Method Article

Avaliação fisiofisiológica da retina em um modelo de rato

DOI:

10.3791/63111

⸱

May 6th, 2022

 , 
1Translational Pharmaceutics Research Laboratory (TPRL), Department of Pharmacy, Birla Institute of Technology & Science — Pilani, Hyderabad Campus

In This Article

Summary

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A retinopatia diabética é uma das principais causas de cegueira. Histologia, ensaio de quebra da barreira hemorrânica e angiografia de fluorescência são técnicas valiosas para entender a fisiopatologia da retina, o que poderia aumentar ainda mais o rastreamento eficiente de drogas contra a retinopatia diabética.

Abstract

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Uma doença ocular do segmento posterior como a retinopatia diabética altera a fisiologia da retina. A retinopatia diabética é caracterizada por um descolamento da retina, quebra da barreira hemistê-retinária (BRB) e angiogênese da retina. Um modelo de rato in vivo é uma ferramenta experimental valiosa para examinar as mudanças na estrutura e função da retina. Propomos três técnicas experimentais diferentes no modelo de ratos para identificar alterações morfológicas das células da retina, vasculatura da retina e BRB comprometido. A histologia da retina é usada para estudar a morfologia de várias células da retina. Além disso, a medição quantitativa é realizada pela contagem de células da retina e medição da espessura de diferentes camadas de retina. Um ensaio de avaria brb é usado para determinar o vazamento de proteínas extraoculares do plasma para tecido vítreo devido à quebra do BRB. A angiografia da fluorescência é usada para estudar angiogênese e vazamento de vasos sanguíneos visualizando vasculatura de retina usando corante FITC-dextran.

Introduction

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A retinopatia diabética (DR) é uma das complicações secundárias mais complexas do diabetes mellitus. É também a principal causa de cegueira evitável na população em idade de trabalhar em todo o mundo. Em uma meta-análise recente de 32,4 milhões de pessoas cegas, 830.000 (2,6%) pessoas ficaram cegas devido ao DR1. A proporção de perda de visão atribuída ao diabetes ficou em sétimo lugar em 2015, com 1,06% (0,15-2,38) globalmente 2,3.

A retinopatia diabética é diagnosticada por anormalidades vasculares nos tecidos oculares posteriores. Clinicamente, é dividido ....

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Protocol

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Este protocolo segue todas as diretrizes de cuidados com animais fornecidas pelo Comitê de Ética Animal Institucional, BITS-Pilani, campus Hyderabad.

1. Histologia da retina

  1. Enucleação e fixação do olho
    1. Eutanize um rato macho Wistar diabético de 2 a 3 meses de idade, juntamente com o controle de idade (14 a 15 semanas de idade) usando uma alta dose de pentobarbital (150 mg/kg) injetado através da rota intraperitoneal. Nenhum batimento cardíaco detectável confirma a morte dentro de 2-5 minutos.
    2. Enuclear o olho fazendo incisões usando uma lâmina de bisturi nas regiões nasais e temporais do olho. E....

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Results

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Histologia da retina
Na retina diabética, as células da retina sofrem degeneração. Além disso, a espessura das camadas de retina aumenta devido ao edema22. As imagens obtidas após a coloração de Hematoxilina e Eosina podem ser usadas para contagem de células e medição da espessura de diferentes camadas, como mostrado na Figura 2 usando ImageJ.

Ensaio de quebra da barreira de retina sanguínea
À medida .......

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Discussion

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Histologia
A histologia retinária é realizada para visualizar as alterações morfológicas das células e camadas da retina. Várias etapas, incluindo escolha de solução fixativa, duração de fixação, desidratação e impregnação de parafina, precisam ser otimizadas. O tamanho do tecido não deve exceder 3 mm, pois a penetração fixa torna-se lenta. O paraformaldeído de 4% comumente utilizado leva ao descolamento da retina mesmo no olho saudável devido à osmolaridade relativamente alta da solução em comparação.......

