Name: Protocolo Econômico e Eficiente para Isolar e Culturing Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea de camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 29 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos com GM-CSF/IL-4 por sete dias. Este protocolo econômico e eficiente produz alta pureza para pesquisas em imunologia tumoral.

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Este trabalho foi apoiado pelo Programa do Plano de Ciência e Tecnologia de Tianjin (20JCQNJC00550), Tianjin Health Science and Technology Project (TJWJ202021QN033 e TJWJ202021QN034).

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica de Nanjing.
1. Isolamento da medula óssea e preparação de células BM
<ol><li>Sacrifício C57BL/6 camundongos (18-22 g, 6-8 semanas de idade) via asfixia de CO2 . Conserte o mouse na mesa de operação do mouse. Desinfete as superfícies com 70% de etanol.</li>
	<li>Corte a pele da perna para expor os músculos e a artéria femoral. Grampo e rasgue a artéria femoral usando dois fórceps, em seguida, puxe a extremidade proximal em direção ao abdômen. NOTA: Não corte diretamente a artéria femoral. Caso contrário, causará sangramento excessivo e contaminará o campo de visão.</li>
	<li>Corte todos os músculos ao redor do fêmur.</li>
	<li>Estique lentamente os membros inferiores do rato para fora até que o som da luxação da articulação do quadril seja ouvido e o prolapso da cabeça femoral seja visível.</li>
	<li>Separe os membros inferiores do corpo usando uma tesoura ao longo do interior da cabeça femoral.</li>
	<li>Corte as pernas traseiras da extremidade da articulação do joelho para obter um fêmur livre e completo.</li>
	<li>Remova os músculos ligados ao fêmur usando gaze. NOTA: Não rasgue os músculos diretamente. O fêmur de camundongos é delicado, sua integridade deve ser mantida.</li>
	<li>Mergulhe o fêmur em 75% de álcool por 2-5 min.</li>
</ol>2. Cultura de indução do BMDC
<ol><li>Enxágüe o álcool residual com PBS. Use fórceps hemostáticos para fixar a parte média e inferior do fêmur e outro conjunto para fixar a extremidade inferior do fêmur. As fórceps hemostáticas são aplicadas lateralmente ao fêmur, e o fêmur é separado da linha epífise. NOTA: A linha epífise não é facilmente visível até que o fêmur se escaia. Este e os próximos passos são todos realizados em um ambiente estéril.</li>
	<li>Use uma seringa de 1 mL (agulha: 0,6 mm x 25 mm) para penetrar a cavidade da medula óssea a partir da quebra da linha epífise e gire a agulha para penetrar na cabeça femoral e através da cavidade da medula óssea. Pulso e lave a cavidade da medula óssea usando 1 mL do meio completo contendo GM-CSF/IL-4 até que o osso fique branco. NOTA: Ensino médio completo: 10% FBS, 1% penicilina-estreptomicina, 55 μM β-Mercaptoethanol, 10 ng/mL GM-CSF e 10 ng/mL IL-4.</li>
	<li>Resuspenda todas as células em 24 mL de meio de cultura completa (~5 x 105 células/mL). Após a mistura, todo o meio foi semeado em uma placa de 6 poços com 4 mL/bem, depois incubado a 37 °C com 5% de CO2 por 2 dias. NOTA: Não é necessário lise eritrócitos.</li>
	<li>Substitua todo o meio após 2 dias por médio contendo GM-CSF/IL-47. No quarto, sexto e oitavo dias, substitua metade do meio pelo meio completo contendo 10 ng/mL GM-CSF/IL-4. NOTA: Nesta etapa, são removidas células suspensas, como eritrócitos e linfócitos.</li>
	<li>Tire fotos todos os dias para registrar o crescimento celular. A partir do sexto dia, colher um poço de células por dia para contar o número do celular e detectar a expressão CD11c, CD80 e MHC II 6,7.</li>
</ol>3. Detecção citométrica de fluxo da expressão de CD11c, CD80 e MHC II
<ol><li>Depois de lavar os DCs com PBS, resuspenque 1 x 106 células em 100 μL de tampão FACS, adicione 0,5 μg de anticorpo cd16/32 anti-rato e incubar por 10 minutos no gelo para bloquear locais de antígeno não específicos.</li>
	<li>Adicione 1 μg de Percp/cy5.5-CD11c, 0,5 μg de PE-CD80 e 0,04 μg de anticorpos APC-MHC II, e incubar no gelo por 30 min.</li>
	<li>Centrifugar a 1.000 x g por 3 min a 4 °C, remover o supernascedor, adicionar 1 mL de paraformaldeído de 4%, fixar por 30 min a 4 °C e suspender em 300 μL de tampão FACS.</li>
	<li>Realize a citometria de fluxo.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-loaded+monocyte+administration+induces+potent+therapeutic+antitumor+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).</li>
<li>Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+loading+of+CTL+epitopes+onto+MHC+class+I+complexes+on+dendritic+cell+surface+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo.</a> Biomaterials. 182, 92-103 (2018).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li>
