Análise citométrica de fluxo de múltiplos parâmetros mitocondriais em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos e seus derivados neurais e gliais

Resumo

Este estudo relata uma nova abordagem para medir múltiplos parâmetros funcionais mitocondriais com base na citometria de fluxo e dupla coloração com dois repórteres fluorescentes ou anticorpos para detectar alterações no volume mitocondrial, potencial de membrana mitocondrial, nível de espécies reativas de oxigênio, composição da cadeia respiratória mitocondrial e DNA mitocondrial.

Resumo

As mitocôndrias são importantes na fisiopatologia de muitas doenças neurodegenerativas. Alterações no volume mitocondrial, no potencial de membrana mitocondrial (MMP), na produção mitocondrial de espécies reativas de oxigênio (ROS) e no número de cópias do DNA mitocondrial (mtDNA) são frequentemente características desses processos. Este relatório detalha uma nova abordagem baseada em citometria de fluxo para medir múltiplos parâmetros mitocondriais em diferentes tipos de células, incluindo células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) e células neurais e gliais derivadas de iPSC. Essa estratégia baseada em fluxo usa células vivas para medir o volume mitocondrial, os níveis de MMP e ROS, bem como células fixas para estimar componentes da cadeia respiratória mitocondrial (MRC) e proteínas associadas ao mtDNA, como o fator de transcrição mitocondrial A (TFAM).

Ao co-coloração com repórteres fluorescentes, incluindo MitoTracker Green (MTG), éster etílico de tetrametilrodamina (TMRE) e MitoSox Red, mudanças no volume mitocondrial, MMP e ROS mitocondrial podem ser quantificadas e relacionadas ao conteúdo mitocondrial. A dupla coloração com anticorpos contra subunidades do complexo MRC e translocase da membrana mitocondrial externa 20 (TOMM20) permite a avaliação da expressão da subunidade MRC. Como a quantidade de TFAM é proporcional ao número de cópias de mtDNA, a medição de TFAM por TOMM20 fornece uma medição indireta de mtDNA por volume mitocondrial. Todo o protocolo pode ser realizado dentro de 2-3 h. É importante ressaltar que esses protocolos permitem a mensuração de parâmetros mitocondriais, tanto no nível total quanto no nível específico por volume mitocondrial, utilizando citometria de fluxo.

Introdução

As mitocôndrias são organelas essenciais presentes em quase todas as células eucarióticas. As mitocôndrias são responsáveis pelo fornecimento de energia, produzindo trifosfato de adenosina (ATP) através da fosforilação oxidativa e atuam como intermediários metabólicos para a biossíntese e o metabolismo. As mitocôndrias estão profundamente envolvidas em muitos outros processos celulares importantes, como a geração de EROs, a morte celular e a regulação intracelular do Ca²+. A disfunção mitocondrial tem sido associada a várias doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson (DP), a doença de Alzheimer (DA), a doença de Huntington (DH), a ataxia de....

Protocolo

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais e a Tabela Suplementar S1 para obter receitas de todas as mídias e soluções usadas neste protocolo.

1. Diferenciação de iPSCs humanas em NCSs, neurônios dopaminérgicos (DA) e astrócitos

1. Preparar placas revestidas de matriz.
   1. Descongele um frasco para injetáveis de 5 ml de matriz no gelo durante a noite. Diluir 1 mL de matriz com 99 mL de F-12 (Advanced DMEM/F12) de Advanced Dulbecco (Advanced DMEM/F12) a frio (concentração final de 1%). Fazer alíquotas de 1 ml e armazená-las a -20 °C.
   2. Descongele a solução da matriz a 4 °C (mant....

Resultados

Uma descrição esquemática do método de diferenciação e das estratégias de citometria de fluxo é mostrada na Figura 3. As iPSCs humanas são diferenciadas em rosetas neurais e, em seguida, levantadas em cultura de suspensão para diferenciação em esferas neurais. As esferas neurais são ainda mais diferenciadas e amadurecidas em neurônios DA. As esferas neurais são dissociadas em células únicas para gerar astrócitos gliais, revestidas em monocamadas como NSCs e, em seguida, diferenciadas em astr.......

