Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ניתוח ציטומטרי של זרימה של פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם ונגזרותיהם העצביות והגליליות

Published: November 8, 2021 doi: 10.3791/63116
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3,4, 1,2, 1,2
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 3Department of Neurosurgery, Qilu Hospital and Institute of Brain and Brain-Inspired Science, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 4Shandong Key Laboratory of Brain Function Remodeling
* These authors contributed equally

Summary

מחקר זה מדווח על גישה חדשנית למדידת פרמטרים תפקודיים מיטוכונדריאליים מרובים המבוססים על ציטומטריה של זרימה והכתמה כפולה עם שני מדווחים פלואורסצנטיים או נוגדנים כדי לזהות שינויים בנפח המיטוכונדריה, פוטנציאל קרום המיטוכונדריה, רמת מיני חמצן תגובתי, הרכב שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית ודנ"א מיטוכונדריאלי.

Abstract

מיטוכונדריה חשובים בפתופיזיולוגיה של מחלות נוירודגנרטיביות רבות. שינויים בנפח המיטוכונדריה, בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (MMP), בייצור מיטוכונדריאלי של מיני חמצן תגובתי (ROS) ובמספר העתק הדנ"א המיטוכונדריאלי (mtDNA) הם לעתים קרובות מאפיינים של תהליכים אלה. דו"ח זה מפרט גישה חדשנית המבוססת על ציטומטריה של זרימה למדידת פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים בסוגי תאים שונים, כולל תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSCs) ותאי עצב וגליה שמקורם ב-iPSC. אסטרטגיה מבוססת זרימה זו משתמשת בתאים חיים למדידת נפח המיטוכונדריה, MMP ורמות ROS, כמו גם בתאים קבועים כדי להעריך רכיבים של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית (MRC) וחלבונים הקשורים ל-mtDNA כגון גורם שעתוק מיטוכונדריאלי A (TFAM).

על ידי צביעה משותפת עם כתבים פלואורסצנטיים, כולל MitoTracker Green (MTG), טטרה-מתילרהודאמין אתיל אסטר (TMRE) ו-MitoSox Red, ניתן לכמת שינויים בנפח המיטוכונדריה, ב-MMP וב-ROS המיטוכונדריאלי וקשורים לתכולת המיטוכונדריה. צביעה כפולה עם נוגדנים כנגד תת-יחידות מורכבות של MRC וטרנסלוקאז של קרום מיטוכונדריאלי חיצוני 20 (TOMM20) מאפשרת הערכה של ביטוי תת-יחידות MRC. מכיוון שכמות ה-TFAM פרופורציונלית למספר העותקים של mtDNA, המדידה של TFAM ל-TOMM20 נותנת מדידה עקיפה של mtDNA לכל נפח מיטוכונדריאלי. הפרוטוקול כולו יכול להתבצע תוך 2-3 שעות. חשוב לציין שפרוטוקולים אלה מאפשרים מדידה של פרמטרים מיטוכונדריאליים, הן ברמה הכוללת והן ברמה הספציפית לכל נפח מיטוכונדריאלי, באמצעות ציטומטריה של זרימה.

Introduction

מיטוכונדריה הם אברונים חיוניים הנמצאים כמעט בכל התאים האאוקריוטים. המיטוכונדריה אחראים על אספקת האנרגיה על ידי ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP) באמצעות זרחון חמצוני ומשמשים כמתווכים מטבוליים לביוסינתזה ולחילוף חומרים. המיטוכונדריה מעורבת עמוקות בתהליכים תאיים חשובים רבים אחרים, כגון ייצור ROS, מוות של תאים וויסות תוך-תאישל Ca 2+. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה נקשר למחלות נוירודגנרטיביות שונות, כולל מחלת פרקינסון (PD), מחלת אלצהיימר (AD), מחלת הנטינגטון (HD), אטקסיה של פרידריך (FRDA) וטרשת אמיוטרופית צידית (ALS)1. גם תפקוד לקוי מוגבר של המיטוכונדריה וחריגה ב-mtDNA נחשבים כתורמים להזדקנות האנושית 2,3.

סוגים שונים של תפקוד לקוי של המיטוכונדריה מתרחשים במחלות נוירודגנרטיביות, ושינויים בנפח המיטוכונדריה, דה-פולריזציה של MMP, ייצור ROS ושינויים במספר עותק mtDNA נפוצים 4,5,6,7. לכן, ליכולת למדוד תפקודים מיטוכונדריאליים אלה ואחרים יש חשיבות רבה כאשר חוקרים את מנגנוני המחלה ובודקים גורמים טיפוליים פוטנציאליים. יתר על כן, לאור היעדרם של מודלים חייתיים המשכפלים נאמנה מחלות נוירודגנרטיביות אנושיות, הקמת מערכות מודל in vitro מתאימות המשחזרות את המחלה האנושית בתאי המוח היא צעד חשוב לקראת הבנה טובה יותר של מחלות אלה ופיתוח טיפולים חדשים 2,3,8,9.

ניתן להשתמש בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים כדי ליצור תאי מוח שונים, כולל תאים עצביים ולא עצביים (כלומר, תאי גליה), ונזק מיטוכונדריאלי הקשור למחלות נוירודגנרטיביות נמצא בשני סוגי התאים 3,10,11,12,13. שיטות מתאימות להתמיינות iPSC לשושלות עצביות וגליאליות זמינות14,15,16. תאים אלה מספקים פלטפורמה ייחודית לבני אדם/מטופלים למידול מחלות במבחנה ולבדיקת תרופות. יתר על כן, מכיוון שאלה נגזרים מחולים, נוירונים שמקורם ב- iPSC ותאי גליה מספקים מודלים של מחלות המשקפים את מה שקורה בבני אדם בצורה מדויקת יותר.

נכון להיום, קיימות מעט שיטות נוחות ואמינות למדידת פרמטרים תפקודיים מיטוכונדריאליים מרובים בתאי גזע פלוריפוטנטיים, במיוחד תאי עצב חיים ותאי גלייה. השימוש בציטומטריה של זרימה מספק למדען כלי רב עוצמה למדידת פרמטרים ביולוגיים, כולל תפקוד מיטוכונדריאלי, בתאים בודדים. פרוטוקול זה מספק פרטים ליצירת סוגים שונים של תאי מוח, כולל תאי גזע עצביים (תאי גזע עצביים), נוירונים ואסטרוציטים גליאליים מתאי גזע פלוריפוטנטיים, כמו גם גישות חדשניות המבוססות על ציטומטריה של זרימה למדידת פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים בסוגי תאים שונים, כולל iPSCs ותאי עצב וגליה שמקורם ב-iPSC. הפרוטוקול מספק גם אסטרטגיית צביעה משותפת לשימוש בציטומטריה של זרימה למדידת נפח המיטוכונדריה, MMP, רמת ROS מיטוכונדריאלית, מתחמי MRC ו- TFAM. על ידי שילוב מדדים של נפח או מסה מיטוכונדריאלית, פרוטוקולים אלה מאפשרים גם מדידה של הרמה הכוללת והרמה הספציפית לכל יחידת מיטוכונדריה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: עיין בטבלת החומרים ובטבלה המשלימה S1 לקבלת מתכונים של כל המדיות והפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.

1. התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) אנושיים לתאי NCS, נוירונים דופמינרגיים (DA) ואסטרוציטים

  1. הכינו צלחות מצופות מטריצה.
    1. להפשיר בקבוקון של 5 מ"ל של מטריקס על קרח לילה. יש לדלל 1 מ"ל של מטריצה עם 99 מ"ל של ה-F-12 של הנשר המתוקן של דולבקו (DMEM/F12 מתקדם) (ריכוז סופי של 1%). הפוך 1 מ"ל aliquots ולאחסן אותם ב -20 °C (70 °F).
    2. הפשירו את תמיסת המטריצה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (שמרו על קור) וציפו 6 בארות (1 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות).
    3. מניחים את הלוח המצופה במטריצה באינקובטור אווירלח של 5% CO 2/95% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. הוציאו את הצלחת מהאינקובטור ותנו לה להתאזן לטמפרטורת החדר (RT).
      הערה: מומלץ להשתמש בצלחת תוך 3 ימים מיום הציפוי. עם זאת, צלחת מצופה ניתן לאחסן עד 2 שבועות ב 4 מעלות צלזיוס. רק זכרו להוציא אותו ולתת לו להתחמם ל-RT לפני השימוש. לאחסון ממושך, הוסיפו 1 מ"ל של מדיום תרבית iPSC לצלחת המצופה כדי למנוע ייבוש של המטריצה.
  2. הפשרת תאי גזע פלוריפוטנטיים
    1. מחממים את הלוחות המצופים במטריצה ב-RT או באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות. יש לחמם מראש את הכמות הנדרשת של מדיום תרבות iPSC ב-RT.
    2. יש לערבב 6 מ"ל של מדיום תרבית iPSC שחומם מראש עם 12 μL של מעכב Y-27632 ROCK כדי לקבל ריכוז סופי של 10 מיקרומטר.
    3. הפשירו חלקית את הבקבוקון הקפוא של iPSCs בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עד שתישאר חתיכת קרח קטנה.
    4. הוסיפו באיטיות 1 מ"ל של תרבית iPSC שחוממה מראש עם 12 μL של מעכב ROCK טיפה לתאים. העבירו את תכולת הנוזל של הבקבוקון באמצעות iPSCs לבאר אחת של צלחת מצופה מראש בגודל 6 מ"ל באמצעות פיפטה של 5 מ"ל.
    5. הזיזו את הצלחת בכיוונים מאונכים כדי לערבב את תכולת הבאר והחזירו את הצלחת לאינקובטור. החליפו את מדיום תרבית ה-iPSC לאחר 24 שעות לאחר שטיפה עם תמיסת מלח (DPBS) של דולבקו (1x) (Ca 2+/Mg2+-free ) (4 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות).
      הערה: אין להוסיף מעכב ROCK להאכלות הבאות. שנה את מדיום תרבות ה- iPSC מדי יום.
  3. תת-תרבות של iPSCs
    1. מחממים את הלוחות המצופים במטריצה ב-RT או באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות. יש לחמם מראש את הכמות הנדרשת של מדיום תרבות iPSC ב-RT.
    2. שאפו את מדיום התרבית מהצלחות המכילות את התאים. שטפו את תאי ה-iPSCs עם DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free ) (4 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות).
    3. מוסיפים EDTA (0.5 מ"מ) (1 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות). דוגרים את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס עד ששולי המושבות מתחילים להתרומם מהבאר (בדרך כלל 3-5 דקות). שאפו את ה- EDTA.
    4. הוסיפו מדיום תרבית iPSC שחומם מראש (4 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות) ונתקו בכוח את מושבות ה-iPSC באמצעות פיפטה סטרילית של 10 מ"ל פעם אחת. אין לבצע פיפטה למעלה ולמטה מכיוון שהדבר עלול לשבור גושים של תאים לתאים בודדים.
    5. מעבירים את תכולת כל באר לשתי בארות נפרדות בצלחת 6 בארות מצופה מטריצה (2 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות) ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. אין ליצור בועות בהשעיה בזמן הפיפטציה.
      הערה: נערו את הצלחת בעדינות לפני שתשמרו אותה באינקובטור. יחס הפיצול יכול להיות 1:2 (באר אחת ל-2 בארות חדשות) ל-1:4 (אחת ל-4 בארות חדשות).
    6. החליפו את המדיום מדי יום עד שהמושבות יגיעו למפגש של 60% עם גודל וחיבורים טובים.
  4. אינדוקציה עצבית ויצירת אבות עצביים
    1. הכן 500 מ"ל של מדיום מוגדר כימית (CDM), 500 מ"ל של מדיום אינדוקציה עצבית (NIM), ו-500 מ"ל של מדיום ללא סרום תאי גזע עצביים (NSC SF).
    2. יש לשטוף את התאים עם DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free) (4 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות) ולהוסיף NIM (3 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות). מוגדר כיום 0.
    3. החלף את ה- NIM (3 מ"ל לבאר בלוח של 6 בארות) ביום 1, יום 3 ויום 4 והתבונן מתחת למיקרוסקופיה מדי יום.
    4. ביום החמישי, נתקו את הרוזטות העצביות לתרבית מתלים כמתואר להלן.
      1. יש לשטוף פעם אחת בעדינות עם DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free) (4 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות). מוסיפים קולגן IV (1 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות) ושומרים באינקובטור למשך דקה אחת. שאפו את הקולגן IV ושטפו פעם אחת עם DPBS (1x) (4 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות) בעדינות.
      2. יש להוסיף 2 מ"ל של NSC SF Medium לכל באר לצלחת של 6 בארות. נתק את התאים על ידי גירוד תחתית הבארות על ידי ציור רשתות באמצעות קצה פיפטה של 200 μL.
      3. אספו את מתלה התאים מצלחת 6 הבארות לצלחת של 10 ס"מ שאינה דבקה. השלם את עוצמת הקול ל-12 מ"ל עם NSC SF Medium.
      4. יש לנער את המנה הלא דבקה ב-65-85 סל"ד על שייקר אורביטלי באינקובטור כדי למנוע צבירה.
  5. דיפרנציאציה של תאי עצב DA
    1. ביום 7, הוסיפו 12 מ"ל של CDM בתוספת 100 ng/mL גורם גדילה פיברובלסטי-8b (FGF-8b) והניחו את המנה על השייקר האורביטלי באינקובטור.
    2. בימים 8-13, לשנות את המדיום כל 2 ימים ולהתבונן תחת מיקרוסקופיה מדי יום.
    3. ביום ה-14, יש להוסיף 12 מ"ל של CDM בתוספת 100 ננוגרם/מ"ל FGF-8b ו-1 μM פורמורפמין (PM). מניחים את המנה על השייקר האורביטלי באינקובטור.
    4. בימים 15-20, לשנות את המדיום כל 2 ימים ולבחון את התאים תחת מיקרוסקופיה מדי יום.
    5. מעבר מכני של הספירות באמצעות 1000 קצוות μL כדי לפרק את הספירות הגדולות יותר.
      הערה: היחס יכול להיות 1:2 (מנה אחת לתוך 2 מנות חדשות).
  6. הפסקת ההבחנה
    1. מצפים צלחת בת 6 בארות או מכסים בפולי-ל-אורניתין (אש"ף) ולמינין כמתואר להלן.
      1. מצפים צלחת של 6 בארות עם 1 מ"ל אש"ף לכל באר, ומדגרים את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לשאוף לפתרון אש"ף.
      2. יש לעקר את הצלחת תחת UV למשך 20 דקות. שטפו את הבארות פעמיים עם DPBS (1x) (4 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות).
      3. יש להוסיף תמיסת למינין של 5 מיקרוגרם/מ"ל (1 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות) ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים. שאפו את הלמינין ושטפו את הבארות לזמן קצר עם DPBS (1x) (4 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות) פעם אחת לפני הציפוי.
    2. אסוף את כל הכדורים (משלב 1.5.5) בצינורות של 50 מ"ל ומלא DPBS (1x). סובבו ב-300 × גרם למשך 5 דקות. שאפו את הסופר-נטנט.
    3. דגירה עם 2 מ"ל של מגיב דיסוציאציה של תאים (ראו טבלת חומרים) במשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס באמבט מים ואחריו טריטורציה עדינה עם פיפטה של 200 μL (20-50 פעמים בהתאם לגודל הכדורים, הימנעות מהיווצרות בועות).
    4. נטרול מגיב הדיסוציאציה של התאים עם 2 מ"ל של מדיום הנשר המתוקן (DMEM) של דולבקו עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) וצנטריפוגה של 50 מ"ל חרוטית המכילה את התאים ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-RT. שאפו את הסופר-נט.
    5. הוסף 1 מ"ל של CDM בתוספת 10 ng/mL גורם נוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF) ו-10 ng/mL גורם נוירוטרופי שמקורו בקו תאי גליה (GDNF) כדי להשהות מחדש את כדורי התא על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה כדי לקבל תרחיפים חד-תאיים.
    6. שאפו את תמיסת הלמינין מהצלחת (שלב 1.6.1.3), שטפו לזמן קצר ב-DPBS (1x) (4 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות), וזרעו את התאים (משלב 1.6.5) בלוחות המצופים מראש או בכיסויים ב-3 מ"ל CDM בתוספת 10 ננוגרם/מ"ל BDNF ו-10 ננוגרם/מ"ל GDNF. להאכיל את התאים כל 4 ימים.
      הערה: ניתן לשמור על תרבויות מבדילות במשך שבועות רבים עד 3 חודשים. המורפולוגיה העצבית מופיעה בדרך כלל לאחר שבועיים של סיום וניתן להשתמש בה לניתוחים במורד הזרם מנקודה זו ואילך. BDNF ו- GDNF אינם נחוצים לגידול לתחזוקה ארוכה יותר (עד חודשיים).
  7. דור המל"ל
    1. צלחות מטריצת מעיל.
    2. אסוף את כל הכדורים העצביים (שנוצרו משלב 1.4) בצינורות של 50 מ"ל ומלא DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free). סובבו ב-300 × גרם למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטים.
    3. לדגום את הכדורים עם 2 מ"ל של מגיב דיסוציאציה התא במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים, ואחריו טריטורציה עדינה עם פיפטה 200 μL (20-50 פעמים בהתאם לגודל של כדורים, הימנעות היווצרות בועה).
    4. נטרל עם 2 מ"ל של DMEM עם 10% FBS וצנטריפוגה של 50 מ"ל צינורות חרוטיים המכילים את התאים ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב RT. לשאוף את supernatants. השהה את כדורי התא על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה כדי לקבל מתלים חד-תאיים.
    5. שאפו את תמיסת המטריצה מצלחת מצופה מראש וזרעו את התאים בלוחות המצופים מראש ב- NSC SF Medium (3 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות). מזינים את התאים כל 2-3 ימים ומפצלים את התאים כאשר הם נפגשים.
      הערה: משלב זה ואילך, ניתן להרחיב ולהקפיא תאי גזע עצביים כלפי מטה.
  8. הבחנה של גליה אסטרוציטים
    1. התמיינות אסטרוציטים מ- NSCs
      1. הכן 500 מ"ל של מדיום הבחנה אסטרוציטים.
      2. זרעים של NSCs על צלחות/כיסויים מצופים פולי-D-ליזין (PDL) עם מדיום NSC SF.
      3. למחרת, יש לשטוף את התאים ב-DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free) (4 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות) ולהוסיף מדיום התמיינות אסטרוציטים (3 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות). מוגדר כיום 0.
      4. התבונן ב- NSCs מתחת למיקרוסקופ מדי יום והחלף את מדיום ההבחנה של אסטרוציטים (3 מ"ל לבאר בלוח 6 בארות) כל יומיים מימים 1 עד 27.
    2. הבשלת אסטרוציטים
      1. הכן מדיום התבגרות אסטרוציטים.
      2. ביום 28, יש לשטוף את התאים ב-DPBS (1x) (4 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות) ולהוסיף מדיום התבגרות אסטרוציטים (3 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות).
      3. ביום 29 ואילך, התבונן בתאים שמתחת למיקרוסקופ מדי יום והחלף את מדיום ההבשלה של אסטרוציטים (3 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות) כל יומיים.
      4. לאחר חודש של התבגרות, הרחיבו את התאים והקפיאו אותם משלב זה ואילך.
        הערה: במהלך שלב זה, מספר התאים יגדל. בעת פיצול התאים, כיסויים מצופים PDL אינם נחוצים לתרבות.