<li>Jiang, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactosylated+liposome+as+a+dendritic+cell-targeted+mucosal+vaccine+for+inducing+protective+anti-tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity.</a> Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+immunotherapies+to+improve+anticancer+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 566401(2020).</li>
<li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li>
<li>Son, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+bulk-culture+method+for+generating+mature+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells.</a> Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+protein+vaccine+based+on+Ag85B+and+STEAP1+induces+a+protective+immune+response+against+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer.</a> Vaccines. 9 (7), 786(2021).</li>
<li>Olweus, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+ontogeny%3A+A+human+dendritic+cell+lineage+of+myeloid+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).</li>
<li>Martin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concept+of+lymphoid+versus+myeloid+dendritic+cell+lineages+revisited%3A+both+CD8alpha%28-%29+and+CD8alpha%28%2B%29+dendritic+cells+are+generated+from+CD4%28low%29+lymphoid-committed+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors.</a> Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).</li>
<li>Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+human+and+mouse+dendritic+cell+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function.</a> Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).</li>
<li>Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+evolutionary+conservation+of+dendritic+cell+subset+identity+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions.</a> Frontiers in Immunology. 6, 260(2015).</li>
<li>Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%3A+in+vitro+differentiation+using+low+doses+of+recombinant+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).</li>
<li>Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+murine+dendritic+cells+from+flt3-ligand-supplemented+bone+marrow+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures.</a> Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).</li>
<li>Mayordomo, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow-derived+dendritic+cells+pulsed+with+synthetic+tumour+peptides+elicit+protective+and+therapeutic+antitumour+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity.</a> Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).</li>
<li>Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-based+immunization+by+in+vivo+transfection+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells.</a> Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).</li>
<li>Brunner, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-prandial+administration+of+the+insulin+analogue+insulin+aspart+in+patients+with+type+1+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus.</a> Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).</li>
<li>Koido, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+antitumor+immunity+by+vaccination+of+dendritic+cells+transfected+with+MUC1+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA.</a> Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).</li>
<li>Jonasson, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strength+of+the+porcine+proximal+femoral+epiphyseal+plate%3A+The+effect+of+different+loading+directions+and+the+role+of+the+perichondrial+fibrocartilaginous+complex+and+epiphyseal+tubercle+-+An+experimental+biomechanical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Orthopaedics%22%5BJournal%5D)">Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle - An experimental biomechanical study.</a> Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4(2014).</li>
<li>Labeur, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tumor+immunity+by+bone+marrow-derived+dendritic+cells+correlates+with+dendritic+cell+maturation+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage.</a> Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).</li>
<li>Hinkel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+dendritic+cells+generated+from+nonfractionated+bulk+peripheral+blood+mononuclear+cell+cultures+induce+growth+of+cytotoxic+T+cells+against+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma.</a> Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).</li>
</ol>

Todos os autores declaram que não têm conflitos de interesse e que não têm nada a revelar.

