Artigo de método

Avaliação fisiofisiológica da retina em um modelo de rato

DOI:

10.3791/63111

⸱

6 de maio de 2022

 , 
1Translational Pharmaceutics Research Laboratory (TPRL), Department of Pharmacy, Birla Institute of Technology & Science — Pilani, Hyderabad Campus

Neste artigo

Resumo

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A retinopatia diabética é uma das principais causas de cegueira. Histologia, ensaio de quebra da barreira hemorrânica e angiografia de fluorescência são técnicas valiosas para entender a fisiopatologia da retina, o que poderia aumentar ainda mais o rastreamento eficiente de drogas contra a retinopatia diabética.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uma doença ocular do segmento posterior como a retinopatia diabética altera a fisiologia da retina. A retinopatia diabética é caracterizada por um descolamento da retina, quebra da barreira hemistê-retinária (BRB) e angiogênese da retina. Um modelo de rato in vivo é uma ferramenta experimental valiosa para examinar as mudanças na estrutura e função da retina. Propomos três técnicas experimentais diferentes no modelo de ratos para identificar alterações morfológicas das células da retina, vasculatura da retina e BRB comprometido. A histologia da retina é usada para estudar a morfologia de várias células da retina. Além disso, a medição quantitativa é realizada pela contagem de células da retina e medição da espessura de diferentes camadas de retina. Um ensaio de avaria brb é usado para determinar o vazamento de proteínas extraoculares do plasma para tecido vítreo devido à quebra do BRB. A angiografia da fluorescência é usada para estudar angiogênese e vazamento de vasos sanguíneos visualizando vasculatura de retina usando corante FITC-dextran.

Introdução

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A retinopatia diabética (DR) é uma das complicações secundárias mais complexas do diabetes mellitus. É também a principal causa de cegueira evitável na população em idade de trabalhar em todo o mundo. Em uma meta-análise recente de 32,4 milhões de pessoas cegas, 830.000 (2,6%) pessoas ficaram cegas devido ao DR1. A proporção de perda de visão atribuída ao diabetes ficou em sétimo lugar em 2015, com 1,06% (0,15-2,38) globalmente 2,3.

A retinopatia diabética é diagnosticada por anormalidades vasculares nos tecidos oculares posteriores. Clinicamente, é dividido em duas etapas - DR não proliferativa (NPDR) e DR Proliferativa (PDR), com base na vascularização na retina. A hiperglicemia é considerada o potente regulador da DR, pois implica várias vias envolvidas na neurodegeneração4,5, inflamação6,7 e microvasculatura8 na retina. Múltiplas complicações metabólicas induzidas devido à hiperglicemia incluem o acúmulo de produtos finais de glicação avançada (AGEs), via poliol, via hexosamina e via proteína quinase-C. Essas vias são responsáveis pela proliferação celular (células endoteliais), migração (pericítos) e apoptose (células neurais da retina, pericítes e células endoteliais) com base em diferentes estágios de retinopatia diabética. Essas alterações metabólicas podem levar a alterações fisiológicas como descolamento da retina, perda de células da retina, quebra da barreira sanguínea-retina (BRB), aneurismas e angiogênese9.

A estreptozotocina (STZ) induzida pelo diabetes tipo 1 é uma prática bem estabelecida e bem aceita em ratos para avaliar a patogênese do diabetes e suas complicações. Os efeitos diabetogênicos da STZ são devido à destruição seletiva da ilhota pancreática β células10. Como resultado, os animais sofrerão deficiência de insulina, hiperglicemia, polidipsia e poliuria, todas características do diabetes mellitus11 humano. Para indução grave de diabetes, a STZ é administrada a 40-65 mg/kg de peso corporal por via intravenosa ou intraperitoneal durante a idade adulta. Após aproximadamente 72 h, esses animais apresentam níveis de glicemia superiores a 250 mg/dL10,12.

Para entender as alterações fisiológicas da retina devido à neurodegeneração, inflamação e angiogênese, diferentes técnicas devem ser otimizadas em modelos animais experimentais. Alterações estruturais e funcionais nas células da retina e vasos da retina podem ser estudadas por várias técnicas como histologia, ensaio de quebra de BRB e angiografia de fluorescência.

