Protocolo Econômico e Eficiente para Isolar e Culturing Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea de camundongos
1 de julho de 2022
Aqui, apresentamos um método econômico e eficiente para isolar e gerar células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos após 7 dias de cultura com 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.
Protocolo Econômico e Eficiente de Isolar e Gerar Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea a partir do rato. Os procedimentos envolvendo matérias animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Instituição da Universidade Médica de Nanjing.One.Introdução. Com o aumento da pesquisa de imunidade tumoral, a demanda por células DC está aumentando gradualmente.
No entanto, os DCs são raros em todos os tecidos. O método tradicional de induzir principalmente a diferenciação da medula óssea em DCs é complicado e caro. Dois. Isolamento da medula óssea e preparação de células BM Sacrificamos ratos e fixamos na mesa de operação do mouse.
Corte a pele dos músculos expostos à esquerda e artéria femoral. Não corte diretamente a artéria femoral. Caso contrário, causará sangramento severo e contaminará o campo de visão.
Corte todos os músculos ao redor do fêmur. Estique lentamente os membros inferiores do rato para fora até o prolapso da cabeça femoral e possa ser observado. Separe os membros inferiores do corpo.
Corte a perna traseira para obter um fêmur livre e completo. Remova os músculos usando gaze. Não rasgue os músculos diretamente.
O fêmur de camundongos é frágil. Coloque o fêmur em 75% de álcool por dois a cinco minutos. Três. Cultura de injeção de BMDC Enxágue o álcool residual com PBS.
Aperte a parte média e inferior do fêmur com fórceps hemostáticos, e aperte a extremidade inferior do fêmur com outra fórceps hemostáticos. As fórceps hemostáticas são aplicadas literalmente ao fêmur e o fêmur é quebrado da linha epífise. Use uma seringa ml para perfurar a cavidade da medula óssea da linha epífise.
Use duas partes médias completas que lavem a cavidade da medula óssea até que o osso fique branco. Coletar fluidos de descarga. Complementando o meio completo contendo GM CSF/IL-4 a 24ml, e semente em uma placa de 6 poços com 4ml por poço. Quatro.resultados.
Após dois dias, substitua todos os meios que contenham GM-CSF/IL-4. Metade substituiu meio completo contendo GM-CSF/IL-4, no quarto e sexto e oitavo dia. O número de células atingiu um pico no sétimo dia e depois diminuiu gradualmente.
As células DC formaram um grande número de sinapsis mostrando uma morfologia típica de células DC maduras. Análises submétricas de fluxo mostram que a razão de CD11c impôs o que 71% no sexto dia, aumento da relação ampla para 96,1% no 10º dia. A expressão de CD11c, CD80 e MSC2, aumentou gradualmente com o aumento do tempo de cultivo. Cinco.conclusão.
Em suma, estabelecemos um protocolo econômico e eficiente para isolar e gerar células dendríticas derivadas da medula óssea a partir de camundongos, que leva apenas 10 minutos para separar as células da medula óssea. Um alto número de DCs de alta pureza foi colhido após seis a sete dias de cultura com 10ng por ml, GM-CSF e IL-4.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método econômico e eficiente para o isolamento e a geração de células dendríticas derivadas da medula óssea com alta pureza a partir de camundongos. O protocolo envolve um cultivo de 7 dias com GM-CSF/IL-4.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Imunologia
- Biologia Celular
Contexto
- As células dendríticas (DCs) são cruciais para a pesquisa de imunidade tumoral.
- As DCs são raras nos tecidos, o que torna seu isolamento desafiador.
- Os métodos tradicionais de diferenciação de DCs são complexos e onerosos.
- Este estudo tem como objetivo simplificar o processo de geração de DCs a partir da medula óssea.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método econômico para o isolamento de DCs.
- Melhorar a eficiência da geração de DCs a partir da medula óssea de camundongo.
- Apoiar a pesquisa em imunidade tumoral fornecendo DCs de alta pureza.
Métodos Utilizados
- Isolamento da medula óssea de camundongos.
