Summary
Burada, 10 ng / mL GM-CSF / IL-4 ile 7 günlük kültürden sonra farelerden yüksek saflıkta kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri izole etmek ve üretmek için ekonomik ve etkili bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Dendritik hücrelere (DC'ler) olan talep, immünoloji araştırmaları ilerledikçe giderek artmaktadır. Bununla birlikte, DC'ler tüm dokularda nadirdir. DC'leri izole etmek için geleneksel yöntem öncelikle büyük dozlarda (>10 ng / mL) granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör / interlökin-4 (GM-CSF / IL-4) enjekte ederek kemik iliği (BM) farklılaşmasını DC'lere indüklemeyi içerir ve prosedürü karmaşık ve pahalı hale getirir. Bu protokolde, 10 ng / mL GM-CSF / IL-4 ortamında kültürlenmiş tüm BM hücreleri kullanılarak, 3-4 yarı kültür değişiminden sonra, fare başına 2.7 x 107 CD11c + hücresi (DC) (iki femur) % 80 -% 95 saflıkta toplanmıştır. Kültürde 10 gün sonra, CD11c, CD80 ve MHC II ekspresyonu artarken, hücre sayısı azaldı. Hücre sayısı 7 günlük kültürden sonra zirveye ulaştı. Dahası, bu yöntemin tüm kemik iliği hücrelerini hasat etmesi sadece 10 dakika sürdü ve 1 haftalık kültürden sonra çok sayıda DC elde edildi.
Introduction
Dendritik hücreler (DC'ler), naif T hücrelerini aktive etmek ve bulaşıcı hastalıklara, alerji hastalıklarına ve tümör hücrelerine karşı spesifik sitotoksik T lenfosit (CTL) yanıtlarını indüklemek için en güçlü antijen sunan hücrelerdir (APC'ler) 1,2,3. DC'ler doğuştan gelen bağışıklık ile adaptif immünite arasındaki birincil bağlantıdır ve immünolojik savunmada ve immün toleransın korunmasında önemli bir rol oynarlar. Son 40 yılda, birçok araştırmacı DC'lerin alt kümelerini ve inflamasyon ve bağışıklıktaki işlevlerini tanımlamaya çalışmıştır. Bu çalışmalara göre, DC'ler kemik iliği hücrelerinden miyeloid ve lenfoid soylar boyunca gelişir. Tümör aşıları son yıllarda önemli kilometre taşları kazanmıştır ve umut verici bir geleceğe sahiptir. Mekanik olarak, tümör aşıları immün yanıtı modüle eder ve tümör antijenlerini kullanarak sitotoksik T lenfositleri aktive ederek tümör büyümesini önler. DC'lere dayanan aşı, tümör immünoterapisinde önemli bir rol oynamaktadır ve en umut verici anti-tümör tedavilerinden biri olarak tanımlanmıştır 1,4. Ek olarak, DC'ler yeni moleküler hedefli ilaçların ve immün kontrol noktası inhibitörlerinin testinde yaygın olarak kullanılmaktadır5.
Araştırmacılar, DC'lerin rolünü daha fazla incelemek için acilen çok sayıda yüksek saflıkta DC'ye ihtiyaç duymaktadır. Bununla birlikte, DC'ler çeşitli dokularda ve kanda nadirdir ve insanlarda ve hayvanlarda kan hücrelerinin sadece% 1'ini oluşturur. Kemik iliği dendritik hücrelerinin in vitro kültürü (BMDC), büyük miktarlarda DC hücresi elde etmek için önemli bir yöntemdir. Bu arada, kemik iliğinden DC'ler üretmek için Lutz protokolü araştırmacılar tarafından yaygın olarak kullanılmaktadır6. Protokol DC hücrelerinin elde edilmesinde etkili olmasına rağmen, yüksek konsantrasyonlarda sitokinlerin eklenmesini ve kırmızı kan hücrelerinin lizisini içeren karmaşık ve pahalıdır.
Bu çalışmada, hemen hemen tüm kemik iliği hücrelerini fare kemik iliğinden (BM) izole etmek ve in vitro 7-9 günlük inkübasyondan sonra BMDC'ye farklılaşmayı indüklemek için daha düşük GM-CSF ve IL-4 konsantrasyonu ile bir yöntem sunulmuştur. Bu prosedür, neredeyse tüm kemik iliği hücrelerini hasat etmek ve bunları tam bir ortamda askıya almak için sadece 10 dakika sürer. Kısacası, bu araştırmada BMDC için verimli ve uygun maliyetli bir kültürleme yöntemi sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler Nanjing Tıp Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.