A histologia envolve o estudo da anatomia de células, tecidos e órgãos a um nível microscópico. Estabelece uma correlação entre a estrutura e a função das células/tecidos. Várias etapas são realizadas para visualizar e identificar as alterações microscópicas na estrutura tecidual, comparando assim contrapartidas saudáveis e doentes13. Por isso, é essencial padronizar meticulosamente cada passo da histologia. Várias etapas envolvidas na histologia da retina são a fixação do espécime, aparação do espécime, desidratação, clareamento, impregnação com parafina, incorporação, secção e coloração (hemaoxílina e eosina coloração)13,14.

Em uma retina saudável, o transporte de moléculas através da retina é controlado pelo BRB, composto por células endoteliais e pericílitos no lado interno, e células epiteliais de pigmento da retina no lado externo. No entanto, as células endoteliais internas do BRB e os pericítos começam a se degenerar durante a condição doente, e o BRB também está comprometido15. Devido a este colapso do BRB, muitas moléculas de baixo peso molecular vazam em tecido vítreo e retiniano16. À medida que a doença progride, muitas outras moléculas de proteínas (baixo e alto peso molecular) também vazam em tecido vítreo e retiniano devido à perturbação da homeostase17. Leva a várias outras complicações e, em última instância, edema macular e cegueira. Assim, quantificar os níveis de proteína nos estados vítreos e comparar os estados saudáveis e diabéticos comprometeu o BRB.

A angiografia da fluorescência é uma técnica usada para estudar a circulação sanguínea da retina e coroide usando corante fluorescente. É usado para visualizar vasculatura da retina e coroide injetando corante de fluoresceína via rota intravenosa ou injeção cardíaca18. Uma vez que o corante é injetado, ele atinge primeiro as artérias da retina, seguido por veias da retina. Esta circulação de corante é geralmente concluída dentro de 5 a 10 minutos a partir da injeção de corante19. É uma técnica importante para diagnosticar várias doenças oculares posteriores, incluindo retinopatia diabética e neovascularização choroidal20. Ajuda a detectar grandes e pequenas mudanças de vasculatura em condições normais e doentes.

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Protocolo

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Este protocolo segue todas as diretrizes de cuidados com animais fornecidas pelo Comitê de Ética Animal Institucional, BITS-Pilani, campus Hyderabad.