Discussão

Aqui estão os protocolos para gerar neurônios e astrócitos derivados de iPSC e avaliar múltiplos aspectos da função mitocondrial usando citometria de fluxo. Esses protocolos permitem a conversão eficiente de iPSCs humanas em neurônios e astrócitos gliais e a caracterização detalhada da função mitocondrial, principalmente em células vivas. Os protocolos também fornecem uma estratégia baseada em citometria de fluxo de cocoloração para adquirir e analisar múltiplas funções mitocondriais, incluindo volume, MMP e níveis de RO.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
anti-Oct4	Abcam	ab19857, RRID:AB_445175	Anticorpo Primário; use como 1:100, 10 μ L em 1000 μ Solução de coloração L; use Alexa Fluor ® 488 IgG anti-coelho de cabra (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11008) como anticorpo secundário.
anti-SSEA4	Abcam	ab16287, RRID:AB_778073	Anticorpo Primário; use como 1:100, 10 μ L em 1000 μ Solução de coloração L; use Alexa Fluor ® 594 IgG anti-camundongo de cabra (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11005) como anticorpo secundário.
anti-Sox2	Abcam	ab97959, RRID:AB_2341193	Anticorpo Primário; use como 1:100, 10 μ L em 1000 μ Solução de coloração L; use Alexa Fluor ® 488 IgG anti-coelho de cabra (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11008) como anticorpo secundário.
anti-Pax6	Abcam	ab5790, RRID:AB_305110	Anticorpo Primário; use como 1:100, 10 μ L em 1000 μ Solução de coloração L; use Alexa Fluor ® 488 IgG anti-coelho de cabra (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11008) como anticorpo secundário.
anti-Nestin	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927, RRID:AB_627994	Anticorpo Primário; use como 1:50, 20 μ L em 1000 μ Solução de coloração L; use Alexa Fluor ® 594 IgG anti-camundongo de cabra (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11005) como anticorpo secundário.
anti-GFAP	Abcam	ab4674, RRID:AB_304558	Anticorpo Primário; use como 1:100, 10 μ L em 1000 μ Solução de coloração L;   use Alexa Fluor ® 594 IgG anti-frango caprino (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11042) como anticorpo secundário.
anti-S100β   conjugado com Alexa Fluor 488	Abcam	ab196442, RRID:AB_2722596	Anticorpo Primário; use como 1:400, 2,5 μ L em 1000 μ Solução de coloração L;
anti-TH	Abcam	ab75875, RRID:AB_1310786	Anticorpo Primário; use como 1:100, 10 μ L em 1000 μ Solução de coloração L; use Alexa Fluor ® 488 IgG anti-coelho de cabra (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11008) como anticorpo secundário.
anti-Tuj 1	Abcam	ab78078, RRID:AB_2256751	Anticorpo Primário; use como 1:1000, 1 μ L em 1000 μ Solução de coloração L; use Alexa Fluor ® 594 IgG anti-camundongo de cabra (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11005) como anticorpo secundário.
anti-Sinaptofisina	Abcam	ab32127, RRID:AB_2286949	Anticorpo Primário; use como 1:100, 10 μ L em 1000 μ Solução de coloração L; use Alexa Fluor ® 488 IgG anti-coelho de cabra (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11008) como anticorpo secundário.
anti-PSD-95	Abcam	ab2723, RRID:AB_303248	Anticorpo Primário; use como 1:100, 10 μ L em 1000 μ Solução de coloração L;   use Alexa Fluor ® 594 IgG anti-frango caprino (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11042) como anticorpo secundário.
anti-TFAM conjugado com Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308	Anticorpo Primário; use como 1:400, 2.5 μ L em 1000 μ Solução de coloração L; usar IgG2b monoclonal de camundongo; Alexa Fluor® 488 como um controle de isotipo.
anti-TOMM20 conjugado com Alexa Fluor 488	Santa Cruz Biotechnology	Cat# sc-17764 RRID:AB_628381	Anticorpo Primário; use como 1:400, 2.5 μ L em 1000 μ Solução de coloração L; usar IgG2a monoclonal de camundongo; Alexa Fluor® 488 como um controle de isotipo.
anti-NDUFB10	Abcam	ab196019	Anticorpo Primário; use como 1:1000, 1 μ L em 1000 μ Solução de coloração L; use Alexa Fluor ® 488 IgG anti-coelho de cabra (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11008) como anticorpo secundário; usar IgG monoclonal de coelho como controle de isotipo.
anti-SDHA	Abcam	ab137040	Anticorpo Primário; use como 1:1000, 1 μ L em 1000 μ Solução de coloração L;   use Alexa Fluor ® 488 IgG anti-coelho de cabra (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11008) como anticorpo secundário; usar IgG monoclonal de coelho como controle de isotipo.
anti-COX IV	Abcam	ab14744, RRID:AB_301443	Anticorpo Primário; use como 1:1000, 1 μ L em 1000 μ Solução de coloração L; uso  Alexa Fluor ® 488 IgG anti-rato de cabra (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11001) como anticorpo secundário; usar IgG monoclonal de camundongo como controle de isotipo.
Activin A	PeproTech	120-14E	Ingrediente médio de diferenciação de astrócitos
ABM Basal Medium	Lonza	CC-3187	Meio basal para cultura de astrócitos
AGM SingleQuots Supplement Pack	Lonza	CC-4123	Suplemento para cultura de astrócitos