2. אפיון תאים על ידי אימונוציטוכימיה וצביעת אימונופלואורסצנציה

  1. בתום תקופת התרבית, מעבירים את הכיסויים עם התאים לצלחת של 12 בארות.
    שטפו את התאים בתמיסת מלח (PBS) (1x) פעמיים ודגרו במשך 10 דקות ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) (0.5 מ"ל לבאר בצלחת של 12 בארות) ב-RT.
    הערה: ניתן לכסות את הדגימה הקבועה ב-2 מ"ל של PBS (1x) ולאחסן אותה בטמפרטורה של 4°C עד שתידרש לטיפול חיסוני. PFA הוא רעיל וחשוד כגורם לסרטן. למנוע חשיפה לעור ולעיניים, ולעבוד תחת מכסה אדים כימיים.
  2. לחסום ולחדור את התאים ולדגור עם מאגר חוסם המכיל PBS (1x), 0.3% טריטון X-100, ו 10% סרום עזים רגיל במשך שעה אחת ב- RT.
  3. דגירה עם נוגדנים ראשוניים בחסימת חיץ לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס: iPSCs כתומים עם גורם שעתוק אנטי-אוקטמר-קושר 4 (Oct4) ואנטיגן עוברי ספציפי אנטי-שלב (SSEA4), NSCs עם אזור אנטי-קובע מין Y box-2 (Sox2) ואנטי-נסטין, כדורים עצביים עם קופסה-6 אנטי-זוגית (Pax6) ואנטי-נסטין, אסטרוציטים עם חלבון חומצי אנטי-גליאלי (GFAP) ואנטי-S100 חלבון קושר סידן β (S100β), ונוירוני DA עם אנטי-טירוזין הידרוקסילאז (TH), אנטי-β III טובולין (Tuj 1), אנטי-סינפטופיסין ואנטי-PSD-95 (0.5 מ"ל של תמיסת נוגדנים ראשונית לכל באר בלוח של 12 בארות; לפרטים ראו טבלת חומרים ).
  4. שטפו את הדגימות עם PBS (1x) שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחת עם נדנדה עדינה.
  5. דגירה עם תמיסת נוגדנים משנית (1:800 בחיץ חוסם, 0.5 מ"ל של תמיסת נוגדנים משנית Alexa Fluor לכל באר בצלחת של 12 בארות) במשך שעה אחת ב-RT עם נדנדה עדינה.
  6. דגרו על התאים עם Hoechst 33342 (1:5,000, 0.5 מ"ל לבאר בצלחת של 12 בארות) ב-PBS (1x) למשך 15 דקות ב-RT כדי לסמן את הגרעינים.
  7. הרכב את התאים עם הרכבה בינונית ויבש במשך הלילה ב- RT להדמיה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בחושך. ראה איור משלים S1 עבור ההגדרות והפרמטרים של המיקרוסקופ.

3. מדידת ציטומטריה של זרימה של נפח המיטוכונדריה, MMP ו-ROS מיטוכונדריאלי בתאים חיים

  1. זרעו את התאים בנפרד ל-4 בארות בצלחת של 6 בארות עד שהתאים מגיעים למפגש של 50%-60%. תייג את ארבע הבארות האלה כ-#1, #2, #3 ו-#4.
  2. בסוף תקופת התרבית, הכינו 5 תמיסות צביעה בודדות (500 μL לבאר בצלחת של 6 בארות) כדלקמן: #1 רק מדיום תרבית (לבאר #1 המכיל רק תאים לבקרה); #2-1 המכיל FCCP (100 μM); #2-2 המכיל FCCP (100 μM) + TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) במדיום תרבית; #3 המכיל TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) במדיום תרבות; #4 המכיל MitoSox אדום (10 μM) + MTG (150 ננומטר) ב- PBS (1x) עם 10% FBS. ראו איור 1A, טבלה משלימה S2 וטבלת חומרים לקבלת פרטים על תרכובות אלה ועל מערך הציטומטריה של הזרימה.
    הערה: השתמש במדיום התרבית כדי להכין את תמיסת הצביעה. חמם את המדיום ואת ה-PBS (1x) ב-RT לפני השימוש. FCCP הוא רעיל; למנוע חשיפה של העור והעיניים ולעבוד תחת מכסה אדים כימיים.
  3. שאפו את המדיום מהבאר #2 והוסיפו פתרון #2-1 (FCCP בלבד). לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
  4. שאפו את המדיום מבארות #2 ו #3 והוסיפו פתרון #2-2 (FCCP + TMRE + MTG) בבאר #2 ובפתרון #3 (TMRE + MTG) ב #3. דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
  5. שאפו את המדיום מהבאר #4 והוסיפו פתרון #4 (MitoSox Red + MTG). לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
  6. לשאוף את המדיום מכל הבארות. יש לשטוף עם PBS (1x) (4 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות). נתק את התאים באמצעות מגיב דיסוציאציה של 1 מ"ל (1 מ"ל לכל באר בלוח של 6 בארות) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. נטרול מגיב הדיסוציאציה של התא ב-1 מ"ל של DMEM עם 10% FBS (2 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות).
  7. לאסוף את התוכן של כל הבארות ב 15 מ"ל צינורות חרוטיים. צנטריפוגה את הצינורות ב 300 × גרם במשך 5 דקות. לשטוף את הכדורים עם PBS (1x) פעם או פעמיים.
  8. שאפו את הסופרנאטנטים אך השאירו כ-100 μL בצינורות. השהה את כדורי התא ב-300 μL של PBS (1x). העבר את התאים לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. שמור את הצינורות בחושך ב- RT.
  9. לנתח את התאים באמצעות ציטומטר זרימה (עם תצורת לייזר 3 כחול ו 1 אדום). זהה MTG במסנן 1 (FL1) באמצעות מסנן פס 530/30, TMRE במסנן 2 (FL2) באמצעות מסנן bandpass 585/40, ו- MitoSox Red במסנן 3 (FL3) באמצעות מסנן פס פס 510/580.