1. Histologia da retina

  1. Enucleação e fixação do olho
    1. Eutanize um rato macho Wistar diabético de 2 a 3 meses de idade, juntamente com o controle de idade (14 a 15 semanas de idade) usando uma alta dose de pentobarbital (150 mg/kg) injetado através da rota intraperitoneal. Nenhum batimento cardíaco detectável confirma a morte dentro de 2-5 minutos.
    2. Enuclear o olho fazendo incisões usando uma lâmina de bisturi nas regiões nasais e temporais do olho. Em seguida, corte ao longo de suas bordas usando fórceps e micro tesouras para remover o olho da tomada orbital.
      NOTA: Antes de sacrificar ratos, mantenha as soluções fixativas prontas.
      ATENÇÃO: O formaldeído irrita a pele, o olho, o nariz e o trato respiratório. Também pode causar câncer, pois é um potente sensibilizador da pele. Use luvas e manuseie-o sob o capô21.
    3. Lave bem o olho com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) em uma placa de Petri para remover sangue. Remova o excesso de gordura ao redor do olho para facilitar a penetração da solução fixativa.
    4. Coloque imediatamente o olho em 5 mL de solução fixa com a ajuda de fórceps, e certifique-se de que ele não está preso às paredes de frascos de vidro. Mexa delicadamente por alguns segundos e substitua a tampa por uma etiqueta adequada. Incubar o olho em solução fixa por 24 a 48 h em condições escuras à temperatura ambiente.
  2. Corte de tecido
    1. Após a fixação, retire o olho da solução fixativa, lave com 10 mL de PBS e coloque-o em uma placa de Petri contendo 10 mL de PBS refrigerado a 4 °C.
    2. Usando micro fórceps, segure o olho com o nervo óptico e faça um corte no pars plana com a ajuda de micro tesouras. Corte toda a margem da córnea para separar a xícara anterior de um olho. Usando fórceps, escolha a lente suavemente, descarte-a e corte o nervo óptico.
    3. Usando micro tesouras curvas, faça uma seção longitudinal da mandíbula posterior, passando pelo disco óptico dividindo-o em duas metades. Coloque-o na base do e feche a tampa corretamente sem qualquer perturbação ao tecido. Rotule as fitas com o nome e data da amostra de tecido.
  3. Desidratação, limpeza e impregnação de tecido
    1. Desidratar o tecido aparado por transferência gradual em 80 mL de 50%, 70%, 90% e 100% etanol. Ao transferir as fitas de uma concentração para outra, certifique-se de desarmá-las em papel de tecido limpo para minimizar a contaminação.
      NOTA: Deixe o tecido ficar em cada transferência por 30 minutos (duas vezes). O tempo total consumido para esta etapa é de aproximadamente 4 h.
    2. Após a desidratação, transfira as fitas para 80 mL de xileno por 30 minutos (duas vezes) para substituir o etanol por xileno.
      NOTA: Após a incubação com xileno, o tecido se torna translúcido.
      ATENÇÃO: O xileno é um composto aromático com um anel de benzeno. Irrita o olho e a membrana mucosa e também pode causar depressões.
    3. Por fim, impregnar o tecido com parafina pré-aquecida a 60 °C para substituir o xileno no tecido. Dab as fitas várias vezes em papel de tecido para minimizar o teor de xileno e colocar em 200 mL de parafina (líquido a 60 °C) por 2 h (1 h x 2).
      ATENÇÃO: Evite inalar parafina derretida, pois produz pequenas gotículas lipídicas que podem causar desconforto respiratório.
  4. Incorporação de parafina
    1. Ligue a máquina de incorporação de parafinas pelo menos 1h antes de usar para derreter a parafina e para as estações atingirem as temperaturas desejadas. Encha um molde de aço com cera de parafina derretida colocando-a em uma superfície quente, em seguida, remova uma fita de cada vez do recipiente de parafina.
    2. Mova o molde de aço de uma superfície quente para uma superfície fria (4 °C). Neste ponto, a cera no molde começará a se solidificar. Antes de solidificar completamente, coloque o tecido na cera com a ajuda de fórceps e oriente o tecido para que a porção do disco óptico do copo posterior esteja voltada para a base do molde.
      NOTA: Certifique-se de que o tecido não se move e mantenha a orientação desejada. Se não, coloque o molde de volta na superfície quente de trabalho até que toda a parafina liquefaz, em seguida, comece novamente com o passo 1.4.2.
    3. À medida que a cera no molde começa a se solidificar, coloque imediatamente a base do em cima do molde. Encha cuidadosamente o molde com parafina acima da borda superior do e transfira-o lentamente para uma superfície fria (perto de -20 °C) para solidificação rápida. Até solidificar, repita o processo com outras fitas da etapa 1.4.2.
    4. Uma vez que todos os moldes são solidificados, separe o molde de aço do. Se for difícil, espere um pouco mais e tente novamente (não remova com força). A separação torna-se mais fácil após a solidificação completa. Agora o se torna a base do bloco de parafina a ser mantido durante a secção por microtome.
      NOTA: Este bloco pode ser armazenado à temperatura ambiente para uso posterior. Neste ponto, o processo pode ser interrompido e continuado posteriormente (se necessário).
  5. Corte
    1. Instale uma lâmina de microtome descartável no suporte da lâmina. Remova o excesso de cera de parafina em torno de fitas para que as porções superior e inferior dos blocos permaneçam paralelas à faca. Coloque o bloco no porta-fitas.
    2. Desbloqueie a roda de mão para avançar até que a superfície do bloco esteja em contato com a borda da faca. Corte o excesso de cera de parafina no bloco até que o tecido seja visualizado na superfície do bloco. Coloque a espessura da seção em 5 μm e corte uma fita de cinco a seis seções.
    3. Com fórceps, transfira suavemente a fita para a superfície do banho de água pré-aquecido (cerca de 50 °C) para desdobrar a fita. Colete seções em um slide de vidro revestido com a albumina de Mayer segurando o slide sob a seção. Levante suavemente as seções e deixe que os slides sequem horizontalmente durante a noite a 37 °C.
      NOTA: Os slides podem ser armazenados à temperatura ambiente em caixas secas por vários meses. Nesta etapa, o processo pode ser interrompido e continuado mais tarde.
  6. Mancha
    1. Aqueça as lâminas para serem manchadas em um forno de ar quente a 60 °C por 1 h antes de usar para a parafina derreter, e siga os passos mencionados na Tabela 1.
      ATENÇÃO: As manchas de hematoxilina e eosina são tóxicas quando inaladas ou ingeridas. Dizem que são cancerígenos.
ReagenteTempo de paradaRepetição (Número de vezes)
Xileno5 min.2
100% Etanol5 min.2
90% etanol5 min.2
70% etanol5 min.2
50% etanol5 min.2
Água5 min.2
Hematoxilina4 min.1
Lavagem de água
1% Álcool ácido em 70% Etanol30 s1
Lavagem de água
Água de Scott1 min.1
Lavagem de água
50% etanol1 min.1
95% Etanol1 min.1
0,25% Eosin5 s1
Lavagem de água
Água2 min.1
95% Etanol1 min.1
100% Etanol1 min.1
Xileno5 min.2
Mountant e deslizamento de cobertura

