalizar, concentre-se na imagem e clique em Capturar. Para obter as melhores imagens, colete imagens de plano único com o citoplasma das células (com base na autofluorescência difusa espalhada por toda a célula) em foco para obter uma seção transversal representativa de cada célula.
    6. Use uma configuração óptica idêntica (por exemplo, a mesma potência do laser) e amostras de imagem no mesmo dia se quiser comparar diretamente imagens diferentes.
    7. As potências exatas do laser e do detector dependerão de cada sistema específico. Comece usando baixas potências de laser e, em seguida, aumente lentamente as potências até que o sinal seja detectável sem ser saturado.
  3. Analise PAF em qNSCs e aNSCs ao vivo in vitro.
    1. Depois de adquirir imagens de autofluorescência em qNSCs ou aNSCs, quantifique as imagens abrindo um arquivo no ImageJ25.
    2. Use a opção Processar > Filtros > Desfoque Gaussiano (Sigma: 2) na imagem de autofluorescência qNSC/aNSC para suavizar pixels irregulares.
    3. Use Image > Adjust > Threshold para selecionar pixels que representam PAF (eliminar pixels de fundo) e clique em Apply. Use os mesmos parâmetros de limite para todas as imagens que serão comparadas diretamente.
    4. Use o Processo > Bacia Hidrográfica > Binária para separar PAFs em estreita proximidade espacial.
    5. Usando o mouse do computador, desenhe uma região de interesse (ROI) ao redor de uma célula, conforme determinado olhando para uma imagem de campo claro ou observando a autofluorescência difusa presente uniformemente em todo o citoplasma da célula.
      NOTA: Geralmente, não há problema em excluir processos periféricos finos e incluir o núcleo, pois a autofluorescência normalmente não está presente nesses locais e, portanto, não interromperia a análise.
    6. Use Analisar > Analisar Partículas (Tamanho: 0,1-infinito μm; Circularidade: 0-1) com resumo marcado.
      NOTA: O ImageJ produzirá uma janela de saída com dados sobre as partículas na região de interesse, o que permite a tabulação do número de PAF em cada célula. Outras moléculas fluorescentes podem ser emparelhadas com PAF de imagem. No entanto, como o PAF é um sinal relativamente fraco, é importante validar se outros fluoróforos não sangram no canal PAF. Normalmente, os fluoróforos que absorvem 600+ nm e emitem 650+ nm podem ser emparelhados com PAF de imagem, como o LipidSpot 610.

