Protocolo Econômico e Eficiente para Isolar e Culturing Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea de camundongos
July 1st, 2022
Aqui, apresentamos um método econômico e eficiente para isolar e gerar células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos após 7 dias de cultura com 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.
Protocolo Econômico e Eficiente de Isolar e Gerar Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea a partir do rato. Os procedimentos envolvendo matérias animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Instituição da Universidade Médica de Nanjing.One.Introdução. Com o aumento da pesquisa de imunidade tumoral, a demanda por células DC está aumentando gradualmente.
No entanto, os DCs são raros em todos os tecidos. O método tradicional de induzir principalmente a diferenciação da medula óssea em DCs é complicado e caro. Dois. Isolamento da medula óssea e preparação de células BM Sacrificamos ratos e fixamos na mesa de operação do mouse.
Corte a pele dos músculos expostos à esquerda e artéria femoral. Não corte diretamente a artéria femoral. Caso contrário, causará sangramento severo e contaminará o campo de visão.
Corte todos os músculos ao redor do fêmur. Estique lentamente os membros inferiores do rato para fora até o prolapso da cabeça femoral e possa ser observado. Separe os membros inferiores do corpo.
Corte a perna traseira para obter um fêmur livre e completo. Remova os músculos usando gaze. Não rasgue os músculos diretamente.
O fêmur de camundongos é frágil. Coloque o fêmur em 75% de álcool por dois a cinco minutos. Três. Cultura de injeção de BMDC Enxágue o álcool residual com PBS.
Aperte a parte média e inferior do fêmur com fórceps hemostáticos, e aperte a extremidade inferior do fêmur com outra fórceps hemostáticos. As fórceps hemostáticas são aplicadas literalmente ao fêmur e o fêmur é quebrado da linha epífise. Use uma seringa ml para perfurar a cavidade da medula óssea da linha epífise.
Use duas partes médias completas que lavem a cavidade da medula óssea até que o osso fique branco. Coletar fluidos de descarga. Complementando o meio completo contendo GM CSF/IL-4 a 24ml, e semente em uma placa de 6 poços com 4ml por poço. Quatro.resultados.
Após dois dias, substitua todos os meios que contenham GM-CSF/IL-4. Metade substituiu meio completo contendo GM-CSF/IL-4, no quarto e sexto e oitavo dia. O número de células atingiu um pico no sétimo dia e depois diminuiu gradualmente.
As células DC formaram um grande número de sinapsis mostrando uma morfologia típica de células DC maduras. Análises submétricas de fluxo mostram que a razão de CD11c impôs o que 71% no sexto dia, aumento da relação ampla para 96,1% no 10º dia. A expressão de CD11c, CD80 e MSC2, aumentou gradualmente com o aumento do tempo de cultivo. Cinco.conclusão.
Em suma, estabelecemos um protocolo econômico e eficiente para isolar e gerar células dendríticas derivadas da medula óssea a partir de camundongos, que leva apenas 10 minutos para separar as células da medula óssea. Um alto número de DCs de alta pureza foi colhido após seis a sete dias de cultura com 10ng por ml, GM-CSF e IL-4.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método econômico e eficiente para isolar e gerar células dendríticas derivadas da medula óssea de ratos com alta pureza. O protocolo envolve uma cultura de 7 dias com GM-CSF/IL-4.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Imunologia
- Biologia Celular
Fundo
- As células dendríticas (CDs) são cruciais para a pesquisa de imunidade contra tumores.
- As CDs são raras nos tecidos, tornando seu isolamento desafiador.
- Métodos tradicionais para diferenciação de CD são complexos e caros.
- Este estudo visa simplificar o processo de geração de CDs a partir da medula óssea.
Propósito do Estudo
- Desenvolver um método econômico para isolar CDs.
- Melhorar a eficiência da geração de CD a partir da medula óssea de ratos.
- Apoiar pesquisas em imunidade contra tumores fornecendo CDs de alta pureza.
Métodos Utilizados
- Isolamento de medula óssea de ratos.
- Cultura de células da medula óssea com GM-CSF/IL-4.
- Avaliação da pureza e viabilidade celular.
- Aprovação do Comitê de Ética Animal Institucional.
Principais Resultados
- Isolamento bem-sucedido de CDs derivadas da medula óssea com alta pureza.
- Eficiência demonstrada do novo protocolo.
- Potencial para aplicação mais ampla na pesquisa de imunidade contra tumores.
- Redução no tempo e custo em comparação com métodos tradicionais.
Conclusões
- O método desenvolvido é uma alternativa viável para geração de CD.
- Esta abordagem pode facilitar pesquisas adicionais em imunologia.
- Estudos futuros podem explorar aplicações em vários contextos terapêuticos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This protocol addresses the bottleneck in dendritic cell supply for immunology and tumor immunity research by providing an economical, high-yield method for isolating bone marrow-derived dendritic cells from mice. It enables scalable generation of phenotypically characterized DCs with reduced reagent consumption and hands-on time, supporting early-stage target validation and mechanistic studies in immunotherapy pipelines. The approach improves predictive confidence in preclinical models by delivering a reproducible, disease-relevant system for evaluating immune modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of dendritic cell function in antigen presentation and T-cell activation pathways.
- Operational Value: Reduces cost and complexity of DC generation using standardized GM-CSF/IL-4 differentiation.
- Scientific Value: Supports functional target validation through phenotypic characterization of CD11c, CD80, and MHC II expression over time.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces high-purity dendritic cell populations (80%-95% CD11c+) suitable for standardized immune assays.
- Operational Value: Yields up to 2.7 x 107 cells per mouse, enabling high-throughput screening formats.
- Scientific Value: Provides a consistent biological system for assessing compound effects on dendritic cell maturation and immune function.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Generates a disease-relevant system for modeling dendritic cell responses in tumor immunity contexts.
- Operational Value: Supports preclinical evaluation of immunomodulatory agents with defined cellular inputs.
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking dendritic cell phenotype to functional outcomes in co-culture systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, providing a renewable source of dendritic cells for immune-focused assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on dendritic cell-dependent immune pathways and target engagement.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cellular outputs for assessing immunomodulatory activity.
- Analytics: Enables flow cytometry-based measurement of CD11c, CD80, and MHC II as maturation readouts.
- Translational Research: Connects in vitro dendritic cell generation to preclinical models of immune activation and tolerance.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol for dendritic cell production across immunology projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through phenotypically defined dendritic cell inputs.
- Operational Value: Reduces time and cost via 10-minute bone marrow harvest and low cytokine dosing (10 ng/mL GM-CSF/IL-4).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable dendritic cell models for immunotherapy screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates using standardized immune effector cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine bone marrow isolation and aseptic cell culture techniques.
- Depends on access to 6-well plates, hemolytic forceps, and flow cytometry for phenotypic validation.
- Necessitates standardization of cytokine concentration and medium exchange schedule across users.
- Involves adaptation considerations when translating to other mouse strains or genetic backgrounds.
- Limited by the 7–10 day culture window and associated decline in cell viability post-peak.