1. Kemik iliğinin izolasyonu ve BM hücrelerinin hazırlanması
- C57BL / 6 farelerini (18-22 g, 6-8 haftalık) CO2 boğulması yoluyla feda edin. Fareyi fare ameliyat masasına sabitleyin. Yüzeyleri% 70 etanol ile dezenfekte edin.
- Kasları ve femoral arteri açığa çıkarmak için bacağın derisini kesin. İki forseps kullanarak femoral arteri kelepçeleyin ve yırtın, ardından proksimal ucu karnına doğru çekin.
NOT: Femoral arteri doğrudan kesmeyin. Aksi takdirde, aşırı kanamaya neden olur ve görüş alanını kirletir. - Femur çevresindeki tüm kasları kesin.
- Kalça eklemi çıkığı sesi duyulana ve femur başı prolapsusu görülene kadar farenin alt uzuvlarını yavaşça dışa doğru gerin.
- Femur başının iç kısmı boyunca makas kullanarak alt ekstremiteleri vücuttan ayırın.
- Serbest ve eksiksiz bir femur elde etmek için arka bacakları diz ekleminin ucundan kesin.
- Gazlı bez kullanarak femura bağlı kasları çıkarın.
NOT: Kasları doğrudan yırtmayın. Farelerin femuru hassastır, bütünlüğü korunmalıdır. - Femuru 2-5 dakika boyunca% 75 alkole batırın.
2. BMDC'nin indüksiyon kültürü
- Artık alkolü PBS ile durulayın. Femurun orta ve alt kısmını sıkıştırmak için hemostatik forseps ve femur alt ucunu sıkıştırmak için başka bir set kullanın. Hemostatik forsepsler femura lateral olarak uygulanır ve femur epifizyel hattan ayrılır.
NOT: Epifizyal çizgi, femur kırılana kadar kolayca görülemez. Bu ve sonraki adımların tümü steril bir ortamda gerçekleştirilir. - Epifizyal çizgi kırılmasından kemik iliği boşluğuna nüfuz etmek için 1 mL'lik bir şırınga (iğne: 0.6 mm x 25 mm) kullanın ve femur kafasına ve kemik iliği boşluğuna nüfuz etmek için iğneyi döndürün. Kemik beyazlaşana kadar GM-CSF / IL-4 içeren tam ortamın 1 mL'sini kullanarak kemik iliği boşluğunu nabız atın ve yıkayın.
NOT: Tam kültür ortamı: %10 FBS, %1 penisilin-streptomisin, 55 μM β-Merkaptoetanol, 10 ng/mL GM-CSF ve 10 ng/mL IL-4. - Tüm hücreleri 24 mL tam kültür ortamında (~ 5 x 105 hücre / mL) yeniden askıya alın. Karıştırdıktan sonra, tüm ortam 4 mL / kuyucuklu 6 delikli bir plakaya tohumlandı, daha sonra 2 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edildi.
NOT: Eritrositlerin lize edilmesi gerekli değildir. - 2 gün sonra tüm ortamları GM-CSF / IL-47 içeren ortamla değiştirin. Dördüncü, altıncı ve sekizinci günlerde, ortamın yarısını 10 ng / mL GM-CSF / IL-4 içeren tam ortamla değiştirin.
NOT: Bu adımda, eritrositler ve lenfositler gibi askıda kalan hücreler çıkarılır. - Hücre büyümesini kaydetmek için her gün fotoğraf çekin. Altıncı günden itibaren, hücre sayısını saymak ve CD11c, CD80 ve MHC II ekspresyonu 6,7'yi tespit etmek için günde bir kuyucuk hücre toplayın.
3. CD11c, CD80 ve MHC II ekspresyonunun akış sitometrik tespiti
- DC'leri PBS ile yıkadıktan sonra, 100 μL FACS tamponunda 1 x 106 hücreyi yeniden askıya alın, 0,5 μg anti-fare CD16/32 antikoru ekleyin ve spesifik olmayan antijen bölgelerini bloke etmek için buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.