4. מדידת ציטומטריה של זרימה של תת-יחידות מורכבות MRC ו- TFAM בתאים קבועים

  1. בסוף תקופת התרבית, נתק את התאים (~106) על ידי הוספת מגיב הדיסוציאציה של התא; לאחר מכן, גלולה ולאסוף את התאים בצינור 15 מ"ל. לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה עם PBS (1x) פעמיים על ידי צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות.
  2. תקן את התאים ב-1.6% PFA (1 מ"ל של 1.6% PFA בצינור של 15 מ"ל) ב-RT למשך 10 דקות. לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה עם PBS (1x) פעמיים על ידי צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות.
  3. חלחלו לתאים עם 90% מתנול קר כקרח (1 מ"ל של 90% מתנול בצינור של 15 מ"ל) בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  4. חסום את הדגימות במאגר חוסם המכיל 0.3 M גליצין, 5% סרום עיזים ו-1% אלבומין בסרום בקר (BSA) - שבר V ב-PBS (1x) (1 מ"ל של מאגר חוסם בצינור של 15 מ"ל). לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה עם PBS (1x) פעמיים (כמו בשלב 3.7).
  5. דגירה של התאים עם הנוגדנים הראשוניים הבאים למשך 30 דקות: אנטי-NDUFB10 (1:1,000) למדידת תת-יחידה מורכבת I, תת-יחידה מורכבת של פלבופרוטאין אנטי-סוקסינט דהידרוגנאז תת-יחידה A (SDHA, 1:1,000) למדידת תת-יחידה מורכבת II ואנטי-COX IV (1:1,000) למדידת תת-יחידה מורכבת IV, ונוגדן אנטי-TFAM מצומד לאלקסה פלואור 488 (1:400). הכתימו את אותו מספר תאים בנפרד עם נוגדן anti-TOMM20 מצומד עם Alexa Fluor 488 (1:400) למשך 30 דקות (1 מ"ל של תמיסת נוגדנים ראשונית בצינור של 15 מ"ל; ראו טבלת חומרים לפרטים על הנוגדנים).
  6. לשטוף את התאים עם PBS (1x) פעם אחת עם צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות. הוסף נוגדן משני (1:400) לצינורות של NDUFB10, SDHA ו- COX IV ודגירה של התאים עם פתרונות אלה למשך 30 דקות.
  7. לשטוף את התאים עם PBS (1x) פעם אחת על ידי צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטים, והשאירו כ-100 μL בצינורות. השהה את כדורי התא ב-300 μL של PBS (1x). העבירו את התאים לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל המוחזקים בחושך על קרח.
  8. לנתח את התאים על ציטומטר זרימה (עם תצורת לייזר 3 כחול ו 1 אדום). זהה אותות במסנן 1 (FL1) באמצעות מסנן פס 530/30. ראה איור משלים S2 עבור ההגדרות והפרמטרים של המיקרוסקופ.

5. רכישה וניתוח של ציטומטריה של זרימה

  1. השתמש בצינור הבקרה שאינו מוכתם כדי להגדיר את חלקות הפיזור הקדמיות (FSC-A) ואזור הפיזור הצדדי (SSC-A) בהתבסס על הגודל והמורכבות של אוכלוסיית התאים שנותחו. ראה איור משלים S2 עבור ההגדרות והפרמטרים של המיקרוסקופ.
    הערה: הגדר פקדים שאינם מוכתמים עבור סוגי תאים בודדים.
  2. השתמש בצינורות הבקרה שאינם כתמים כדי לבחור את השערים החיוביים, והשתמש בצינורות בקרה בצבע יחיד כדי לפצות על החפיפה הספקטרלית הפלואורסצנטית בין MTG (פלואורופור-1 [FL-1]) ו- TMRE (FL-2) בציטומטריית זרימה צבעונית. השתמש בבקרת איזוטיפ לבקרה שלילית כדי לנטר כתמי רקע בדגימות MRC ו- TFAM. השתמש בצינור FCCP כבקרת דה-פולריזציה לצביעת TMRE.
  3. שער החוצה פסולת חיצונית כדי לבחור תאים חיים ואת המעטפת העיקרית מחלקת הפיזור הקדמית והצדדית (איור 2A). שער החוצה כפילים באמצעות גובה פיזור קדימה (FSC-H) לעומת (לעומת) FSC-A מתווה צפיפות כדי לא לכלול כפילים וגם לבנות גובה פיזור צדדי (SSC-H) לעומת תרשים SSC-A (איור 2A).
  4. איסוף נתונים (ציטומטר זרימה)
    1. באמצעות שימוש בדגימות לא מוכתמות או איזוטיפיות כבקרה שלילית, צור שער מעל האוכלוסייה העיקרית של האירועים החד-תאיים תוך כדי צפייה ב-SSC-A ובמסננים השונים (FL1, FL2, FL3, FL4) (איור 1B ואיור 2B).
  5. ניתוח נתונים (תוכנת CFlow)
    1. העתיקו את מיקום השערים על דגימות התאים המוכתמים, ותעדו את כמות התאים המוכתמים חיובית עבור הכתמים החיוביים.
    2. עבור כל תת-אוכלוסייה של תא, בחר תרשים היסטוגרמה ונתח את עוצמת הפלואורסצנציה החציונית (MFI) של ערוצי הסינון השונים (FL1, FL2, FL3, FL4) (ציר x).
      1. חשב את רמות TMRE על ידי הפחתת ה- MFI של FL2 של #2 תאים שטופלו ב- FCCP מה- MFI של FL2 מדגימות מוכתמות ב- TMRE #3 בהיסטוגרמה, כמו ב- Eq (1) להלן.
        רמות TMRE = MFI של FL2 מתוך #3 דגימות מוכתמות TMRE - MFI של FL2 של #2 תאים מטופלים FCCP (1)
      2. חשב את הערכים הספציפיים עבור MMP ו- ROS מיטוכונדריאלי על ידי MFI ב- TMRE או ב- MitoSox Red, תוך חלוקת מחוון נפח המיטוכונדריה MTG.
      3. חשב את הערך הספציפי עבור תת-יחידה מורכבת ו- TFAM באמצעות MFI בביטוי מרוכב או TFAM, חלוקת מחוון נפח המיטוכונדריה TOMM20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תיאור סכמטי של שיטת ההתמיינות והאסטרטגיות הציטומטריות של הזרימה מוצג באיור 3. תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מובחנים לרוזטות עצביות ואז מורמים לתרבית תרחיף לצורך התמיינות לתחומים עצביים. התחומים העצביים מובחנים עוד יותר ומבשילים לנוירוני DA. הכדורים העצביים מפורקים לתאים בודדים כדי ליצור אסטרוציטים גליאליים, מצופים מחדש במונו-שכבות כתאי גזע עצביים, ולאחר מכן מתמיינים לאסטרוציטים. פרוטוקול זה מספק את האסטרטגיות הדרושות לרכישה וניתוח של הדגימות על ידי ציטומטריה של זרימה למדידת MMP, נפח מיטוכונדריאלי, רמות ROS מיטוכונדריאליות, רמות ביטוי של תת-יחידות מורכבות MRC ו- TFAM (מדידה עקיפה של מספר עותק mtDNA יחסי). באופן ספציפי, צביעה משותפת עם כתבים פלואורסצנטיים, TMRE ו- MTG, שימשה לזיהוי וכימות שינויים ב- MMP ובנפח המיטוכונדריה. צביעה משותפת עם MitoSox Red ו-MTG מאפשרת מדידה של ייצור ROS במיטוכונדריה בתאים חיים. צביעה עם נוגדנים כנגד יחידות משנה מורכבות של MRC יחד עם TOMM20 מאפשרת הערכה של MRC והכתמה של TFAM ו- TOMM20 להערכה עקיפה של מספר עותק mtDNA. חשוב לציין ש-MTG ו-TOMM20 מאפשרים מדידה לפי נפח מיטוכונדריאלי, ומנטרלים את ההשפעה של נפח המיטוכונדריה על פרמטרים אלה.