Humanos e camundongos têm diferentes subconjuntos dc, incluindo DCs clássicos (cDCs, incluindo cDC1s e cDC2s) DCs plasmacitóides (pDCs) e DCs derivados de monócitos (MoDCs)9,10,11. É geralmente aceito que os cDC1s regulam as respostas citotóxicas de Linfocito T (CTL) a patógenos intracelulares e câncer, e os cDC2s regulam respostas imunes a patógenos extracelulares, parasitas e alérgenos12. Um número sign...

As células dendríticas (DCs) são as células mais poderosas que apresentam antígeno (APCs) para ativar células T ingênuas e induzir respostas específicas de linfócitos T citotóxicos específicos (CTL) contra doenças infecciosas, doenças alérgicas e células tumorais 1,2,3. Os DCs são o principal elo entre imunidade inata e imunidade adaptativa e desempenham um papel essencial na defesa imunológica e na manutenção da tolerância imunológica. Nos últimos 40 anos, muitos pesquisadores têm procurado definir os subconjuntos dos DCs e suas funções em inflamação e imunidade. De acordo com esses estudos, os DCs desenvolvem-se ao longo das linhagens mieloide e linfoides a partir de células de medula óssea. As vacinas tumorais ganharam marcos significativos nos últimos anos e têm um futuro promissor. Mecanicamente, as vacinas tumorais modulam a resposta imune e previnem o crescimento do tumor ativando linfócitos T citotóxicos usando antígenos tumorais. A vacina baseada em DCs desempenha um papel importante na imunoterapia tumoral e foi identificada como uma das terapias anti-tumores mais promissoras 1,4. Além disso, os DCs têm sido amplamente utilizados nos testes de novas drogas de alvo molecular e inibidores de ponto de verificação imunológico5.
Os pesquisadores precisam urgentemente de um alto número de DCs de alta pureza para estudar melhor o papel dos DCs. No entanto, os DCs são raros em vários tecidos e sangue, representando apenas 1% das células sanguíneas em humanos e animais. A cultura in vitro de células dendríticas de medula óssea (BMDC) é um método importante para a obtenção de grandes quantidades de células DC. Enquanto isso, o protocolo Lutz para geração de DCs a partir da medula óssea tem sido amplamente utilizado pelos pesquisadores6. Embora o protocolo seja eficaz na obtenção de células DC, é complexo e caro, envolvendo a adição de altas concentrações de citocinas e a lise dos glóbulos vermelhos.
Neste estudo, relatamos um método para isolar quase todas as células de medula óssea da medula óssea do camundongo (MMO) e induzir a diferenciação em BMDC após 7-9 dias de incubação in vitro, com menor concentração de GM-CSF e IL-4. Este procedimento leva apenas 10 minutos para colher quase todas as células de medula óssea e suspendê-las em um meio completo. Em suma, fornecemos um método de cultivo eficiente e econômico para o BMDC nesta pesquisa.

<table><tbody><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>Solarbio</td><td>M8211</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>APC-MHC II</td><td>Biolegend</td><td>116417</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10100</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD80</td><td>Biolegend</td><td>104707</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Solarbio</td><td>P1400</td><td></td></tr><tr><td>Percp/cy5.5-CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117327</td><td></td></tr><tr><td>PRMI-1640</td><td>Thermo</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Recombinante GM-CSF</td><td>Solarbio</td><td>P00184</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Recombinante IL-4</td><td>Solarbio</td><td>P00196</td><td></td></tr><tr><td>TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>156603</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo econômico e eficiente para isolar e culturing células dendríticas derivadas da medula Óssea de camundongos

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

A demanda por células dendríticas (DCs) está aumentando gradualmente à medida que a pesquisa em imunologia avança. No entanto, os DCs são raros em todos os tecidos. O método tradicional de isolação de DCs envolve principalmente induzir a diferenciação de medula óssea (MT) em DCs, injetando grandes doses (>10 ng/mL) de fator estimulante da colônia granulocito-macrófago/interleucina-4 (GM-CSF/IL-4), tornando o procedimento complexo e caro. Neste protocolo, utilizando todas as células BM cultivadas em 10 ng/mL GM-CSF/IL-4, após 3-4 trocas de meia cultura, até 2,7 x 107 células CD11c+ (DCs) por rato (dois fêmures) foram colhidas com uma pureza de 80%-95%. Após 10 dias na cultura, a expressão de CD11c, CD80 e MHC II aumentou, enquanto o número de células diminuiu. O número de células atingiu o pico após 7 dias de cultura. Além disso, este método levou apenas 10 minutos para colher todas as células de medula óssea, e um alto número de DCs foram obtidos após 1 semana de cultura.