Antibiótico-Antimicótico	Thermo Fisher Scientific	15240062	Ingrediente CDM
Avançado DMEM / F-12	Thermo Fisher Scientific	12634010	Meio basal para diluir
a albumina de soro bovino	Geltrex Europa Bioproducts	EQBAH62-1000	Agente bloqueador para evitar a ligação não específica de anticorpos em ensaios de imunocoloração e ingrediente CDM
BDNF	PeproTech	450-02	neurônios DA ingrediente médio
B-27 Suplemento	Thermo Fisher Scientific	17504044	Ingrediente do meio de diferenciação de astrócitos
BD Accuri C6 Plus Citômetro de fluxo	BD Biosciences, EUA
Concentrado lipídico quimicamente definido	Thermo Fisher Scientific	11905031	Ingrediente CDM
Colagenase IV	Thermo Fisher Scientific	17104019	Reagente para dissociação suave de iPSCs humanos
CCD Microscópio Câmera Leica DFC3000 G	Leica Microsystems, Alemanha
Corning placas de cultura não tratadas	Sigma-Aldrich	CLS430589	Cultura em suspensão
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190250	Usado para uma variedade de lavagem de cultura de células
DMEM/F-12, suplemento GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	10565018	Diferenciação de astrócitos basal Médio
EDTA	Thermo Fisher Reagente	de 15575020	para dissociação suave de iPSCs humanas
Essential 8 Basal Medium	Thermo Fisher Scientific	A1516901	Meio basal para cultura de iPSC
Suplemento Essential 8 (50X)	Thermo Fisher Scientific	A1517101	Suplemento para cultura de iPSC
Proteína humana recombinante EGF	Thermo Fisher Scientific	PHG0314	Suplemento para cultura NSC
FGF-básico (AA 10– 155) Proteína Humana Recombinante	Thermo Fisher Scientific	PHG0024	Suplemento para cultura NSC
Soro Bovino Fetal	Sigma-Aldrich	12103C	Ingrediente médio
FGF-basic	PeproTech	100-18B	Ingrediente médio de diferenciação de astrócitos
FCCP	Abcam	ab120081	Elimina o potencial de membrana mitocondrial e a coloração TMRE
Sistema de aspiração de fluidos Controle BVC	Vacuubrand, Alemanha
Formaldeído (PFA) 16%	Thermo Fisher Scientific	28908	Fixação celular
Geltrex	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Usado para fixação e manutenção de iPSCs humanas
Suplemento GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061	Suplemento para cultura NSC
GDNF	Peprotech	450-10	DA neurônios meio ingrediente
Glicina	Sigma-Aldrich	G8898	Usado para bloquear o tampão
Mistura de Nutrientes F-12 do Presunto	Thermo Fisher Scientific	31765027	Meio basal para CDM
Heregulin beta-1 humano	Sigma-Aldrich	SRP3055	Meio de diferenciação de astrócitos
ingrediente Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H1399	Corar os núcleos para imagem confocal
Heracell 150i Incubadoras de CO2	Fisher Scientific, EUA
IMDM	Thermo Fisher Scientific	21980032	Meio basal para CDM
Insulina	Roche	1376497	Ingrediente CDM
InSolution Inibidor de AMPK	Sigma-Aldrich	171261	Ingrediente do meio de indução neural
Fator de crescimento semelhante à insulina-I humano	Sigma-Aldrich	I3769	Ingrediente do meio de diferenciação de astrócitos
KnockOut DMEM/F-12 meio	Thermo Fisher Scientific	12660012	Meio basal para cultura NSC
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020	Promove a fixação e o crescimento de células neurais in vitro
Microscópio confocal Leica TCS SP8 STED	Leica Microsystems, Alemanha
Monotioglicerol	Sigma-Aldrich	M6145	CDM ingrediente
MitoTracker Green FM	Thermo Fisher Scientific	M7514	Usado para indicador de volume mitocondrial
MitoSox Red	Thermo Fisher Scientific	M36008	Usado para indicador de ROS mitocondrial
N-Acetil-L-cisteína	Sigma-Aldrich	A7250	Neural ingrediente médio de indução
N-2 Suplemento	Thermo Fisher Scientific	17502048	Ingrediente médio de diferenciação de astrócitos
Soro de cabra normal	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Usado para bloquear o tampão
Agitadores orbitais - SSM1	Stuart Equipment, solução de
	Sigma-Aldrich	P4957	Promove a fixação e o crescimento de células neurais in vitro
Bromidrato de poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	P7405	Promove a fixação e o crescimento de células neurais in vitro
STEMCELL	Purmorlamina	72204	Promove a diferenciação de neurônios DA
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	Montagem da lamínula para imagem
confocalPBS 1x	Thermo Fisher Scientific	18912014	Usado para uma variedade de lavagem
Recombinante Humano / Rato FGF-8b Proteína R	& D Systems	423-F8-025/CF	Promove a diferenciação de neurônios DA
SB 431542	Tocris Bioscience	TB1614-GMP	Indução Neural Ingrediente
médio StemPro Suplemento Neural Thermo	Fisher Scientific	A10508-01	Suplemento para cultura NSCs
Enzima TrypLE Express Thermo	Fisher Scientific	12604013	Reagente de dissociação celular
Transferrina	Roche	652202	ingrediente CDM
TRITON X-100	VWR International	9002-93-1	Usado para permeabilização de células em ensaios de imunocoloração
TMRE	Abcam	ab113852	Usado para coloração de potencial de membrana mitocondrial Banho-maria
Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments	Grant Instruments, EUA

Científico poli-L-ornitina do Reino Unido Tecnologias de