2. Usando FACS para enriquecer o estado de ativação de NSC em NSCs cultivados com base em autofluorescência

  1. Gere qNSCs e aNSCs conforme descrito na seção 1.
  2. Classifique uma mistura de qNSCs e aNSCs ativos com base na autofluorescência.
    NOTA: Como exemplo, este protocolo discutirá como enriquecer aNSCs ou qNSCs em uma amostra gerada pela mistura de qNSCs e aNSCs em uma proporção de 1:1.
    1. Antes da tripsinização e classificação celular, rotule as células que progridem através da fase S adicionando 10 μM de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU; um análogo da timidina que se incorpora às células que sintetizam DNA, como na fase S do ciclo celular) ao meio de cultura celular por 1 h.
    2. Tripsinize qNSCs e aNSCs conforme discutido nas etapas 1.1.8, ressuspenda em 0,5 mL de tampão FACS (Tabela 1) e coloque no gelo.
      NOTA: qNSCs aderem fortemente ao prato. Em confluência relativamente mais alta, os qNSCs podem ser mecanicamente dissociados da antena. No entanto, se os qNSCs estiverem em uma confluência relativamente mais baixa ou forem difíceis de remover do prato mecanicamente por pipetagem, use tripsina para removê-los do prato.
      1. Remova o meio de cultura dos qNSCs e adicione 0,25% de tripsina suficiente para cobrir o fundo do prato (para um poço de cubeta de imagem de 1 cm2 , use ~ 150 μL), incubando por 3 min a 37 ° C.
      2. Após a incubação, extinguir a reação de tripsina adicionando meio correspondente a cada tipo de célula igual ao volume de tripsina adicionado. Dissocie mecanicamente as células do prato antes da coleta e centrifugação.
    3. Usando um bico de ~ 130 μm, analise qNSCs e aNSCs usando um citômetro de fluxo ou FACS com condições ópticas baseadas nas capacidades do instrumento e detecte PAF conforme mostrado na Figura 1. Por exemplo, use um laser de 405 nm para excitar a amostra e use um filtro de 580-620 nm para detecção.
    4. Colete pelo menos 10.000 qNSCs e aNSCs singleto em um arquivo de dados e, em seguida, use-os para projetar portas para coletar um enriquecimento de qNSCs ou aNSCs. Por exemplo, defina portas para coletar os 25% ou 25% inferiores dos NSCs com base na intensidade da autofluorescência na amostra mista aNSC:qNSC (1:1).
    5. Depois de definir portas para classificar singlets com autofluorescência mais brilhante ou mais fraca, conforme descrito acima, classifique as células em poços revestidos de PLO, laminina preenchidos com meio aNSC (10.000 células/cm2, consulte a etapa 1.1.3).
    6. Após o FACS, permita que os NSCs fiquem sentados por 3 h na incubadora. Fixe as células tratando-as com paraformaldeído a 4% suficiente para cobrir o fundo do prato (para uma cubeta de imagem de 1 cm2 , use ~ 150 μL) por 15 min em RT.
      NOTA: Para visualizar EdU em células, é mais fácil obter um kit comercial para detectar EdU e seguir o protocolo recomendado pelo fabricante.
    7. Primeiro, permeabilize as células por tratamento com 0,25% de triton em PBS por 15 min em RT.
    8. Em seguida, trate as células com uma solução de coloração EdU em RT por 30 min.
      NOTA: A composição precisa da solução de coloração EdU varia dependendo da fonte dos reagentes, mas consiste aproximadamente em um tampão de reação, um aditivo tampão de reação, sulfato de cobre e uma molécula modificada por alcino ou azida. Consulte a Tabela de Materiais para obter um kit recomendado.
    9. Após a coloração para visualizar EdU, lave as amostras 3 vezes por 10 min com PBS.

3. Usando um microscópio multifotônico para detectar a autofluorescência do Canal 1 e do Canal 2 e realizar FLIM em NSCs in vitro para identificar populações e transições de estado celular NSC

NOTA: Cada microscópio tem seu software proprietário; Assim, siga estas etapas executando ações análogas para configurar um microscópio específico. Este protocolo fornecerá instruções para trabalhar em Prairie View.