נוירוני DA נוצרים מתאי גזע פלוריפוטנטיים באמצעות עיכוב SMAD כפול ונחשפים ל-FGF-8b ולאגוניסט PM של קיפוד סוניק (SHH), כפי שמוצג באיור 4A. iPSCs אנושיים נזרעים במדיום תרבית iPSC על צלחות מצופות מטריצה. כאשר התאים מגיעים למפגש של 50%-80%, המדיום משתנה ל-NIM באמצעות CDM בתוספת SB431542, מעכב AMPK, תרכובת C ו-N-אצטיל-ציסטאין למשך 5 ימים. לאחר 5 ימים, תאי ה-iPSCs (איור 4B, a) מתקדמים לשלב אפיתל עצבי המציג מבני רוזטה עצביים ברורים (איור 4B, b). ביום החמישי, כדורים עצביים נוצרים על ידי הרמת האפיתל העצבי לתרבית השעיה וגידולם בתווך NSC SF על שייקר מסלולי בתוך האינקובטור. כדורים עגולים ומוגדרים היטב מוצגים באיור 4B, c. ביום השביעי, המדיום משתנה ל-CDM בתוספת 100 ננוגרם/מ"ל FGF-8b. ביום ה-14, המדיום מוחלף ל-CDM בתוספת 100 ננוגרם/מ"ל FGF-8b ו-1 μM PM. ביום ה-21, הספירות מפורקות לנוירוני DA בחד-שכבתי על-ידי פירוקן לתאים בודדים וגידולן ב-CDM בתוספת 10 ננוגרם/מ"ל BDNF ו-10 ננוגרם/מ"ל GDNF באש"ף ובלוחות/כיסויים מצופים למינין. תאי עצב (איור 4B, e) שהבשילו במשך 15-30 יום משמשים גם למדידות תפקודיות מיטוכונדריאליות.

תאי גזע עצביים מיוצרים על-ידי ניתוק של כדורים עצביים לתאים בודדים ולאחר מכן ציפוי מחדש שלהם במונו-שכבות כדי ליצור אסטרוציטים. תאי גזע עצביים אלה מראים מראה אב עצבי קלאסי (איור 4B, d). NSCs בשלב זה ניתן להרחיב בקלות בנקאית לשימוש נוסף. כדי להתחיל את התמיינות האסטרוציטים, NSCs מצופים על כיסויים מצופים PDL במדיום NSC SF. למחרת, המדיום משתנה למדיום הבחנה אסטרוציטים במשך 28 ימים. לאחר 28 ימים, האסטרוציטים המובחנים מבשילים עוד יותר במדיום הבשלת אסטרוציטים. בשלב זה, אסטרוציטים אמורים להציג מורפולוגיה בצורת כוכב (איור 4B, f), וניתן להרחיב את התאים האלה ולהשתמש בהם לשימוש נוסף, כולל הערכה תפקודית מיטוכונדריאלית.

במהלך ההתמיינות, זהות התא מאושרת באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית. באיור 5A, סימני חיסון מראים שה-iPSCs מבטאים את הסמנים הפלוריפוטנטיים הספציפיים, SSEA4 ו-Oct4. איור 5B מראה שכדורים עצביים מפגינים צביעה חיובית של Nestin ו-Pax6, ואילו איור 5C מראה שתאי גזע עצביים שמקורם ב-iPSC במונו-שכבות מציגים צביעה חיובית של Nestin ו-Sox2. כדי לזהות תאי עצב מסוג DA, התאים מוכתמים באמצעות הסמן העצבי β III טובולין (Tuj 1) והסמן העצבי DA טירוזין הידרוקסילאז (TH) (איור 6B). בנוסף, תאי עצב של DA מראים כתמים עבור הסמנים הסינפטיים, סינפטופיזין ו-PSD-95, המאשרים את הקשרים הסינפטיים התפקודיים שלהם (איור 5B). בדיקה חיסונית של אסטרוציטים שמקורם ב-iPSC מראה את הביטוי של סמני האסטרוציטים, חלבון חומצי פיברילרי גליאלי (GFAP) וחלבון קושר סידן S100 β (S100β).

חקירת תפקוד המיטוכונדריה בתאי עצב מובחנים ובאסטרוציטים באמצעות ציטומטריה של זרימה מבוצעת כמתואר לעיל בסעיפים 3 ו-4 של הפרוטוקול. ציטומטר זרימה שימש לאיסוף נתונים וסמפלר CFlow לניתוח נתונים, כפי שמוצג באיור 1B.

איור 2 מדגים את השיטה לגידור תאים בודדים חיים. תאים מתים ופסולת תאים אינם נכללים בחלקת FSC לעומת SSC (איור 2A, a). כפילויות תאים אינן נכללות באמצעות תרשים FSC-H לעומת FSC-A (איור 2A, b) ואחריו עלילת SSC-H לעומת SSC-A (איור 2A, c). פלואורסצנטיות הרקע מוערכת כראוי אם משווים את האוכלוסייה השלילית של סוג תא מסוים לאוכלוסייה החיובית באותו סוג תא (איור 2B, a). עבור דגימות MMP, טיפול בתאים באמצעות FCCP מבטל הפרעות מפוטנציאל קרום המיטוכונדריה ומכתמי TMRE (איור 2B, b).

גישות ציטומטריות זרימה אלה שימשו כדי לחקור נוירוני DA שנוצרו מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים הנושאים מוטציות בתת-יחידה הקטליטית של DNA פולימראז מיטוכונדריאלי, POLG (W748S), ולהשוות אותם עם דגימות נטולות מחלות שנוצרו מפיברובלסטים של דטרויט 551. כפי שדווח קודםלכן 4, מחקר זה הדגים גם ירידה ב-MMP ועלייה ברמות ROS מיטוכונדריאליות ספציפיות בתאי עצב מסוג POLG DA (איור 7). עם זאת, נפח המיטוכונדריה, סך ה-MMP ורמת ה-ROS המיטוכונדריאלית הכוללת לא השתנו. באיור 8, התוצאות מראות ירידה ברמות הקומפלקס הספציפיות I, רמות TFAM כוללות נמוכות יותר ורמות TFAM ספציפיות, אך רמות II מורכבות ספציפיות דומות בתאי עצב DA מוטנטיים בהשוואה לקבוצת ביקורת.

גישה זו שימשה גם לחקר אסטרוציטים שנוצרו מאותם קווי iPSC. כפי שדווח קודםלכן 7 ומוצג באיור 9, התוצאות מראות כי לאסטרוציטים שעברו מוטציה ב-POLG היו MMP כולל וספציפי נמוך יותר, אך נפח מיטוכונדריאלי ו-ROS מיטוכונדריאלי דומים בהשוואה לבקרות, כמו גם רמות נמוכות יותר של קומפלקסים ספציפיים I ו-IV (איור 10). עם זאת, לא היו שינויים ברמות הכוללות של קומפלקסים I ו- IV ולא היה שינוי ברמות הכוללות והספציפיות של קומפלקס II באסטרוציטים POLG. בסך הכל, נתונים אלה מצביעים על כך שניתוח ציטומטרי של זרימה של פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים מספק קירוב צעד ראשון בעל ערך בהערכת תפקוד המיטוכונדריה בתאים כגון iPSCs ונגזרותיהם העצביות והגליאליות.