As células 1 x 10 7-1,7 x 107 foram extraídas de dois fêmures e foram restequecidas em 24 mL de médio antes de serem plantadas em uma placa de 6 poços (Figura 1A). Após 2 dias, as células não aderentes foram removidas mudando completamente o meio cultural. Antes de mudar o meio, observou-se um número significativo de células suspensas (Figura 1B). Após 3 dias de cultura, pequenas colônias de células começaram a se formar. No sexto dia, o ta...

Aqui, apresentamos um método econômico e eficiente para isolar e gerar células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos após 7 dias de cultura com 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Protocolo Econômico e Eficiente para Isolar e Culturing Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea de camundongos

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Protocolo Econômico e Eficiente de Isolar e Gerar Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea a partir do rato. Os procedimentos envolvendo matérias animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Instituição da Universidade Médica de Nanjing.One.Introdução. Com o aumento da pesquisa de imunidade tumoral, a demanda por células DC está aumentando gradualmente.No entanto, os DCs são raros em todos os tecidos. O método tradicional de induzir principalmente a diferenciação da medula óssea em DCs é complicado e caro. Dois. Isolamento da medula óssea e preparação de células BM Sacrificamos ratos e fixamos na mesa de operação do mouse.Corte a pele dos músculos expostos à esquerda e artéria femoral. Não corte diretamente a artéria femoral. Caso contrário, causará sangramento severo e contaminará o campo de visão.Corte todos os músculos ao redor do fêmur. Estique lentamente os membros inferiores do rato para fora até o prolapso da cabeça femoral e possa ser observado. Separe os membros inferiores do corpo.Corte a perna traseira para obter um fêmur livre e completo. Remova os músculos usando gaze. Não rasgue os músculos diretamente.O fêmur de camundongos é frágil. Coloque o fêmur em 75% de álcool por dois a cinco minutos. Três. Cultura de injeção de BMDC Enxágue o álcool residual com PBS.Aperte a parte média e inferior do fêmur com fórceps hemostáticos, e aperte a extremidade inferior do fêmur com outra fórceps hemostáticos. As fórceps hemostáticas são aplicadas literalmente ao fêmur e o fêmur é quebrado da linha epífise. Use uma seringa ml para perfurar a cavidade da medula óssea da linha epífise.Use duas partes médias completas que lavem a cavidade da medula óssea até que o osso fique branco. Coletar fluidos de descarga. Complementando o meio completo contendo GM CSF/IL-4 a 24ml, e semente em uma placa de 6 poços com 4ml por poço. Quatro.resultados.Após dois dias, substitua todos os meios que contenham GM-CSF/IL-4. Metade substituiu meio completo contendo GM-CSF/IL-4, no quarto e sexto e oitavo dia. O número de células atingiu um pico no sétimo dia e depois diminuiu gradualmente.As células DC formaram um grande número de sinapsis mostrando uma morfologia típica de células DC maduras. Análises submétricas de fluxo mostram que a razão de CD11c impôs o que 71% no sexto dia, aumento da relação ampla para 96,1% no 10º dia. A expressão de CD11c, CD80 e MSC2, aumentou gradualmente com o aumento do tempo de cultivo. Cinco.conclusão.Em suma, estabelecemos um protocolo econômico e eficiente para isolar e gerar células dendríticas derivadas da medula óssea a partir de camundongos, que leva apenas 10 minutos para separar as células da medula óssea. Um alto número de DCs de alta pureza foi colhido após seis a sete dias de cultura com 10ng por ml, GM-CSF e IL-4.

economical-efficient-protocol-for-isolating-culturing-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra o processo de diferenciação mielóide células dendríticas da medula óssea de ratos. Isolamento de rato tíbia e fêmur, e processamento de medula óssea são demonstradas. Fotos demonstrando a morfologia das células antes e depois da diferenciação, e figuras representando fenótipo celular e IL-12 maturação de produção a seguir usando CpG são mostrados.