- 1 μg Percp/cy5.5-CD11c, 0.5 μg PE-CD80 ve 0.04 μg APC-MHC II antikorları ekleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
- 4 °C'de 3 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj yapın, süpernatanı çıkarın, 1 mL% 4 paraformaldehit ekleyin, 4 ° C'de 30 dakika sabitleyin ve 300 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın.
- Akış sitometrisi gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1 x 10 7-1.7 x 107 hücreleri iki femurdan ekstrakte edildi ve 6 kuyucuklu bir plakaya ekilmeden önce 24 mL ortamda tekrar askıya alındı (Şekil 1A). 2 gün sonra, yapışkan olmayan hücreler kültür ortamını tamamen değiştirerek çıkarıldı. Ortamı değiştirmeden önce, önemli sayıda askıya alınmış hücre gözlendi (Şekil 1B). 3 günlük kültürden sonra küçük hücre kolonileri oluşmaya başladı. Altıncı günde, kolonilerin büyüklüğü ve sayısı önemli ölçüde arttı. Yedinci günde, hücre sayısı zirveye ulaştı (22 x 10 6-27 x 106) ve sonra kademeli olarak düştü (Şekil 2A). DC hücrelerinin yüzeyi, tipik olgun DC hücre morfolojisi sergileyen daha uzun psödopodia ile pürüzlü hale geldi (Şekil 2B). Akım sitometrik analizi, CD11c pozitifinin toplam hücrelere oranının altıncı günde %71 olduğunu, onuncu günde ise %96.1'e yükseldiğini göstermiştir (Şekil 2C,2D).
Ko-uyarıcı moleküllerin ekspresyonunu değerlendirmek için, CD11c, CD80 ve MHC II birlikte boyandı8. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, CD11c, CD80 ve MHC II'nin ekspresyonu, 6. günden 10. güne kadar artan ekim süresi ile kademeli olarak artmıştır. Ek olarak, akış sitometrik analizi, CD11c ve CD80 çift pozitif, CD11c ve MHCII çift pozitif (Şekil 3B, 3D) ve üçlü pozitif hücrelerin (Şekil 3C, 3D) oranlarında kademeli bir artış göstermiştir.
Şekil 1: DC'lerin farklı kültür zamanlarındaki temsili görüntüleri . (A) BMDC'nin kültürlenmesinin akış şeması. (B) DC'lerin farklı kültür zamanlarındaki temsili görüntüleri. Kemik iliği hücreleri 10 ng/mL GM-CSF ve IL-4 ile 24 mL kültür ortamında askıya alındı ve 6 delikli bir plakaya ekildi. BF, kültür ortamını değiştirmeden önce; AF, kültür ortamını değiştirdikten sonra. Kırmızı ok, DC kolonisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Farklı kültür zamanlarındaki DC'lerin sayısı ve saflığı. (A) Tüm kültür ortamlarındaki toplam hücre sayısı. (B) DC'lerin temsili görüntüleri. (C,D) DC'lerin oranının analizinin akış sitometrik ve grafiksel gösterimi. Pozitif hücreler CD11c'ye göre sıralanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: DC'lerde ko-uyarıcı moleküllerin ekspresyonu. (A) DC'lerde CD11c, CD80 ve MHC ΙΙ ekspresyonu. (B) CD11c ve CD80 çift pozitif, CD11c ve MHC ΙΙ çift pozitif ve üçlü pozitif hücrelerin oranının akış sitometrik analizi. (C, D) 6. Gün-10. Gün arasında akış sitometrik analizi ve istatistiksel analizi göstermek için grafiksel gösterim. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İnsanlar ve fareler, klasik DC'ler (cDC1'ler ve cDC2'ler dahil cDC'ler) plazmasitoid DC'ler (pDC'ler) ve monosit kaynaklı DC'ler (MoDC'ler) 9,10,11 dahil olmak üzere farklı DC alt kümelerine sahiptir. Genel olarak, cDC1'lerin hücre içi patojenlere ve kansere karşı sitotoksik T lenfosit (CTL) yanıtlarını düzenlediği ve cDC2'lerin hücre dışı patojenlere, parazitlere ve alerjenlere karşı immün yanıtları düzenlediği kabul edilmektedir12. GM-CSF ve IL-4 6,13,14 varlığında farelerde BM progenitör hücrelerinden in vitro olarak önemli sayıda DC üretilebilir. DC'lerin saflığı ve miktarı başarılı DC immünoterapisinde kilit rol oynamaktadır. Araştırmacılar, 1 x 105 ila 1 x 106 DC'lik iki dozun, bir ksenograft modeli15,16,17,18'de etkili sitotoksik T lenfosit (CTL) yanıtlarını ortaya çıkarabileceğini göstermiştir. Bu, DC'lerin tümör immünoterapisindeki rolünü daha fazla araştırmak için çok sayıda yüksek saflıkta DC'nin yetiştirilmesi gerektiği anlamına gelir.