Figure 1
איור 1: הגדרה עבור ציטומטריה של זרימה. (A) MMP, נפח מיטוכונדריאלי וכתמי ROS מיטוכונדריאליים; (B) דוגמה לקליטת נתונים בציטומטר זרימה C6. קיצורים: MMP = פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי; ROS = מיני חמצן תגובתי; FCCP = קרבוניל ציאניד p-טריפלואורומתוקסיפנילהידרזון; TMRE = טטרה-מתילרהודאמין אתיל אסטר; MTG = MitoTracker ירוק. כמו כן, ראו טבלה משלימה S2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: אסטרטגיות גטינג. (א) רכישת נתונים; (B) ההיסטוגרמות של הפלואורסצנציה עם מכתים של MTG ו-TMRE בתאים חיים. קיצורים: SSC-A = אזור פיזור צדדי; FSC-A = אזור פיזור קדימה; SSC-H = גובה פיזור צד; FSC-H = גובה פיזור קדימה; FL#-A = פלואורופור # אזור; MTG = MitoTracker ירוק; FCCP = קרבוניל ציאניד p-טריפלואורומתוקסיפנילהידרזון; TMRE = טטרה-מתילרהודאמין אתיל אסטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: ייצוג סכמטי של זרימת העבודה של הפרוטוקול. קיצורים: DA = דופמינרגי; MMP = פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי; ROS = מיני חמצן תגובתי; NDUFB 10 = NADH: תת-יחידה 10 של יוביקינון אוקסידורדוקטאז; SDHA = סוקצינאט דהידרוגנאז קומפלקס פלבופרוטאין תת-יחידה A; COX IV = ציטוכרום c אוקסידאז קומפלקס IV; mtDNA = דנ"א מיטוכונדריאלי; TFAM = גורם שעתוק מיטוכונדריאלי A. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: התמיינות iPSC. (A) תרשים זרימה ו-(B) תמונות מייצגות של התאים משלבים שונים במהלך ההתמיינות, כולל iPSCs (a), רוזטה עצבית (b), כדורים עצביים (c), תאי גזע עצביים (d), נוירוני DA (e) ואסטרוציטים (f). סרגלי קנה מידה = 25 מיקרומטר. קיצורים: iPSC = תא גזע פלוריפוטנטי מושרה; NSC = תא גזע עצבי; DA = דופמינרגי; SFM = מדיום ללא סרום; CDM = מדיום מוגדר כימית; FGF-8b = גורם גדילה פיברובלסט-8b; PM = פורמורפמין; BDNF = גורם נוירוטרופי שמקורו במוח; GDNF = גורם נוירוטרופי שמקורו בקו תאי גליה; אש"ף = פולי-ל-אורניתין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: תמונות קונפוקליות מייצגות של תאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) ונגזרותיהם העצביות . (A) אימונוסטינינג של SSEA4 (אדום) ו-Oct4 (ירוק) ב-iPSCs. (B) אימונוסטינינג של נסטין (אדום) ופאקס6 (ירוק) באזורי נוירונים שמקורם ב-iPSC. (C) אימונוסטינינג של נסטין (אדום) ו-Sox2 (ירוק) בתאי גזע עצביים שמקורם ב-iPSC. גרעינים מוכתמים ב-DAPI (כחול). סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: iPSCs = תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים; תאי גזע עצביים = תאי גזע עצביים; SSEA4 = אנטיגן עוברי ספציפי לשלב-4; Oct4 = מקדם שעתוק מחייב אוקטמר 4; Pax6 = תיבה זוגית-6; Sox2 = אזור קביעת מין Y תיבה-2; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: תמונות קונפוקליות מייצגות של אסטרוציטים ותאי עצב DA שמקורם ב-iPSC . (A) חיזוק חיסוני של GFAP (אדום) ו-S100β (ירוק) באסטרוציטים שמקורם ב-iPSC. (B) חיזוק חיסוני של סמן השושלת העצבית TH (ירוק), Tuj 1 (אדום) והסמן התפקודי העצבי Synaptophysin (ירוק) ו-PSD-95 (אדום) בנוירוני DA שמקורם ב-iPSC. גרעינים מוכתמים ב- DAPI (כחול). סרגלי קנה מידה = 25 מיקרומטר. קיצורים: iPSCs = תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים; GFAP = חלבון חומצי פיברילרי גליאלי; S100β = S100 חלבון קושר סידן β; Tuj 1 = β III טובולין; PSD-95 = חלבון בצפיפות פוסט-סינפטית 95; DA = דופמינרגי; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: ניתוח ציטומטרי של זרימה עבור נוירוני DA שמקורו בשיבוט אחד של iPSCs של מטופלי POLG ושיבוט אחד של iPSCs של בקרת דטרויט 551. (A) נפח מיטוכונדריאלי שנמדד על-ידי MTG, (B) סך ה-MMP שנמדד על-ידי TMRE, (C) רמת MMP ספציפית המחושבת על-ידי סך TMRE/MTG, (D) סך ה-ROS המיטוכונדריאלי שנמדד על-ידי MitoSox Red, ו-(E ) רמת ROS מיטוכונדריאלית ספציפית המחושבת על ידי סך הכל MitoSox Red / MTG. הנתונים מוצגים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM) עבור מספר הדגימות (n ≥ 3 לכל שיבוט). הנתונים נותחו והופקו באמצעות תוכנת GraphPad Prism. מבחן Mann-Whitney U שימש להערכת מובהקות סטטיסטית עבור משתנים. המשמעות מסומנת עבור P < 0.05. *P < 0.05; ns, לא משמעותי. קיצורים: DA = דופמינרגי; POLG = DNA פולימראז תת-יחידה גמא; iPSCs = תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים; MMP = פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי; ROS = מיני חמצן תגובתי; MTG = MitoTracker ירוק; TMRE = טטרה-מתילרהודאמין אתיל אסטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 8
איור 8: ניתוח ציטומטרי של זרימה עבור אסטרוציטים שמקורו בשיבוט אחד של iPSCs של מטופלי POLG ושיבוט אחד של iPSCs של בקרת דטרויט 551. (A) נפח מיטוכונדריאלי שנמדד על-ידי MTG, (B) סך ה-MMP שנמדד על-ידי TMRE, (C) רמת MMP ספציפית המחושבת על-ידי סך TMRE/MTG, (D) סך ה-ROS ROS המיטוכונדריאלי שנמדד על-ידי MitoSox Red, ו-(E ) רמת ROS מיטוכונדריאלית ספציפית המחושבת על ידי סך הכל MitoSox Red / MTG. הנתונים מוצגים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM) עבור מספר הדגימות (n ≥ 3 לכל שיבוט). הנתונים נותחו והופקו באמצעות תוכנת GraphPad Prism. מבחן Mann-Whitney U שימש להערכת מובהקות סטטיסטית עבור משתנים. המשמעות מסומנת עבור P < 0.05. *P < 0.05; ns, לא משמעותי. קיצורים: POLG = DNA פולימראז תת-יחידה גמא; iPSC = תא גזע פלוריפוטנטי מושרה; MMP = פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי; ROS = מיני חמצן תגובתי; MTG = MitoTracker ירוק; TMRE = טטרה-מתילרהודאמין אתיל אסטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 9
איור 9: ניתוח ציטומטרי של זרימה עבור נוירוני DA שמקורו בשיבוט אחד של iPSCs של מטופלי POLG ושיבוט אחד של iPSCs של בקרת דטרויט 551. (A) סך כל הקומפלקס I נמדד על ידי NDUFB10, (B) קומפלקס ספציפי I רמה מחושב על ידי סך NDUFB10/TOMM20, (C) סך כל הקומפלקס II נמדד על ידי SDHA, (D) רמת II מורכבת ספציפית המחושבת על ידי סך SDHA/TOMM20, (E) סך הכל TFAM נמדד על ידי TFAM, ו-(F) רמת TFAM ספציפית המחושבת על ידי סך TFAM/TOMM20. נתונים המוצגים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM) עבור מספר הדגימות (n ≥ 3 לכל שיבוט). הנתונים נותחו והופקו באמצעות תוכנת GraphPad Prism. מבחן Mann-Whitney U המשמש להערכת מובהקות סטטיסטית עבור משתנים. המשמעות מסומנת עבור P < 0.05. *P < 0.05; ns, לא משמעותי. קיצורים: DA = דופמינרגי; POLG = DNA פולימראז תת-יחידה גמא; iPSC = תא גזע פלוריפוטנטי מושרה; NDUFB10 = NADH: יוביקינון אוקסידורדוקטאז תת-יחידה 10; TOMM20 = טרנסלוקאז של קרום מיטוכונדריאלי חיצוני 20; SDHA = סוקצינאט דהידרוגנאז קומפלקס פלבופרוטאין תת-יחידה A; TFAM = גורם שעתוק מיטוכונדריאלי A. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 10
איור 10: ניתוח ציטומטרי של זרימה עבור אסטרוציטים שמקורו בשיבוט אחד של iPSCs של מטופלי POLG ושיבוט אחד של iPSCs של בקרת דטרויט 551. (A) קומפלקס כולל I נמדד על ידי NDUFB10, (B) קומפלקס ספציפי I רמה מחושב על ידי סך NDUFB10/TOMM20, (C) קומפלקס כולל II נמדד על ידי SDHA, (D) רמת קומפלקס II ספציפית המחושבת על ידי סך SDHA/TOMM20, (E) סך הכל קומפלקס IV הנמדד על ידי COX IV, (F) רמת IV מורכבת ספציפית המחושבת על ידי COX IV/TOMM20, (G) סך TFAM נמדד על ידי TFAM, ו-(H) רמת TFAM ספציפית המחושבת על ידי סך TFAM/TOMM20. נתונים המוצגים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM) עבור מספר הדגימות (n ≥ 3 לכל שיבוט). הנתונים נותחו והופקו באמצעות תוכנת GraphPad Prism. מבחן Mann-Whitney U שימש להערכת מובהקות סטטיסטית עבור משתנים. המשמעות מסומנת עבור P < 0.05. *P < 0.05; ** P < 0.01; ns, לא משמעותי. קיצורים: POLG = DNA פולימראז תת-יחידה גמא; iPSC = תא גזע פלוריפוטנטי מושרה; NDUFB10 = NADH: יוביקינון אוקסידורדוקטאז תת-יחידה 10; TOMM20 = טרנסלוקאז של קרום מיטוכונדריאלי חיצוני 20; SDHA = סוקצינאט דהידרוגנאז קומפלקס פלבופרוטאין תת-יחידה A; TFAM = גורם שעתוק מיטוכונדריאלי A; COX IV = ציטוכרום c אוקסידאז קומפלקס IV. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים S1: הגדרות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי לסריקת לייזר קונפוקלי וצעדים לצילום תמונות. (A) בחר בכלי קביעת תצורה ובחר את סוג הלייזר הנכון מתוך הלייזר הזמין הנוכחי והגדר את העוצמה שלו. (B) בחר מצב רכישה-רכישה-SEQ ובחר את מצב הצילום המתאים באורך גל פלואורסצנטי ממסד הנתונים. (C) בחר טעינת סריקה רציפה וייבא מצב מתאים. (D) בחר עדשת מטרה של 40x והוסף dropwise. (E) פרמטרי הגדרה ספציפיים לצילום תמונות באורכי גל שונים. (F) הגדר פרמטרים של תמונה, הצג תצוגה מקדימה ושמור את התמונה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: שלבים והגדרות עבור ציטומטריה של זרימה. (A) פתח את תוכנת Cflow, בחר בכלי קובץ ובחר פתח קובץ או תבנית CFlow. (B) הגדר 40,000 אירועים ובחר בשער המכיל רק את התאים הבודדים החיים בחלונית 'מגבלות הפעלה'. בחרו 'מהירות בינונית' בחלונית 'Fluidics'. (C) בחר FSC-A לעומת FSC-A מגרש (a) להגדרת ה- gating הראשי. בחר FSC-A לעומת FSC-H מגרש (b) ו- SSC-A לעומת SSC-H מגרש (c) כדי לא לכלול כפילויות. בחר את המסננים המתאימים, כגון FL1 או FL2, והשתמש בעלילה FL1-A לעומת FSC-A (d) או FL2-A לעומת FSC-A כדי לצייר את האירועים החיוביים בעת הפעלת התאים הלא מוכתמים. (D) הגדר את אותם פרמטרים, תצוגה מקדימה, הפעל את הדוגמאות המוכתמות ושמור את התמונה. כמו כן, ראו טבלה משלימה S2. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה S1: מתכוני מדיה ופתרונות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה S2: התקנה להכתמה ציטומטרית בזרימה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