  1. Gere qNSCs e aNSCs conforme descrito na seção 1.
  2. Configure o microscópio multifotônico para imagens de fluorescência durante a vida útil.
    1. Use uma lente objetiva com ampliação de 40x ou mais (~1,15 NA).
    2. Use um microscópio multifotônico com os seguintes componentes, ou equivalentes: um laser ultrarrápido ajustável, um dicróico de passagem longa de 720 nm, um tubo fotomultiplicador (PMT) de fosfeto de arseneto de gálio (GaAsP), eletrônica de contagem de fótons únicos correlacionada ao tempo e um medidor de potência analógico.
    3. Para o canal de imagem 1, defina o laser sintonizável para 750 nm e use um cubo de filtro de emissão de 440/80 nm. Para o Canal 2 de imagem, defina o laser para 890 nm e use um cubo de filtro de emissão de 550/100 nm.
      NOTA: Desligue as luzes da sala antes que os PMTs sejam ligados.
  3. Função de resposta do instrumento
    1. Capture uma função de resposta do instrumento (IRF) por meio de imagens de um cristal de ureia triturado para contabilizar a resposta temporal do instrumento no decaimento medido.
      NOTA: O IRF é convoluído com o decaimento para calcular com precisão a curva de ajuste do decaimento. Para aquisição, o laser é ajustado para 890 nm e o cubo do filtro de emissão de 440/80 nm é usado. O GaAsP PMT é definido em um ganho de 800, e os pockels (potência do laser) são definidos muito baixos inicialmente, geralmente 1.
    2. Selecione um campo de visão com uréia cristalina e aumente ligeiramente os pockels (até um máximo de 15).
    3. Em seguida, adquira uma imagem usando os mesmos parâmetros usados para imagens de células: discriminador de fração constante (CFD) 1 x 104 - 1 x 105, resolução de 256 x 256, tempo de permanência definido em 4,8 μs, zoom óptico definido em 1,5x e um tempo de integração de 60 s.
  4. Realize imagens de tempo de vida de fluorescência e imagens de intensidade para autofluorescência do Canal 1 e Canal 2 em qNSCs e aNSCs vivos in vitro
    1. Encontre um campo de view para a imagem: Use as oculares para encontrar um campo de view adequado e altere o caminho da luz para a amostra no microscópio para permitir a imagem.
      NOTA: Uma imagem do Canal 1 será adquirida primeiro, seguida por uma imagem do Canal 2 do mesmo campo de view.
    2. Configuração para coleta de imagem do Canal 1: Clique na guia Potência/Ganho e defina o ganho no PMT para 800, clique na guia Laser 2-P e selecione 750 nm para o laser e certifique-se de que o cubo de filtro adequado seja usado (440/80 nm).
    3. Colete a imagem do Canal 1.
      1. Inicie o modo de visualização acessando a guia Power/Gain e configurando os Pockels para 30, depois indo para a seção Scanning dessa tela e clicando em Live Scan.
      2. Aumente os Pockels para encontrar um bom campo de visão com baixa potência do laser (abaixo de 3.6 mW). Assim que o campo de view for encontrado, ajuste os Pockels para que o medidor de potência leia ~ 3,6 mW na potência após a célula pockel, e o discriminador de fração constante (CFD) na guia Taxas de contagem mede 1 x 104 - 1 x 105.
    4. Vá para a seção Digitalização e clique em Verificação única quando esses parâmetros forem atendidos. Isso adquirirá uma imagem do Canal 1 com mais de 60 s.
    5. Para coletar uma imagem do Canal 2, clique na guia Laser 2-P e selecione 890 nm para o laser, troque o cubo do filtro pelo cubo de emissão do Canal 2 (550/100 nm).
    6. Inicie o modo de visualização conforme descrito em 3.4.3, aumente os Pockels até que o medidor de potência leia ~7 mW e as contagens de CFD sejam novamente 1 x 104 -1 x 105.
    7. Vá para a seção Digitalização e clique em Varredura única quando esses parâmetros forem atendidos. Isso adquirirá uma imagem do Canal 2 com mais de 60 s.
    8. Adquirir mais imagens - Depois de adquirir uma imagem do Canal 1 e do Canal 2, encontre um novo campo de visão e repita as etapas 3.4.2 a 3.4.4. Normalmente, coletar 4-6 campos de visão para obter imagens de ~ 50-100 células é suficiente para uma condição em um experimento.
      NOTA: O mCherry pode ser usado como uma etiqueta fluorescente adicional sem sangrar nos canais do Canal 1 e do Canal 2.
  5. Analise as imagens fluorescentes ao longo da vida.
    1. Gere matrizes de decaimento para imagens de tempo de vida de fluorescência no SPCImage seguindo as etapas 3.5.2-3.1.14.
      NOTA: Para obter informações adicionais, consulte os manuais atualizados disponíveis gratuitamente online26.
    2. Abra o SPCImage e abra a imagem IRF FLIM coletada na seção 3.3.
    3. Ajuste as barras pretas verticais no histograma para serem limitadas à curva de decaimento IRF. Na barra de menu superior, clique em IRF > Copiar para a área de transferência.
    4. Abra um arquivo de imagem FLIM dentro do conjunto de dados a ser analisado, obtido na seção 3.4.
    5. Na barra de menu superior, clique em IRF > Colar da área de transferência.
    6. No canto inferior direito do software, defina Componentes como 2.
    7. Na barra de menu superior do software, clique em Opções > Modelo. Em seguida, selecione MLE para Método de ajuste, Compartimento espacial para quadrado, Limite para pico e, em Configurações, selecione Decaimento multiexponencial.
    8. No canto inferior esquerdo do software, aumente o Bin até que a contagem de fótons seja de pelo menos 100 em pixels citoplasmáticos representativos no pico da contagem de fótons imediatamente após a excitação.
    9. No canto inferior esquerdo do software, defina o limite. Para o Canal 1, use um limite de "50". Para o Canal 2, use um limite de "0".