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Disclosures

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgements

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Os autores gostariam de reconhecer o Conselho Indiano de Pesquisa Médica (ICMR; ITR-2020-2882) para apoio de financiamento ao Dr. Nirmal J. Gostaríamos também de agradecer à University Grant of Commission por fornecer bolsa de pesquisa júnior a Manisha Malani e ao Centro de Laboratórios Analíticos Centrais, BITS-Pilani, campus hyderabad por fornecer instalações de infraestrutura.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Histologia
Reagentes
IsofluranoAbbottAgente anestésico
Cloridrato de cetaminaTroikaa PharmaceuticalsAgente anestésico
XilazinaIndian Immunologicals LimitedAgente anestésico
Pentobarbital sódicoZora PharmaAgente eutanésia
Solução fixadora (1% de formaldeído, 1,25% de glutaraldeídoHiMedia, AvraMB059, ASG2529Etanol preparado internamente
HaymanF204325Desidratação
XilenoHiMediaMB-180Limpeza de etanol ou parafina
Cera de parafinaHiMediaGRM10702usado para incorporar tecido
GlicerolHiMediaTC503Para preparar lâminas revestidas de albumina. O glicerol e a albumina do ovo são misturados na proporção de 1:1 para revestir as lâminas
Ácido clorídricoSisco Research laboratories Pvt. Ltd.65955Para preparação de álcool ácido a 1 %
Ácido acéticoHiMediaAS119Para preparação de eosina
Água ScottsLeica3802900Reagente azulado
Solução de Papanicolaou 1b Solução de hematoxilinaSigma1.09254.0500Coloração de núcleos
EosinaHiMediaGRM115Coloração de citoplasma, solução a 0,25 % foi preparada mídia interna
DPX MountantSigma6522Visualização e proteção de seções retinianas
Equipamentos
GlasswareBorosil
Pinça de córneaStephens InstrumentsS5-1200Dissecção
Pinça ColibriStephens InstrumentsS5-1135Dissecção
Micro tesouracurvada Stephens InstrumentsS7-1311Dissecção
Vannas scissorStephens InstrumentsS7-1387Dissecção
Tesoura de írisStephens InstrumentsS7-1015
HiMediaPW1292Para segurar o tecido durante o processamento da histologia
Banho-mariaGT SonicGT Sonic-D9Manutenção da temperatura
Estação de incorporação de parafinaMyrEC 350Preparação de blocos de parafina
MicrótomoZhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.YD-335ALâminas de corte
LeicaLeica 818Lâminas de corte
HiMediaBG005Segurando seções de tecido de parafina
LamínulasHiMediaBG014CPara cobrir o tecido após a adição de mídia de montagem
Blood Retinal Barrier breakbreak
Reagents
IsofluranoAbbottB506Anestesia
Gelo secoNão aplicávelNão aplicávelDissecção
Reagente de BradfordSigmaB6916Quantificação de
proteínasEquipamentos
Pinça de córneaStephens InstrumentsS5-1200Dissecção
Pinça ColibriStephens InstrumentsS5-1135Dissecção
Micro tesoura curvaStephens InstrumentsS7-1311Dissecção
Vannas tesouraStephens InstrumentsS7-1387Dissecção
Íris tesouraStephens InstrumentsS7-1015Dissecção
VidrariaBorosilNão aplicável
Tubos revestidos com EDTAJ.KDiagnostics Não aplicávelSeparar plasma de sangue total
Tubos de homogeneizaçãoMP BiomedicalsSKU: 115076200-CFHomogeneização de tampas de
homogeneizaçãoMP BiomedicalsSKU: 115063002-CFHomogeneização de esferas de vidro vítreas
MP BiomedicalsSKU: 116914801Homogeneização do vítreo
HomogeneizadorBertin InstrumentsP000673-MLYS0-AHomogeneização de placa vítrea de
96 poços - TransparenteGrenierGN655101Quantificação de proteínas
Leitor de placasDispositivos molecularesSpectrMax M4Medição de absorbância
CentrífugaREMICPR240 PlusAngiografia < Centrifugação
>Fluorescência
Reagentes
IsofluranoAbbottB506Anestesia
FITC-dextrano 70 kD (FITC, Dextrano, Dilaurato de Dibutilina, DMSOFITC, Dextrano e Dilaurato de Dibutilina da Sigma; DMSO de HiMediaFITC-F3651, Dextran-31390, dilaurato de dibutilina -29123, DMSO-TC185Preparado internamente
FluoroshiedSigmaF6182Meio de montagem anti-desbotamento
< forte>Equipamentos< / forte>
pinça de córneaStephens InstrumentsS5-1200Pinça de dissecção
ColibriStephens InstrumentsS5-1135Dissecção
Micro tesoura curvaStephens InstrumentsS7-1311Dissecção
Vannas tesouraStephens InstrumentsS7-1387Dissecção
Tesoura de írisStephens InstrumentsS7-1015Dissecção
VidrariaBorosilNão aplicável
CorrediçasHiMediaBG005Preparação de montagem plana
LamínulasHiMediaBG014CPara cobrir o tecido após a adição de meios de montagem
Microscópio confocalLeicaDMi8Visualização de montagem plana
de dissecção vítrea

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
  2. Pandova, M. G. Visual Impairment and Blindness. , IntechOpen. (2019).
  3. Mokdad, A. H., et al.

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Diabetic RetinopathyRetinal PathophysiologyRat ModelBlood Retinal BarrierRetinal HistologyFluorescence AngiographyRetinal Cell CountRetinal Flat MountProtein Leakage AssayRetinal Angiogenesis

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