Kemik iliği hücrelerini elde etmenin geleneksel yöntemi, femur iki ucunu kesmek ve orta 6,7 ile durulamaktır. Bu çalışmada, femuru koparmak için fizyolojik anatomik yapıları yenilikçi bir şekilde kullandık. Femurun alt ucunu sıkıştırmak ve lateral olarak hareket ettirmek için hemostatik forseps kullanıldı. Epifiz hattı fizyolojik olarak zayıftır ve19 strese girdiğinde onları kırıklara duyarlı hale getirir. Femur epifiz hattından ayrıldıktan sonra, ilik boşluğunda az miktarda kemik kalır. İğne, kemiğe kemik iliği boşluğuna kolayca nüfuz edebilir. Yöntemin kullanımı basittir, değerli kemik iliği hücrelerini korur ve çok sayıda DC'nin kültürü için hücresel bir temel sağlar. DC'leri 10 ng / mL GM-CSF ve 10 ng / mL IL-4'ün bir kombinasyonunu kullanarak kültürledik, bu da DC'lerin olgunlaşmasına yalnızca GM-CSF'den daha fazla katkıda bulunuyor. Labeur ve Son, GM-CSF ve IL-4'ün DC'ler ortamında kombine kullanımının, IFN-ɣ, TNF-α ve IL-6 gibi olgunlaşma belirteçlerinin daha yüksek ekspresyonuna ve gelişmiş antijen sunma yeteneğine neden olduğunu bildirmiştir 7,20,21. Son ve ark. ayrıca GM-CSF ve IL-4 kombinasyonunun DCs 7,21'in olgunlaşmasını desteklediğini öne sürmüşlerdir.
Bu çalışmada, toplanan kemik iliği hücrelerini eritrositleri lize etmeden doğrudan kültürledik ve bunları hücre kaybına ve nihayetinde hasat edilen DC'lerde bir azalmaya neden olabilecek gradyan santrifüjleme ile ayırdık. Ortam değiştirilmeden önce, kültür sisteminde eritrositler, T hücreleri, B hücreleri ve granülositler dahil olmak üzere birkaç askıya alma hücresi vardı. Ko-kültür sırasında, bu hücreler DC'lerin olgunlaşmasını teşvik etmek için sitokinler üretebilir.
Sınırlamalar açısından, bu protokol daha küçük tibialar hariç, farenin sadece iki femurunu kullandı ve bu da bazı mezenkimal kök hücrelerin kaybına neden oldu. Kısacası, kemik iliği hücrelerini ayırmak için sadece 10 dakika süren farelerden kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerin izolasyonu ve üretimi için uygun maliyetli ve verimli bir protokol geliştirdik. Çok sayıda yüksek saflıkta DC, 10 ng / mL GM-CSF ve IL-4 ile 6 gün ila 7 günlük inkübasyondan sonra hasat edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını ve açıklayacak hiçbir şeyleri olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma Tianjin Bilim ve Teknoloji Planı Programı (20JCQNJC00550), Tianjin Sağlık Bilimi ve Teknolojisi Projesi (TJWJ202021QN033 ve TJWJ202021QN034) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
References
- Huang, M. N., et al. Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).
- Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo. Biomaterials. 182, 92-103 (2018).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Jiang, P. L., et al. Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity. Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).
- Shi, Y., et al. Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity. Frontiers in Pharmacology. 11, 566401 (2020).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Son, Y. I., et al. A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells. Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).
- Guo, L., et al. Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer. Vaccines. 9 (7), 786 (2021).
- Olweus, J., et al. Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).
- Martin, P., et al. Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors. Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).
- Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
- Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions. Frontiers in Immunology. 6, 260 (2015).
- Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Mayordomo, J. I., et al. marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).
- Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells. Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).
- Brunner, G. A., et al. Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus. Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).
- Koido, S., et al. Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA. Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).
- Jonasson, P. S., et al. Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle - An experimental biomechanical study. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4 (2014).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).
- Hinkel, A., et al. Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma. Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).