    10. Na barra de menu superior do software (este protocolo descreve como operar a versão 8.3), clique em Calcular > Matriz de Decaimento.
      NOTA: Certifique-se de que os valores de Chi2 sejam ~0,8-1,2 em toda a imagem. Isso confirma que os dados serão robustos validando a modelagem de decaimento biexponencial.
    11. Na barra de menu superior, clique em Arquivo > Salvar.
    12. Na barra de menu superior do software, clique em Arquivo > Exportar e exporte o seguinte:
      Valor codificado por cores, T1, T2, Chi2, intensidades de pixel, A1 [%], A2 [%] e imagem codificada por cores (com legenda)
      NOTA: Agora o SPCImage está configurado para fazer um processo em lote, analisando todas as imagens de um determinado canal (analise as imagens FLIM do Canal 1 juntas e repita a partir da etapa 3.5.2 para imagens FLIM do Canal 2).
    13. Para realizar um processo em lote, clique em Calcular > processamento em lote e selecione as imagens FLIM a serem processadas.
    14. Na barra de menu superior, clique em Arquivo > Exportar > Exportação em lote e selecione as matrizes de decaimento a serem exportadas (geradas na etapa anterior).
    15. Use o CellProfiler para criar máscaras citoplasmáticas seguindo as etapas 3.5.16-3.5.24.
      NOTA: Para fazer isso, os núcleos estarão manualmente em torno das imagens de intensidade do Canal 1, onde o núcleo é preto e claramente visível. Em seguida, um pipeline do CellProfiler manual_segmentation.cpproj27 (Arquivo Suplementar 1) produzirá automaticamente uma célula inteira e uma máscara citoplasmática, conforme indicado pela máscara nuclear. Os núcleos podem, alternativamente, ser marcados com mCherry e fotografados junto com a autofluorescência do Canal 1 e do Canal 2 para fornecer a capacidade de automatizar a identificação de núcleos. Muitos corantes nucleares convencionais, no entanto, sangram espectralmente nos canais de autofluorescência e, portanto, são incompatíveis com essa técnica.
    16. No R Studio, use R_ASCtoTIFF.rmd27 (Arquivo Suplementar 2) para converter os arquivos X_photons.asc , em que X é o nome da imagem adquirida da imagem do Canal 1 definida como arquivos TIF.
    17. Abra o Cell Profiler e abra manual_segmentation.cpproj.
    18. Carregue no Canal 1 TIFs de fótons criados na etapa 3.5.16 na etapa Imagens na parte superior do pipeline.
    19. Nas 3 etapas inferiores do pipeline intituladas SaveImages, defina um caminho de salvamento para as máscaras que o CellProfiler gerará.
    20. Clique em Iniciar modo de teste no canto inferior esquerdo do CellProfiler.
    21. Clique em Executar no canto inferior esquerdo do CellProfiler. Quando o CellProfiler chegar à etapa IdentifyObjectsManually , uma janela será exibida exibindo a imagem atual do Canal 1 que está sendo processada.
    22. Clique na tecla F no teclado e, em seguida, desenhe manualmente um traço dos núcleos de uma célula enquanto mantém pressionado o botão esquerdo do mouse. Depois de traçar os núcleos, solte o botão esquerdo do mouse. Repita esta etapa para todas as células da imagem.
    23. Clique em Concluído no canto inferior direito da janela pop-up com a imagem de intensidade. O software agora finalizará o pipeline e exportará máscaras citoplasmáticas, nucleares e de células totais.
    24. No canto inferior esquerdo, clique em Próximo conjunto de imagens e repita as etapas 3.5.21-3.5.23 para todas as imagens TIF do Canal 1.
    25. Use o script R (Integrar matrizes de decaimento e máscaras citoplasmáticas.rmd) para integrar matrizes de decaimento geradas nas etapas 3.5.2-3.5.14 e máscaras citoplasmáticas geradas nas etapas 3.5.15-3.5.24 para obter variáveis médias de imagem de tempo de vida de fluorescência para o citoplasma de cada célula seguindo as etapas 3.5.26-3.5.30
    26. Usando uma planilha (por exemplo, Microsoft Excel), crie um documento .csv intitulado test_key27 [Arquivo Suplementar 3] para um exemplo) com 3 colunas.
    27. Dê título às colunas como Pasta, NADH e FAD. Preencha a tabela para listar o local da pasta na pasta e, em seguida, o prefixo do título da imagem em NADH e FAD, respectivamente, para vincular cada imagem do Canal 1 a cada imagem do Canal 2 (consulte os dados de exemplo - Tabela 2).
  6. No R Studio, abra Integrar matrizes de decaimento e máscaras citoplasmáticas.rmd27(Arquivo suplementar 4).
    1. Defina os seguintes caminhos de arquivo conforme anotado no script: Definir diretório de trabalho, local do arquivo do canal 1, local do arquivo FAD, local do arquivo de máscara e local e nome do arquivo de saída.
    2. Execute todo o script. Após a conclusão bem-sucedida do script, um arquivo de saída será gerado, incluindo metadados e variáveis FLIM médias.
    3. Execute a análise usando autofluorescência FLIM data.rmd27 (Arquivo Suplementar 5) ou usando qualquer outro software de análise.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Imagem de autofluorescência confocal para separar o estado da célula NSC (Figura 1)
Para usar a microscopia confocal para resolver o estado de ativação do NSC, qNSCs e aNSCs foram gerados in vitro usando um meio de ativação ou meio de quiescência, conforme descrito anteriormente 10,13,17,18. Para detectar PAF em NSCs, qNSCs e aNSCs vivos foram fotografados usando a mesma exposição em um microscópio confocal (Ex: 405 nm, Em: 580-620 nm). Os qNSCs exibiram um número maior de PAF em comparação com os aNSCs (Figura 1A, B). Esse achado ilustra como as propriedades de autofluorescência podem ser usadas como marcadores para identificar o estado celular de qNSCs e aNSCs.