Cultura de células dendríticas mielóides a partir de precursores da medula óssea

Este vídeo descreve um protocolo para a geração de células dendríticas - células-chave apresentadoras de antígenos que ativam as células T - da medula óssea de um camundongo adulto.

Geração de células dendríticas derivadas da medula óssea: um método para gerar células dendríticas a partir da medula óssea de camundongos

Descreve-se um protocolo para o isolamento e purificação de neutrófilos de medula óssea do rato por centrifugação de gradiente de densidade e de neutrófilos para rotulagem com corantes CellTracker. Isso representa um método simples, rápido, reprodutível e econômica para a obtenção de um grande número de neutrófilos para estudos funcionais a jusante ou de transferência e controle de experimentos adotivos.

Isolamento, purificação e Rotulagem de neutrófilos da medula óssea do rato de Estudos funcionais e Experimentos de transferência adotiva

Aqui apresentamos um protocolo que gera grandes quantidades de monócitos murinos a partir de medula óssea heterogênea para aplicações translacionais. Em comparação com outros, esse novo método ajuda a reduzir o número de animais sacrificados e reduz os custos, evitando métodos caros, como a separação de células magnéticas de alto gradiente (MACS).

Isolamento e injecção intravenosa de Murino de Medula Óssea Derivado monócitos

Subconjuntos distintos de células dendríticas existem como populações raras em órgãos linfóides e, portanto, são difíceis de isolar em número e pureza suficientes para experimentos imunológicos. Aqui descrevemos um método de alta eficiência e alto rendimento para isolamento de todos os principais subconjuntos atualmente conhecidos de células dendríticas esplênicas de camundongos.

Um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas Rato

Derivados de monócitos DC (MoDC) podem sentir pequenas quantidades de moléculas associadas a perigo e facilmente, portanto, estão prontos. Nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de MoDC do sangue, tumores e sua ativação com complexos imunes ao destacar as principais precauções que devem ser consideradas para evitar sua ativação prematura.

Protocolo de isolamento de células dendríticas derivadas de monócitos de rato e sua ativação subsequente em Vitro com Tumor de imunocomplexos

Aqui, apresentamos um protocolo para desenvolver e caracterizar células dendríticas tolerogenic (TolDCs) e avaliar sua utilidade de imunoterapia.

Desenvolvimento e caracterização funcional de células dendríticas Tolerogenic murino

O presente protocolo descreve o isolamento e a cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos.

Isolamento e cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos

Aqui, descrevemos as condições de cultivo in vitro , isolamento e aumento da geração de vesículas extracelulares (EVs) de Echinococcus granulosus. Os pequenos EVs foram caracterizados por espalhamento dinâmico de luz e microscopia eletrônica de transmissão. A captação por células dendríticas derivadas da medula óssea e sua modulação fenotípica foram estudadas por meio de microscopia confocal e citometria de fluxo.

Isolamento e captação de células dendríticas de pequenas vesículas extracelulares de Echinococcus granulosus

Apresentamos nosso protocolo nucleofection high-throughput otimizado como uma forma eficiente de transfecting humanos primários derivados de monócitos com células dendríticas ou DNA plasmídeo ou siRNA sem causar maturação das células. Nós ainda fornecer provas para silenciar siRNA sucesso do gene alvo RIG-I em ambos os mRNA e os níveis de proteína.

Protocolo otimizado para transfecção eficiente de células dendríticas, sem maturação das células

Aprenda a isolar e cultivar células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos com GM-CSF/IL-4 por sete dias. Este protocolo econômico e eficiente produz alta pureza para pesquisas em imunologia tumoral.

Protocolo Econômico e Eficiente para Isolar e Culturing Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea de camundongos

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