- Cultivo de células da medula óssea com GM-CSF/IL-4.
- Avaliação da pureza e viabilidade celular.
- Aprovação do Comitê Institucional de Ética em Experimentação Animal.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de DCs derivadas da medula óssea com alta pureza.
- Eficiência comprovada do novo protocolo.
- Potencial para aplicação mais ampla na pesquisa de imunidade tumoral.
- Redução de tempo e custo em comparação com métodos tradicionais.
Conclusões
- O método desenvolvido é uma alternativa viável para a geração de CC.
- Essa abordagem pode facilitar pesquisas futuras em imunologia.
- Estudos futuros podem explorar aplicações em diversos contextos terapêuticos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo aborda o gargalo no fornecimento de células dendríticas para pesquisas em imunologia e imunidade tumoral, fornecendo um método econômico e de alto rendimento para o isolamento de células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos. Ele permite a geração escalonável de DCs fenotipicamente caracterizadas com redução no consumo de reagentes e no tempo de manipulação, apoiando a validação precoce de alvos e estudos mecanicistas em pipelines de imunoterapia. A abordagem melhora a confiabilidade preditiva em modelos pré-clínicos ao fornecer um sistema reprodutível e relevante para a avaliação da modulação imune.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar a função das células dendríticas na apresentação de antígenos e nas vias de ativação de linfócitos T.
- Valor Operacional: Reduz o custo e a complexidade da geração de CD por meio da diferenciação padronizada com GM-CSF/IL-4.
- Valor Científico: Apoia a validação funcional de alvos por meio da caracterização fenotípica da expressão de CD11c, CD80 e MHC II ao longo do tempo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz populações de células dendríticas de alta pureza (80%-95% CD11c+) adequadas para ensaios imunológicos padronizados.
- Valor Operacional: Gera até 2,7 x 107 células por camundongo, permitindo formatos de triagem de alto rendimento.
- Valor Científico: Fornece um sistema biológico consistente para avaliar os efeitos de compostos na maturação de células dendríticas e na função imunológica.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Gera um sistema relevante para a doença, permitindo modelar respostas de células dendríticas em contextos de imunidade tumoral.
- Valor Operacional: Permite a avaliação pré-clínica de agentes imunomoduladores com entradas celulares definidas.
- Valor Científico: Facilita a desmistificação mecanicista ao relacionar o fenótipo da célula dendrítica com resultados funcionais em sistemas de co-cultura.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores e avaliação pré-clínica, fornecendo uma fonte renovável de células dendríticas para ensaios com foco imunológico.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre vias imunológicas dependentes de células dendríticas e o engajamento de alvos.
- Triagem: Fornece resultados celulares quantitativos e reprodutíveis para avaliar a atividade imunomoduladora.
- Análises: Permite a medição baseada em citometria de fluxo de CD11c, CD80 e MHC II como indicadores de maturação.
- Pesquisa Translacional: Conecta a geração de células dendríticas in vitro a modelos pré-clínicos de ativação e tolerância imunológica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um protocolo padronizado e escalável para a produção de células dendríticas em projetos de imunologia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos por meio de entradas fenotipicamente definidas de células dendríticas.
- Valor Operacional: Reduz tempo e custo por meio da colheita de medula óssea em 10 minutos e baixa dosagem de citocinas (10 ng/mL GM-CSF/IL-4).
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não prosseguir ao fornecer modelos confiáveis de células dendríticas para triagem em imunoterapia.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos imunomoduladores utilizando células efetoras imunes padronizadas.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em isolamento de medula óssea murina e técnicas de cultura celular assépticas.
- Depende do acesso a placas de 6 poços, pinças hemostáticas e citometria de fluxo para validação fenotípica.
- Necessita padronização da concentração de citocinas e do cronograma de troca de meio entre diferentes usuários.
- Envolve considerações de adaptação ao ser traduzido para outras linhagens ou fundos genéticos de camundongos.
- Limitado pela janela de cultura de 7–10 dias e pelo declínio associado na viabilidade celular após o pico.