Enriquecimento FACS do estado da célula NSC usando autofluorescência (Figura 2)
Para enriquecer o estado do ciclo celular usando FACS, qNSCs e aNSCs foram gerados in vitro 10,13,17,18,19 conforme descrito neste protocolo e pré-marcados com EdU por 1 h antes da tripsinização e análise no citômetro de fluxo para marcar células progredindo através da fase S. qNSCs e aNSCs foram então analisados por citometria de fluxo separadamente ou misturados na proporção de 1 qNSC:1 aNSC (Figura 2


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Discussion

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Este protocolo descreve uma técnica de resolução de célula única, sem marcadores, não destrutiva e de célula única que permite a classificação do estado da célula NSC in vitro por meio de imagens de sinais autofluorescentes em NSCs. Essa abordagem detecta mudanças metabólicas que ocorrem durante a saída da quiescência do NSC, que influenciam as propriedades ópticas dos cofatores metabólicos, como o NAD (P) H, e oferece muitas vantagens sobre as tecnologias existentes para estudar a quiescência do NSC. Por exemplo, muitas técnicas convencionais para estudar qNSCs e aNSCs, como marcação com marcadores de ciclo celular como EdU, requerem a fixação de amostras. Os métodos atualmente existentes que são capazes de estudar NSCs vivos são ainda mais limitados por exigir a introdução de marcadores exógenos, normalmente gerando transgenes codificadores de proteínas fluorescentes. Essas ferramentas são limitadas tanto nos recursos necessários para gerá-las quanto em muitas ressalvas técnicas. Por exemplo, as proteínas de filamento intermediário nestina e proteína glial fibrilar ácida (GFAP) são comumente usadas como marcadores de qNSCs e aNSCs 12,13,18,28,29. No entanto, sabe-se que nestina e GFAP são diferencialmente expressas entre qNSCs e aNSCs 12,13,18,28,29. Além disso, a imagem de autofluorescência fornece dados de célula única de alta resolução, que podem desvendar a heterogeneidade de uma única célula que é perdida ou complicada de interpretar em experimentos que culminam em uma análise em massa de uma população de células.

No entanto, a imagem de autofluorescência também tem várias limitações. Muitos dos sinais autofluorescentes se perdem após a fixação celular. Assim, a imagem de autofluorescência é amplamente limitada ao estudo de células vivas. A imagem de autofluorescência também depende da falta de fluoróforos introduzidos exogenamente, que podem sangrar em canais autofluorescentes. Embora muitos fluoróforos possam ser compatíveis com imagens de autofluorescência em situações específicas, nem sempre é possível emparelhar imagens de autofluorescência com muitas ferramentas existentes. A imagem de células vivas também pode induzir fototoxicidade. Uma iteração de imagem usando este protocolo não induz fototoxicidade suficiente para reduzir a viabilidade do NSC. No entanto, imagens repetidas de células em um curso de tempo em intervalos mais frequentes, muitas vezes ao dia, podem gerar fototoxicidade significativa e, portanto, não é uma estratégia viável para estudar a quiescência do NSC. Por fim, embora a imagem de autofluorescência possa ser usada para estudar NSCs de camundongos machos de 6 semanas de idade do hipocampo ou dos ventrículos laterais, não está claro quão amplamente essa técnica pode ser usada para estudar NSCs de outras fontes, idades ou outros tipos de células-tronco.