Mesa 1. Procedimento de coloração de hematoxilina e eosina

2. Ensaio de quebra da barreira hemencefálica

  1. Coleta de sangue e vítreos
    1. Anestesia um rato macho Wistar diabético de 2 a 3 meses de idade, juntamente com o controle de idade (14 a 15 semanas) usando cetamina (80 mg/kg) e xilazina (8 mg/kg). Confirme o estado anestésico por reflexo de retirada de pedal (pinça do dedo do pé). Colete imediatamente 1 mL de sangue por punção cardíaca em um tubo revestido de ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA) para separar o plasma do sangue inteiro.
    2. Eutanize o rato usando uma alta dose de pentobarbital (150 mg/kg), injetado através da rota intraperitoneal. Nenhum batimento cardíaco detectável confirma a morte dentro de 2-5 minutos. Enuclear o olho e colocá-lo imediatamente em gelo seco.
    3. Coloque o olho em uma placa de Petri limpa acima do gelo seco (recomendado) e comece a dissecar o olho como mencionado na etapa 1.2.2.
    4. Retire a lente, puxe o vítreo cuidadosamente do copo posterior usando micro fórceps e coloque-o em um tubo de homogeneização contendo três a quatro contas de vidro (2-4 mm).
      NOTA: Recomenda-se a dissecção em gelo seco, pois a remoção da lente e o vítreo é mais fácil em condições de congelamento.
  2. Preparação de amostras
    1. Homogeneize o humor vítreo em um homogeneizador de contas a velocidade média para 10 s.
    2. Transfira o sangue (1 mL) e amostras vítreas (10-20 μL) para os tubos de microcentrifuuge e centrífuga ambas as amostras a 5200 x g por 10 min a 4 °C.
      NOTA: No caso da homogeneização bem sucedida, o vítreo tem consistência uniforme após centrifugação. No entanto, no caso de consistência não uniforme de vítreo, repita a partir da etapa 2.2.1 com maior tempo de homogeneização.
    3. Colecione supernante de ambas as amostras, e diluir amostras de humor vítreo e plasma na razão 1:10 e 1:20, respectivamente, com PBS.
  3. Quantificação proteica e proporção de proteínas vítreas-plasma
    1. Para quantificar a concentração de proteínas em amostras de humor vítreo e plasma, adicione 5 μL de amostras diluídas a 250 μL de reagente bradford, misture bem e leia a absorvência em 590 nm dentro de 40 min.
      NOTA: Se o valor de absorção das amostras for acima de 1,0, diluir ainda mais as amostras e repetir o procedimento a partir da etapa 2.2.3.
    2. Normalize o nível de proteína vítreo para o nível de proteína plasmática do mesmo rato e meça a diferença de dobra entre ratos saudáveis versus diabéticos.