להלן פרוטוקולים ליצירת נוירונים ואסטרוציטים שמקורם ב-iPSC ולהערכת היבטים רבים של תפקוד המיטוכונדריה באמצעות ציטומטריה של זרימה. פרוטוקולים אלה מאפשרים המרה יעילה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים הן לתאי עצב והן לאסטרוציטים גליים, ואפיון מפורט של תפקוד המיטוכונדריה, בעיקר בתאים חיים. הפרוטוקולים מספקים גם אסטרטגיה מבוססת ציטומטריה של זרימה משותפת לרכישה וניתוח של פונקציות מיטוכונדריאליות מרובות, כולל נפח, MMP ורמות ROS מיטוכונדריאליות בתאים חיים וקומפלקסים של MRC ו- TFAM בתאים קבועים. באופן ספציפי, פרוטוקולים אלה מאפשרים להעריך הן את הרמות הכוללות והן את הרמות הספציפיות לנפח המיטוכונדריה. בעוד שאסטרטגיה זו מזהה תפקוד לקוי של המיטוכונדריה במחלה מיטוכונדריאלית ידועה (POLG) בתאי עצב DA ובאסטרוציטים, טכניקות אלה ישימות לכל סוג של תא ומחלה. יתר על כן, הפרוטוקול הוא חזק וניתן לשחזור. מספר מחקרים קודמים יישמו בהצלחה פרוטוקול זה כדי לנתח את השינויים המיטוכונדריאליים בפיברובלסטים, iPSCs, תאי גזע עצביים, נוירוני DA ואסטרוציטים 2,3,13,17.

ישנן כמה נקודות קריטיות שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע פרוטוקול זה. כדי להבטיח התמיינות עקבית ויעילה במיוחד, חיוני ליזום את ההמרה עם iPSCs באיכות גבוהה (תאים המכילים <5% תאים ממוינים). למרות שאמצעי תקשורת מוגדרים אחרים הזמינים מסחרית יכולים להיות חלופות תקפות, מחקר זה לא התייחס לחלופות. מכיוון שהרכב בינוני והבדלים קלונליים של קווי iPSC יכולים להשפיע הן על התפשטות אוכלוסיית התאים ההתחלתיים והן על יעילות ההתמיינות, התאמת פרוטוקול זה למדיות תחזוקה אחרות תדרוש ככל הנראה אופטימיזציה.

הקשר בין MTG לפלואורסצנציה של MMP נחקר בעבר3. זה חשוב מכיוון שדווח כי פלואורסצנטיות MTG היא גם בלתי תלויה ב-18 וגם רגישה ל-MMP19,20. במחקרים קודמים שבהם iPSCs צוינו עם ריכוזים שונים של TMRE והוכתמו ב-150 ננומטר MTG, רמת ה-MTG נותרה זהה בריכוזים נמוכים יותר של TMRE (5-100 ננומטר), בעוד שאות MTG מופחת נצפה עבור ריכוזי TMRE גבוהים יותר (מעל 100 ננומטר). לכן, 100 nM TMRE ו 150 nM MTG נבחרו למדוד את MMP ספציפי. מכיוון שקשר זה עשוי להיות ספציפי לתא, יש להעריך את המתאם בין MTG לפלואורסצנציה של MMP לפני השימוש בכתמים כפולים של MTG ו- TMRE למדידת MMP.