O protocolo aqui descrito também pressupõe a produção precisa de qNSCs e aNSCs in vitro usando protocolos previamente estabelecidos 10,13,17,18,19. Se reproduzir os resultados deste protocolo for desafiador, certifique-se de que qNSCs e aNSCs estejam sendo gerados adequadamente, sondando a presença ou ausência de vários marcadores de qNSCs e aNSCs, conforme descrito anteriormente 10,13,17,18,19. Em conjunto, a imagem de autofluorescência fornece uma nova abordagem técnica para identificar qNSCs e aNSCs e estudar as saídas de quiescência do NSC.

Disclosures

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Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos ao núcleo de citometria de fluxo da UW-Madison (P30 CA014520 e 1S10RR025483-01) e aos membros do laboratório Moore e da comunidade UW-Madison por suas contribuições. Agradecemos às nossas fontes de financiamento: NIH T32 T32GM008688 (para CSM), Diana Jacobs Kalman Fellowship da AFAR (para CSM), Wisconsin Graduate Fellowship (para CSM), DP2 NIH New Innovator Award (1DP2OD025783, para DLM), Vallee Scholar Award (para DLM), NIH 1R56NS130450 (para DLM e MCS), R01 CA185747 (para MCS), R01 CA205101 (para MCS), R01 CA211082 (para MCS) e a National Science Foundation Grant No. CBET-1642287 (para MCS).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lente objetiva de água 40xNikonMRD77410Lente objetiva usada em microscópio multifotônico na Parte 3
Cubeta de 8 poçosIbidi80826-90Para imagem de aNSCs/qNSCs
Medidor de potência analógicaThorlabsPM100AUsado em microscópio multifotônico na Parte 3
Antibiótico-Antimicótico (100X) (PSF)Antibiótico Thermo Fisher15240062para mídia NSC
B-27Invitrogen17504044Suplemento nutriente para mídia NSC
BMP4Fisher Scientific5020BP010Fator para induzir quiescência
Albumina de soro bovinoSigmaA4919-25GPara fazer BMP4
Chameleon laser ultrafastLaser CoherentN / Ausado em microscópio multifotônico na Parte 3
MicroscópioconfocalMicroscópio NikonC2usado para a Parte 1
DMEM/F-12 (sem GlutaMAX)Invitrogen11320033Mídia de base para NSCs
DNAseSigmaD5025-15KUAdicionado ao kit de ensaio EdU inibidor de tripsina
InvitrogenC10337Ensaio de proliferação para cultura de células
EGFPeproTechAF-100-15-500UG Fator decrescimento para mídia NSC
FGFPeproTech100-18BFator de crescimento para mídia NSC
Classificador de células ativadas fluorescentesBDFACSAriaClassificador de células ativadas fluorescentes usado para a Parte 2
HeparinaSigmaH3149-50KUAditivo para mídia NSC
L-15Invitrogen21083027Para preparar solução inibidora de tripsina
LamininaSigmaL2020-1MGPara revestimento de vidraria
Nikon TiE microscópio invertidoNikonN / AEstrutura do microscópio Usado para a Parte 3
PLOSigmaP3655-100MGPara revestimento de vidraria
SPC-150 Eletrônica de contagem de fótons únicosBecker e HicklN / AUsado em microscópio multifotônico na Parte 3
Tripsina (para tripsinizar pellets de aNSCs que estavam crescendo como esferas ou monocamadas)Gibco15090046Para tripsinizar neuroesferas ou aNSCs aderentes
Tripsina (para tripsinizar qNSCs)Gibco25200072Para tripsinizar qNSCs aderentes
Inibidor de tripsinaSigmaT6522-100MGPara inibir a tripsinização de aNSCs
Cristais de ureiaSigmaU5128-5GUsado para coletar um IRF
VerseneThermo Fisher15040066Para preparar tripsina

References

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