3. Angiografia da fluorescência

  1. Injeção de corante FITC-dextran70000
    1. Anestesia um rato macho Wistar diabético de 2 a 3 meses de idade, juntamente com o controle de idade (14 a 15 semanas) usando isoflurane de 3% e confirme o reflexo de retirada do pedal (pinça do dedo do pé). Mergulhe a cauda em um béquer contendo água morna (37-40 °C). Limpe a cauda com 70% de etanol antes de injetar o corante. Localize a veia lateral da cauda e marque a posição de injeção na porção inferior da cauda.
      NOTA: Se a inserção da agulha falhar, tente inserir em outro local acima da posição atual (ponta para a base da cauda). No entanto, é aconselhável injetar uma vez, pois picadas repetidas podem levar ao desenvolvimento do estresse no rato, o que poderia causar vasoconstrição.
    2. Injete 1 mL de 50 mg/mL FITC-dextran70000 solução de corante através da veia traseira e deixe que o corante circule por 5 minutos. Eutanize o rato com uma alta dose de pentobarbital (150mg/kg), injetado através da rota intraperitoneal. Nenhum batimento cardíaco detectável confirma a morte dentro de 2-5 minutos. Enuclear o olho como mencionado na etapa 1.1.1.
      NOTA: Se necessário, o olho pode ser fixado em solução de formaldeído de 4%, por no máximo 30 min.
  2. Preparação de montagem plana
    1. Para preparar montagens planas, mantenha as ferramentas de dissecação prontas junto com os slides e tampas. Coloque o olho em uma placa de Petri cheia de PBS refrigerado e comece a dissecar o olho como mencionado na etapa 1.2.2.
    2. Agora coloque a ponta de um forcep pontiagudo entre a esclera e a retina. Mova-o suavemente ao longo da borda do copo, certificando-se de que a retina não está presa à esclera em nenhum momento. Se houver alguma obstrução, corte lentamente essa porção ao longo da borda usando micro tesouras curvas.
    3. Uma vez confirmado que a retina não está presa à esclera de qualquer lado, cortada perto do disco óptico, fazendo um pequeno orifício de tal forma que a retina se desprende completamente da esclera. Empurre lentamente a retina para a solução PBS e coloque-a em um escorregador plano limpo com a ajuda de uma espátula ou fórceps.
    4. Usando micro tesouras ou lâminas de bisturi, faça pequenos cortes no tecido da retina, dividindo-o em quatro quadrantes. Certifique-se de que os cortes estão a pelo menos 2 mm de distância do orifício deixado pelo disco óptico no centro, como mostrado na Figura 1.
    5. Remova o excesso de PBS das laterais do tecido usando pontas de 0,2 mL sem perturbar o suporte plano.
    6. Coloque uma gota de meio de montagem anti-desbotamento (50 μL a 100 μL) em uma montagem plana, cubra com um deslizamento de tampa e visualize imediatamente sob um microscópio confocal.
      NOTA: Mantenha a luz mínima durante todo o procedimento.
  3. Visualização da montagem plana
    1. Visualize a montagem plana sob o objetivo de 10x de um microscópio confocal. Realize a varredura de ladrilhos para capturar toda a montagem plana como uma única imagem. O número de telhas depende do tamanho do suporte plano da retina. Além disso, realize o empilhamento Z para visualizar as veias e artérias em diferentes focos (o tamanho preferido para z-stack é de 5 μm, dependendo do qual, o número de passos de pilha Z varia).
    2. Use pmt e detector de hd a % ganho como 700-900 e 100-150, respectivamente. Escolha a faixa de emissão entre 510-530 nm para corante FITC-dextran.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histologia da retina
Na retina diabética, as células da retina sofrem degeneração. Além disso, a espessura das camadas de retina aumenta devido ao edema22. As imagens obtidas após a coloração de Hematoxilina e Eosina podem ser usadas para contagem de células e medição da espessura de diferentes camadas, como mostrado na Figura 2 usando ImageJ.

Ensaio de quebra da barreira de retina sanguínea
À medida ...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histologia
A histologia retinária é realizada para visualizar as alterações morfológicas das células e camadas da retina. Várias etapas, incluindo escolha de solução fixativa, duração de fixação, desidratação e impregnação de parafina, precisam ser otimizadas. O tamanho do tecido não deve exceder 3 mm, pois a penetração fixa torna-se lenta. O paraformaldeído de 4% comumente utilizado leva ao descolamento da retina mesmo no olho saudável devido à osmolaridade relativamente alta da solução em comparação...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de reconhecer o Conselho Indiano de Pesquisa Médica (ICMR; ITR-2020-2882) para apoio de financiamento ao Dr. Nirmal J. Gostaríamos também de agradecer à University Grant of Commission por fornecer bolsa de pesquisa júnior a Manisha Malani e ao Centro de Laboratórios Analíticos Centrais, BITS-Pilani, campus hyderabad por fornecer instalações de infraestrutura.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Histologia
Reagentes
IsofluranoAbbottAgente anestésico
Cloridrato de cetaminaTroikaa PharmaceuticalsAgente anestésico
XilazinaIndian Immunologicals LimitedAgente anestésico
Pentobarbital sódicoZora PharmaAgente eutanésia
Solução fixadora (1% de formaldeído, 1,25% de glutaraldeídoHiMedia, AvraMB059, ASG2529Etanol preparado internamente
HaymanF204325Desidratação
XilenoHiMediaMB-180Limpeza de etanol ou parafina
Cera de parafinaHiMediaGRM10702usado para incorporar tecido
GlicerolHiMediaTC503Para preparar lâminas revestidas de albumina. O glicerol e a albumina do ovo são misturados na proporção de 1:1 para revestir as lâminas
Ácido clorídricoSisco Research laboratories Pvt. Ltd.65955Para preparação de álcool ácido a 1 %
Ácido acéticoHiMediaAS119Para preparação de eosina
Água ScottsLeica3802900Reagente azulado
Solução de Papanicolaou 1b Solução de hematoxilinaSigma1.09254.0500Coloração de núcleos
EosinaHiMediaGRM115Coloração de citoplasma, solução a 0,25 % foi preparada mídia interna
DPX MountantSigma6522Visualização e proteção de seções retinianas
Equipamentos
GlasswareBorosil
Pinça de córneaStephens InstrumentsS5-1200Dissecção
Pinça ColibriStephens InstrumentsS5-1135Dissecção
Micro tesouracurvada Stephens InstrumentsS7-1311Dissecção
Vannas scissorStephens InstrumentsS7-1387Dissecção
Tesoura de írisStephens InstrumentsS7-1015
HiMediaPW1292Para segurar o tecido durante o processamento da histologia
Banho-mariaGT SonicGT Sonic-D9Manutenção da temperatura
Estação de incorporação de parafinaMyrEC 350Preparação de blocos de parafina
MicrótomoZhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.YD-335ALâminas de corte
LeicaLeica 818Lâminas de corte
HiMediaBG005Segurando seções de tecido de parafina
LamínulasHiMediaBG014CPara cobrir o tecido após a adição de mídia de montagem
Blood Retinal Barrier breakbreak
Reagents
IsofluranoAbbottB506Anestesia
Gelo secoNão aplicávelNão aplicávelDissecção
Reagente de BradfordSigmaB6916Quantificação de
proteínasEquipamentos
Pinça de córneaStephens InstrumentsS5-1200Dissecção
Pinça ColibriStephens InstrumentsS5-1135Dissecção
Micro tesoura curvaStephens InstrumentsS7-1311Dissecção
Vannas tesouraStephens InstrumentsS7-1387Dissecção
Íris tesouraStephens InstrumentsS7-1015Dissecção
VidrariaBorosilNão aplicável
Tubos revestidos com EDTAJ.KDiagnostics Não aplicávelSeparar plasma de sangue total
Tubos de homogeneizaçãoMP BiomedicalsSKU: 115076200-CFHomogeneização de tampas de
homogeneizaçãoMP BiomedicalsSKU: 115063002-CFHomogeneização de esferas de vidro vítreas
MP BiomedicalsSKU: 116914801Homogeneização do vítreo
HomogeneizadorBertin InstrumentsP000673-MLYS0-AHomogeneização de placa vítrea de
96 poços - TransparenteGrenierGN655101Quantificação de proteínas
Leitor de placasDispositivos molecularesSpectrMax M4Medição de absorbância
CentrífugaREMICPR240 PlusAngiografia < Centrifugação
>Fluorescência
Reagentes
IsofluranoAbbottB506Anestesia
FITC-dextrano 70 kD (FITC, Dextrano, Dilaurato de Dibutilina, DMSOFITC, Dextrano e Dilaurato de Dibutilina da Sigma; DMSO de HiMediaFITC-F3651, Dextran-31390, dilaurato de dibutilina -29123, DMSO-TC185Preparado internamente
FluoroshiedSigmaF6182Meio de montagem anti-desbotamento
< forte>Equipamentos< / forte>
pinça de córneaStephens InstrumentsS5-1200Pinça de dissecção
ColibriStephens InstrumentsS5-1135Dissecção
Micro tesoura curvaStephens InstrumentsS7-1311Dissecção
Vannas tesouraStephens InstrumentsS7-1387Dissecção
Tesoura de írisStephens InstrumentsS7-1015Dissecção
VidrariaBorosilNão aplicável
CorrediçasHiMediaBG005Preparação de montagem plana
LamínulasHiMediaBG014CPara cobrir o tecido após a adição de meios de montagem
Microscópio confocalLeicaDMi8Visualização de montagem plana
de dissecção vítrea

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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