צפיפות התאים יכולה גם להשפיע על תפקוד המיטוכונדריה ועל חילוף החומרים בתאים. במחקר זה נצפו שינויים תלויי צפיפות תאים ב-MMP, שהוכחו גם במחקרים אחרים21. לכן, חשוב לבחור צפיפות תאים דומה בכל הדגימות - לא גבוהה מדי או נמוכה - כדי למזער את השונות בעת קביעת פרוטוקול צביעה משותפת עבור סוגי תאים שונים. בהשוואה למבחנים אחרים המבוססים על מיקרוסקופיה, לציטומטריה של זרימה יש את היתרונות של מהירות ושכפול בעת ניתוח מספר גדול של תאים. בניתוח של תמונות מיקרוסקופיות, ההטיה של החוקרים תעוות את התוצאות במידה מסוימת, וזו אינה בעיה בעת שימוש בציטומטריה של זרימה. בנוסף, ניתוח ציטומטריה של זרימה דורש פחות ממיליון תאים, וניתוח של דגימה אחת אורך דקות ספורות בלבד, מה שאומר שניתן לנתח עשרות דגימות תוך 1-2 שעות. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם על מגוון רחב של סוגי תאים, כולל אלה ממחלות נוירודגנרטיביות אחרות, ולכן צריכה להיות שימושית להבנת מנגנונים ולבדיקת טיפולים פוטנציאליים במחלות נוירודגנרטיביות שונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים בחביבות למרכז ההדמיה המולקולרית ולמתקן הליבה של ציטומטריה של זרימה באוניברסיטת ברגן בנורווגיה. עבודה זו נתמכה על ידי מימון ממועצת המחקר הנורבגית (מספר מענק: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat ומועצת המלגות של סין (מספר הפרויקט: 201906220275).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-Oct4 Abcam ab19857, RRID:AB_445175 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-SSEA4 Abcam ab16287, RRID:AB_778073 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Sox2 Abcam ab97959, RRID:AB_2341193 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Pax6 Abcam ab5790, RRID:AB_305110 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Nestin Santa Cruz Biotechnology sc-23927, RRID:AB_627994 Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-GFAP Abcam ab4674, RRID:AB_304558 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-S100β  conjugated with Alexa Fluor 488 Abcam ab196442, RRID:AB_2722596 Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution;
anti-TH Abcam ab75875, RRID:AB_1310786 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Tuj 1 Abcam ab78078, RRID:AB_2256751 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Synaptophysin Abcam ab32127, RRID:AB_2286949 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-PSD-95 Abcam ab2723, RRID:AB_303248 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488 Abcam ab198308 Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488 Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-17764 RRID:AB_628381 Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-NDUFB10 Abcam ab196019 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-SDHA Abcam ab137040 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-COX IV Abcam ab14744, RRID:AB_301443 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use  Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control.
Activin A PeproTech 120-14E Astrocyte differentiation medium ingredient
ABM Basal Medium Lonza CC-3187 Basal medium for astrocyte culture
AGM SingleQuots Supplement Pack Lonza CC-4123 Supplement for astrocyte culture
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240062 CDM ingredient
Advanced DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 12634010 Basal medium for dilute Geltrex
Bovine Serum Albumin Europa Bioproducts EQBAH62-1000 Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient
BDNF PeproTech 450-02 DA neurons medium ingredient
B-27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044 Astrocyte differentiation medium ingredient
BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer BD Biosciences, USA
Chemically Defined Lipid Concentrate Thermo Fisher Scientific 11905031 CDM ingredient
Collagenase IV Thermo Fisher Scientific 17104019 Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G Leica Microsystems, Germany
Corning non-treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430589 Suspension culture
DPBS Thermo Fisher Scientific 14190250 Used for a variety of cell culture wash
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 10565018 Astrocyte differentiation basal Medium
EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal Medium Thermo Fisher Scientific A1516901 Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50X) Thermo Fisher Scientific A1517101 Supplement for iPSC culture
EGF Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0314 Supplement for NSC culture
FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0024 Supplement for NSC culture
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12103C Medium ingredient
FGF-basic PeproTech 100-18B Astrocyte differentiation medium ingredient
FCCP Abcam ab120081 Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
Fluid aspiration system BVC control Vacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16% Thermo Fisher Scientific 28908 Cell fixation
Geltrex Thermo Fisher Scientific A1413302 Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher Scientific 35050061 Supplement for NSC culture
GDNF Peprotech 450-10 DA neurons medium ingredient
Glycine Sigma-Aldrich G8898 Used for blocking buffer
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher Scientific 31765027 Basal medium for CDM
Heregulin beta-1 human Sigma-Aldrich SRP3055 Astrocyte differentiation medium ingredient
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H1399 Stain the nuclei for confocal image
Heracell 150i CO2 Incubators Fisher Scientific, USA
IMDM Thermo Fisher Scientific 21980032 Basal medium for CDM
Insulin Roche 1376497 CDM ingredient
InSolution AMPK Inhibitor Sigma-Aldrich 171261 Neural induction medium ingredient
Insulin-like Growth Factor-I human Sigma-Aldrich I3769 Astrocyte differentiation medium ingredient
KnockOut DMEM/F-12 medium Thermo Fisher Scientific 12660012 Basal medium for NSC culture
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Leica TCS SP8 STED confocal microscope Leica Microsystems, Germany
Monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145 CDM ingredient
MitoTracker Green FM Thermo Fisher Scientific M7514 Used for mitochondrial volume indicator
MitoSox Red Thermo Fisher Scientific M36008 Used for mitochondrial ROS indicator
N-Acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A7250 Neural induction medium ingredient
N-2 Supplement Thermo Fisher Scientific 17502048 Astrocyte differentiation medium ingredient
Normal goat serum Thermo Fisher Scientific PCN5000 Used for blocking buffer
Orbital shakers - SSM1 Stuart Equipment, UK
Poly-L-ornithine solution Sigma-Aldrich P4957 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P7405 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Purmorphamine STEMCELL Technologies 72204 Promotes DA neuron differentiation
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36930 Mounting the coverslip for confocal image
PBS 1x Thermo Fisher Scientific 18912014 Used for a variety of wash
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein R&D Systems 423-F8-025/CF Promotes DA neuron differentiation
SB 431542 Tocris Bioscience TB1614-GMP Neural Induction Medium ingredient
StemPro Neural Supplement Thermo Fisher Scientific A10508-01 Supplement for NSCs culture
TrypLE Express Enzyme Thermo Fisher Scientific 12604013 Cell dissociation reagent
Transferrin Roche 652202 CDM ingredient
TRITON X-100 VWR International 9002-93-1 Used for cells permeabilization in immunostaining assays
TMRE Abcam ab113852 Used for mitochondrial membrane potential staining
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments Grant Instruments, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
  2. Chen, A., et al. Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 737304 (2021).
  3. Liang, K. X., et al. Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations. EMBO Molecular Medicine. 12 (10), 12146 (2020).
  4. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Human Molecular Genetics. 18, 169-176 (2009).
  5. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  6. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules. 24 (8), Basel, Switzerland. 1583 (2019).
  7. Kondadi, A. K., Anand, R., Reichert, A. S. Functional interplay between cristae biogenesis, mitochondrial dynamics and mitochondrial DNA integrity. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4311 (2019).
  8. Sterneckert, J. L., Reinhardt, P., Schöler, H. R. Investigating human disease using stem cell models. Nature Reviews. Genetics. 15 (9), 625-639 (2014).
  9. Patani, R. Human stem cell models of disease and the prognosis of academic medicine. Nature Medicine. 26 (4), 449 (2020).
  10. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. , 337 (2021).
  11. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  12. Juopperi, T. A., et al. Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells. Molecular Brain. 5, 17 (2012).
  13. Liang, K. X., et al. Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons. bioRxiv. , (2020).
  14. Liu, Q., et al. Human neural crest stem cells derived from human ESCs and induced pluripotent stem cells: induction, maintenance, and differentiation into functional schwann cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (4), 266-278 (2012).
  15. Hong, Y. J., Do, J. T. Neural lineage differentiation from pluripotent stem cells to mimic human brain tissues. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 400 (2019).
  16. Lundin, A., et al. Human iPS-derived astroglia from a stable neural precursor state show improved functionality compared with conventional astrocytic models. Stem Cell Reports. 10 (3), 1030-1045 (2018).
  17. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. 337, 113536 (2021).
  18. Pendergrass, W., Wolf, N., Poot, M. Efficacy of MitoTracker Green™ and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues. Cytometry. Part A. 61 (2), 162-169 (2004).
  19. Keij, J. F., Bell-Prince, C., Steinkamp, J. A. Staining of mitochondrial membranes with 10-nonyl acridine orange, MitoFluor Green, and MitoTracker Green is affected by mitochondrial membrane potential altering drugs. Cytometry. 39 (3), 203-210 (2000).
  20. Buckman, J. F., et al. MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants. Journal of Neuroscience Methods. 104 (2), 165-176 (2001).
  21. Zanchetta, L. M., Kirk, D., Lyng, F., Walsh, J., Murphy, J. E. Cell-density-dependent changes in mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species production in human skin cells post sunlight exposure. Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (6), 311-317 (2010).

Tags

מדעי המוח גיליון 177
ניתוח ציטומטרי של זרימה של פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם ונגזרותיהם העצביות והגליליות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liang, K. X., Chen, A., Kristiansen, … More

Liang, K. X., Chen, A., Kristiansen, C. K., Bindoff, L. A. Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives. J. Vis. Exp. (177), e63116, doi:10.3791/63116 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter